2. SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT
2.3 Sàng lọc đột biến Cd41/42 trên mẫu thalassemia bằng ARMS-PCR
Sử dụng thành phần và điều kiện tối ƣu cho phản ứng ARMS-PCR đã đƣợc trình bày trên Bảng 2.8, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen đồng hợp hay dị hợp của 70 mẫu có đột biến Cd 41/42. Kết quả sàng lọc đột biến Cd 41/42 đƣợc thể hiện trên Hình 3.5 và Phụ lục 3 cho thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện băng nội chuẩn 700 bp và băng đột biến 405 bp. Các mẫu đột biến dị hợp lên băng kích thƣớc 355 bp với mồi bình thƣờng. Các mẫu đột biến đồng hợp không lên băng với mồi bình thƣờng. Chúng tôi phát hiện đƣợc trong 70 mẫu có đột biến Cd 41/42, có 7 mẫu (10%) là đột biến đồng hợp, 63 mẫu (90%) là đột biến dị hợp.
45
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc đột biến Cd 41/42 bằng kỹ thuật ARMS-PCR.
Giếng (-): đối chứng âm (không có ADN khuôn); Giếng M: sản phẩm với cặp mồi đột biến; Giếng N: sản phẩm với cặp mồi bình thƣờng; T91-T114: khuôn là mẫu bệnh phẩm T91-T114; L: thang chuẩn ADN 100 bp.
Tổng hợp các kết quả sàng lọc các đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 trên 288 mẫu bệnh phẩm thalassemia đƣợc trình bày ở Bảng 3.3 và Bảng 3.4.
Bảng 3.3. Tỉ lệ các đột biến trên 288 mẫu bệnh phẩm
Đột biến Cd 17 Cd 26 Cd 41/42
46
Số mẫu không bị đột biến n (%) 231 (80,21%) 197 (68,40%) 218 (75,69%) Tổng 288 288 288 Số mẫu đồng hợp n (%) 3 (5,26%) 1 (1,10%) 7 (10,0%) Số mẫu dị hợp n (%) 54 (94,34%) 90 (98,90%) 63 (90,0%) Tổng 57 91 70
Bảng 3.4. Tỉ lệ các đột biến kép trên 288 mẫu bệnh phẩm Đột biến Cd 17 và Cd 41/42 Cd 41/42 và Cd 26 Cd 17 và Cd 26 Số mẫu có 2 đột biến n (%) 5 (1,74%) 29 (10,07%) 22 (7,64%) Số mẫu không có 2 đột biến
n (%) 283 (98,26%) 259 (89,93%) 266 (92,36%) Tổng 288 288 288
Nhƣ vậy, trong ba đột biến đƣợc kiểm tra, đột biến Cd 26 chiếm tỉ lệ cao nhất (31,60%). Các đột biến Cd 17 và Cd 41/42 chiếm tỉ lệ thấp hơn, lần lƣợt là 19,79% và 24,31%. Có 5 mẫu (1,74%) có đột biến kép Cd 17 và Cd 41/42; 29 mẫu (10,07%) có đột biến kép Cd 41/42 và Cd 26; 22 mẫu (7,64%) có đột biến kép Cd 17 và Cd 26.
Những mẫu có kiểu gen là đồng hợp Cd 17, Cd 41/42 hoặc dị hợp tử kép với hai đột biến này sẽ dẫn tới kiểu hình β-thalassemia thể nặng. Những mẫu có kiểu gen là đồng hợp Cd 26 tạo thể HbE chỉ gây ra thiếu máu nhẹ, ít khi có chỉ định truyền máu nhiều lần [70]. Tuy nhiên, những mẫu có đột biến Cd 17 hoặc Cd 41/42 kết hợp với đột biến Cd 26 có thể dấn tới kiểu hình β- thalassemia thể nặng [70]. Do đó, với những trƣờng hợp bệnh này cần đƣợc chẩn đoán một cách chính xác.
47
Từ tỉ lệ các đột biến, chúng tôi tiến hành so sánh kết quả với các nghiên cứu về các loại đột biến β-thalassemia tại Việt Nam. Năm 2000, Filon công bố kiểu gen β-thalassemia của 23 bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Trung Ƣơng cho tỉ lệ đột biến Cd 17 là 30%, Cd 41/42 là 22% và Cd 26 là 37% [21]. Một nghiên cứu của Svasti năm 2002 trên 50 bệnh nhân β-thalassemia cũng cho tỉ lệ cao các loại đột biến này. Cụ thể, tỉ lệ đột biến Cd 17 là 25%, đột biến Cd 41/42 là 35,3%, đột biến Cd 26 là 31% [57]. Nghiên cứu của Lý Thị Thanh Hà năm 2008 chẩn đoán trƣớc và sau sinh tại bệnh viện Nhi Trung ƣơng cho thấy, đột biến Cd 17 có tỉ lệ cao nhất là 41,6%, tiếp sau đó tỉ lệ các đột biến Cd 41/42 là 34,7% và Cd 26 là 12,5% [1]. Nhƣ vậy, tỉ lệ các đột biến chúng tôi thu đƣợc tƣơng đồng với các kết quả đã công bố trƣớc đây tại Việt Nam (Bảng 3.5).
Bảng 3.5. Tỉ lệ các loại đột biến β-thalassemia ở ngƣời Việt Nam [1,21,57]
Đột biến Nghiên cứu Filon 2000 (%) Svasti 2002 (%) Hà 2008 (%)
Nghiên cứu này 2016 (%) Cd 17 (A→T) 30 25,0 41,6 19,79 Cd 26 (G→A) 37 31 12,5 31,60 Cd 41/42 (- TCTT) 22 35,3 34,7 24,31
3. SO SÁNH KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI VỚI KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN SINH HÓA
Bổ sung thêm kết quả của 58 mẫu bệnh phẩm đã đƣợc sàng lọc bằng kỹ thuật PCR đa mồi tại Phòng thí nghiệm Sinh Y [4], chúng tôi tiến hành phân tích kết quả sàng lọc đột biến trên 346 mẫu bệnh phẩm dựa trên các chỉ số sinh hóa đƣợc cung cấp bởi Viện Huyết học – Truyền máu Trung ƣơng.
48