Phát hiện các đột biến trên gen beta globin bằng kỹ thuật ARMS PCR và lai điểm ngược (REVERSE DOT BLOT)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Thu Hà PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Thu Hà PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan Cô ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, dạy giúp đỡ em tận tình suốt q trình học tập làm việc Cơ khơng truyền đạt cho em kiến thức mà dạy cho em cách giải vấn đề, cách bố trí thí nghiệm hiệu quả, tác phong làm việc khoa học Cơ cịn quan tâm, giúp đỡ em giải khó khăn sống Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tạ Bích Thuận Cơ ln động viên, quan tâm, dẫn em tận tình suốt q trình thực đề tài Cơ ln khích lệ em nhiều lúc em gặp khó khăn, giúp em có thêm động lực để hồn thành luận văn Em xin cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức khoa học, tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Anh Thùy Dƣơng, ThS Ngơ Thị Hà, bạn em thuộc Phịng thuộc phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ nhiệt tình chia sẻ khó khăn suốt q trình em thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2017 Lê Thị Thu Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TổNG QUAN .2 1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA 1.1.1 Tình hình mắc bệnh giới Việt Nam 1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin .3 1.1.3 Các đột biến gen β-globin gây bệnh β-thalassemia 1.1.4 Đặc điểm kiểu hình bệnh β-thalassemia 1.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 10 1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM - PCR) 13 1.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật ARMS-PCR 13 1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR .14 1.2.3 Ƣu điểm nhƣợc điểm kỹ thuật ARMS-PCR .16 1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR chẩn đoán bệnh β-thalassemia 16 1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) 17 1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic .17 1.3.2 Đầu dò kỹ thuật lai điểm ngƣợc 18 1.3.3 Màng sử dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc .20 1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngƣợc chẩn đoán bệnh β-thalassemia .21 Chƣơng 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Trình tự đầu dò oligo sử dụng nghiên cứu .25 2.1.4 Trình tự mồi 26 2.1.5 Thiết bị 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 28 2.2.2 Tách ADN tổng số 29 2.2.3 Phƣơng pháp PCR 29 2.2.4 Phƣơng pháp ARMS-PCR 31 2.2.5 Phƣơng pháp điện di .33 2.2.6 Quá trình lai điểm ngƣợc 34 2.2.7 Phƣơng pháp tách dòng 35 Chƣơng 3- KẾT QUẢ 38 KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI 39 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR .42 2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 mẫu thalassemia ARMS-PCR 42 2.2 Sàng lọc đột biến Cd 26 mẫu thalassemia ARMS-PCR 43 2.3 Sàng lọc đột biến Cd 41/42 mẫu thalassemia ARMS-PCR44 SO SÁNH KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI VỚI KẾT QUẢ CHẨN ĐỐN SINH HĨA 47 3.1 Đặc điểm Hb đột biến nghiên cứu 48 3.2 Giá trị HbE mẫu có đột biến Cd 26 52 3.3 So sánh kết chẩn đốn sinh hóa với kết phân tích PCR đa mồi 53 KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở NHÓM NGƢỜI BÌNH THƢỜNG 55 BIẾN NẠP, TÁCH DỊNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN βGLOBIN .58 5.1 Biến nạp, tách dòng 58 5.2 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17 61 5.3 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 26 62 5.4 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 41/42 64 5.5 Giải trình tự đoạn gen β-globin khơng có đột biến 66 LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) 67 6.1 Đánh dấu trình tự đích cho q trình lai điểm ngƣợc 67 6.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc .68 6.3 Kết lai số mẫu bệnh phẩm 73 KẾT LUẬN 76 KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO .77 KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT (-) Âm tính (+) Dƣơng tính 3‟UTR 3‟ Untranslated Region (Vùng 3‟ không dịch mã) 5‟UTR 5‟ Untranslated Region (Vùng 5‟ không dịch mã) ADN Acid deoxyribonucleic ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System-PCR ARN Acid ribonucleic BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate- BCIP bp base pair Cd Codon DCIP Dichlorophenol Indophenol dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate EDC 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride H2O Nƣớc Hb Hemoglobin huyết sắc tố HbA Adult hemoglobin HbA2 Adult hemoglobin HbE Hemoglobin E HbF Fetal hemoglobin HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) HPV Human papillomavirus IVS Intervening sequence (Intron) LB Luria Bertani MCH mean corpuscular hemoglobin (Lƣợng hemoglobin trung bình hồng cầu) MCV mean corpuscular volume (Thể tích trung bình hồng cầu) NBT nitro-blue-tetrazalium SA-AP Streptavidine alkaline phosphatase SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Saline Sodium Citrate TBE Đệm Tris - Borate - EDTA TBE Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) WHO World Health Organisation (Tổ chức Y tế Thế giới) α alpha β beta γ Gama δ Delta DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Cụm gen β-globin (A) cấu trúc gen β-globin (B) Các đột biến gen β-globin gây bệnh β-thalassemia Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát đột biến điểm Cấu trúc oligonucleotide amino-linkers spacer arm Cơ chế phát màu trình lai điểm ngƣợc Sơ đồ minh họa vị trí mồi sử dụng nghiên cứu Sơ đồ thí nghiệm phát đột biến gen β- T271 Phạm Thị Tuyến Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T272 Trần Thị Ngân T273 Trần Diệu Linh T274 Nguyễn Thiện Dũng T276 Dƣơng Thị Thi T277 Cẩm Thị Thu Hà T278 T279 T280 Nguyễn Mạnh Quyền Ma Cơng Hồng Đinh Cơng Nhân Kí Họ Tên hiệu T281 Đồn Thái An T282 Nguyễn Thị Phƣơng Dunfg T283 Nguyễn Văn Thạch T284 T285 Nguyễn Thị Thao Trần Văn Chuẩn Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T286 Nguyễn Thị Nga T287 Nguyễn Văn Quản T288 Đoàn Hải Phong T289 T290 T291 T292 T293 T294 T295 T296 Hà Lê Kiều Trinh Bùi Thanh Huyền Hoàng Thị Thanh Phạm Văn Thịnh Lị Thị Thìn Nguyễn Văn Nghĩa Đặng Xuân Hiếu Trƣơng Công Hoan T297 Đặng Thị Hiền T298 T299 T300 T301 T302 Nguyễn Việt Phƣơng Lê Quyết Tiến Đào Thị Minh Trần Thị Thu Phƣơng Lƣơng Phƣơng Nam T303 Đỗ Thị Loan Kí Họ Tên hiệu Luận văn thạc sĩ T304 T307 T308 T309 T310 T311 T312 T313 T314 T315 T316 T317 T318 T319 T320 T321 T322 T323 T324 T325 T326 T327 Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm Vũ Thị Tiến Đỗ Thị Châu Loan Trƣơng Thị Bạch Mai Hoàng Hải Hà Trần Tuấn Hƣng Hứa Minh Hiệp Mai Xuân Thịnh Đặng Thái An Giáp Thị Lý Nguyễn Thị Chinh Lò Sơn Quỳnh Đặng Minh Đức Đinh Thị Hƣơng Đỗ Mạnh Hùng Nguyễn Thị Thanh Thủy Đỗ Ngọc Khanh Nguyễn Tuấn Anh Nguyễn Quang Vinh Quan Văn Trƣờng Quan Trung Thái Vũ Văn Trƣờng Lê Thị Cẩm Tú Hb Hb A1 F Luận văn thạc sĩ T328 Kí Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm Vũ Văn Bẩy Họ Tên hiệu T329 Trần Ngọc Đông T330 T331 Trịnh Thị Thúy Lê Lan Dƣơng T332 Mai Thị Minh Trang T333 T334 T335 T336 T337 T338 T339 T340 T341 T342 T343 T344 T345 Hoàng Thị Hiền Lê Thị Hà Trang Hoàng Nhật Tam Thiệu Việt Hoàng Đinh Hoàng Tú Ngân Nguyễn Thiị Miến Nơng Thị Dƣơng Trần Thảo Nhi Hồng Thị Hiền Ma Truongf Giang Nguyễn Mai Liên Phùng Thị Tiến Hoàng Hồng Cảnh T346 Chu Văn Đức Luận văn thạc sĩ T348 T349 T350 T351 T352 Kí Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Tƣơi Bùi Tuyết Mai Đào Văn Có Hồng Thị Út Trần Thị Quỳnh Chi Họ Tên hiệu T353 T354 T355 T356 T357 T358 T359 T360 T361 T362 T363 T364 T365 T366 T367 T368 Hứa Văn Tú Riêu Thị Thùy Dung Triệu Hoàng Ánh Tuyết Nguyễn Thị Đông Mai Khánh Ly Trần Mạnh Cƣờng Trần Phƣơng Thảo Nguyễn Minh Ngọc Nguyễn Khánh Ly Lê Anh Dũng Lê Anh Duy Phạm Thị Tình Vy Thị Lý Trần Mạnh Cƣờng Nguyễn Tuyết Nhung Hoàng Thị Hƣơng Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T369 T370 T371 T372 T373 T374 Trần Văn Quân Khoáng Thanh Việt Cẩm Thị Phƣơng Vân Bùi Thị Hằng Nga Hoàng Nguyễn Thị Thu T375 Nguyễn Anh Thƣ Kí Phƣơng Họ Tên hiệu T378 T379 T380 T381 T382 T383 T384 T385 T386 Phạm Thành Phong Hoàng Thị Hƣơng Mơ Thăng Quang Sáu Phạm Nguyễn Thùy Linh Nguyễn Thị Thanh Hiền Lê Thị Quyên Vũ Thị Linh Nguyễn Mạnh Cƣờng Hoàng Xuân Trƣờng T387 Sầm Thị Tâm T388 Lê Quang Dƣơng Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T389 T390 T391 T392 T393 T394 T395 Phạm Vi Anh Nguyễn Thị Tuyết Hà Văn Lâm Phùng Quỳnh Mai Đinh Thị Thu Hà Đinh Thị Hƣơng Phạm Thị Vân Anh T396 Nguyễn Thị Hợi T397 Dƣơng Thị Thảo T398 T399 T400 Vũ Mạnh Hiếu Dđào Thị Kiều Chinh Nguyễn Văn Lĩnh Kí Họ Tên hiệu T401 T402 Nguyễn Hoàng Thắng Đào Quang Vinh T403 Nguyễn Thị Hòa T404 Lê Minh Việt Trung Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T405 Lê Thị Hồng Sơn T406 Phạm Khánh Chi T407 Nguyễn Văn Long T408 Nguyễn Phan Sơn 119 ... LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β -GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI 39 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β -GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS- PCR .42 2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 mẫu thalassemia ARMS- PCR. .. ? ?Phát đột biến gen beta globin kỹ thuật ARMS- PCR lai điểm ngƣợc (reverse dot blot)? ?? với nội dung nghiên cứu: (1) xây dựng đƣợc kỹ thuật ARMS- PCR để sàng lọc số đột biến phổ biến gen ? ?globin Việt... nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm gây tốn thời gian bƣớc lai rửa cần riêng biệt đột biến Do đó, kỹ thuật lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) đƣợc phát triển cho phép phát đƣợc đồng thời nhiều đột biến