Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Dị ứng Miễn dịch Mã số: 62.72.01.09 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN ĐẶNG DŨNG TS TRỊNH THANH HÙNG NĂM 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án riêng có phần số liệu đề tài (Nghị định thư) có tên: “Hợp tác nghiên cứu chế tạo test chẩn đoán rắn hổ mang cắn” Kết đề tài thành nghiên cứu tập thể mà thành viên Tôi chủ nhiệm đề tài toàn thành viên nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệu đề tài vào luận án để bảo vệ lấy tiến sĩ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Tuấn MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tai nạn rắn cắn chẩn đoán rắn độc cắn Việt nam 1.1.1 Tai nạn rắn cắn Việt nam 1.1.2 Chẩn đoán rắn độc cắn Việt Nam 1.2 Rắn hổ mang Naja atra 1.2.1 Đặc điểm sinh học nọc độc 1.2.2 Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn 1.3 Một số kỹ thuật miễn dịch phát nọc rắn kháng thể kháng nọc rắn 12 1.3.1 Điện di miễn dịch 13 1.3.2 Ngưng kết hồng cầu 13 1.3.3 Ngưng kết miễn dịch 14 1.3.4 Miễn dịch phóng xạ 15 1.3.5 Miễn dịch huỳnh quang 16 1.3.6 Miễn dịch quang 16 1.3.7 Miễn dịch gắn enzym 17 1.3.8 Kít phát nhanh 18 1.4 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 19 1.4.1 Lịch sử hình thành phát triển 19 1.4.2 Nguyên lý hoạt động 21 1.4.3 Chế tạo tối ưu que thử 23 1.5 Kháng thể kháng nọc rắn 26 1.5.1 Công nghệ chế tạo kháng thể IgG kháng nọc rắn 26 1.5.2 Công nghệ chế tạo kháng thể IgY kháng nọc rắn 30 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 33 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Thu thập kiểm định chất lượng nọc rắn 36 2.2.2 Chuẩn bị kháng nguyên gây miễn dịch 37 2.2.3 Phát kháng thể kháng nọc rắn huyết 39 2.2.4 Tách chiết tinh kháng thể 40 2.2.5 Kiểm tra độ đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên nọc rắn 45 2.2.6 Hấp phụ miễn dịch 45 2.2.7 Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể 46 2.2.8 Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp 49 2.2.9 Tối ưu hóa xét nghiệm nhanh 50 2.2.10 Xác định thông số kỹ thuật xét nghiệm 55 2.2.11 Thử nghiệm kít phát nhanh nọc rắn mẫu bệnh phẩm 55 2.3 Xử lý số liệu 56 2.4 Đạo đức nghiên cứu 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 57 3.1 Kết nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ gà 57 3.1.1 Kết kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 57 3.1.2 Biến động hiệu giá kháng thể trình gây miễn dịch 58 3.1.3 Kết xác định hiệu giá kháng thể huyết kháng nọc rắn 60 3.1.4 Phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc rắn loài khác 61 3.2 Kết tách chiết tinh kháng thể IgG IgY từ huyết trứng gà 62 3.2.1 Sắc ký đồ tinh kháng thể 62 3.2.2 Kết điện di kháng thể IgG IgY sau tách chiết tinh 63 3.2.3 Hoạt tính kháng thể IgG IgY sau tách chiết tinh 64 3.3 Phản ứng đặc hiệu phản ứng chéo kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất hổ chúa 65 3.3.1 Kiểm tra phản ứng đặc hiệu phản ứng chéo kháng thể kỹ thuật Western blot 65 3.3.2 Hoạt tính phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch 66 3.4 Kết lựa chọn cặp kháng thể 68 3.4.1 Kết lựa chọn cặp kháng thể phương pháp ELISA 68 3.4.2 Kết lựa chọn cặp kháng thể phương pháp nhúng trực tiếp 69 3.5 Kết cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 70 3.5.1 Tối ưu hóa nồng độ kháng thể pH dung dịch hạt nano vàng 70 3.5.2 Kết cộng hợp hoạt tính kháng thể sau cộng hợp với hạt nano vàng 71 3.6 Kết tối ưu xét nghiệm phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 72 3.6.1 Hệ đệm 72 3.6.2 Nồng độ kháng thể vạch phát 73 3.6.3 Nồng độ kháng thể vạch chứng 74 3.6.4 Nồng độ kháng thể cộng hợp 74 3.7 Kết xác định thông số kỹ thuật xét nghiệm phát nhanh 75 3.7.1 Giới hạn phát 75 3.7.2 Phản ứng chéo 76 3.7.3 Độ ổn định kít xét nghiệm phát nhanh 76 3.7.4 Bộ kít xét nghiệm phát nhanh nọc rắn hổ mang 77 3.8 Đánh giá khả phát nọc rắn hổ mang kít lâm sàng 77 3.8.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 77 3.8.2 Kết định lượng phát nọc rắn hổ mang lâm sàng 78 CHƯƠNG BÀN LUẬN 85 4.1 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ gà 85 4.1.1 Kiểm định chất lượng nọc rắn hổ mang Naja atra 85 4.1.2 Lựa chọn loài gây miễn dịch 86 4.1.3 Tạo kháng nguyên quy trình gây miễn dịch 87 4.1.4 Phản ứng đặc hiệu phản ứng chéo kháng thể với kháng nguyên nọc rắn 88 4.1.5 Tách chiết tinh kháng thể IgG IgY từ huyết trứng gà 89 4.2 Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 91 4.3 Tối ưu hóa kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 93 4.3.1 Lựa chọn nguyên liệu cho kít 93 4.3.2 Tối ưu hóa quy trình cộng hợp 94 4.3.3 Tối ưu hóa hệ đệm hóa chất xử lý màng 96 4.3.4 Tối ưu hóa nồng độ kháng thể 97 4.4 Thử nghiệm kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra in vitro 99 4.5 Đánh giá khả phát nọc rắn hổ mang lâm sàng 102 4.5.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 102 4.5.2 Thử nghiệm khả phát nọc rắn hổ mang mẫu lâm sàng 103 KẾT LUẬN 109 KIẾN NGHỊ 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO 112 PHỤ LỤC 126 DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT Phần viết đầy đủ TT Phần viết tắt BSA Bovine Serum Albumin (Albumine huyết bò) CFA Completed Freund's Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh) CNBr Cyanogen Bromide ECVAM European Centre for the Validation of Alternative Methods EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide ECL Enhanced chemiluminescence ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym) HRP Horseradish Peroxidase HTKNR Huyết kháng nọc rắn 10 ICA Immunochromatographic assay (Sắc ký miễn dịch) 11 IFA Incompleted Freund's Adjuvant (Tá chất Freund không hoàn chỉnh) 12 IgG Immunoglobulin G (Kháng thể lớp IgG) 13 IgY Yolk Immunoglobulin (Kháng thể IgY) 14 KN Kháng nguyên 15 KT Kháng thể 16 KTKNR Kháng thể kháng nọc rắn 17 LD50 Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) 18 LFIA Lateral flow Immunoassay (Miễn dịch dòng chảy bên) 19 NC Nitrocellulose (Màng Nitrocellulose) 20 OIA Optical immunoassay (Miễn dịch quang) 21 OPD O – phenylene diamine (Cơ chất) 22 PBS Phosphat Buffer Salin (Dung dịch đệm phosphat) 23 PEG Polyethylene Glycol 24 PVA Polyvinyl Alcohol 25 PVDF Polyvinylidene Fluoride (Màng PVDF) 26 PVP Polyvinyl Pyrrolidone 27 RIA Radioimmunoassay (Miễn dịch phóng xạ) 28 TBS Tris-Buffered Saline 29 TBS-T Tris-Buffered Saline + Tween 20 30 TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine 31 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Electrophoresis 32 WHO World health oganization (Tổ chức y tế giới) Gel 122 quantitative immunoelectrophoresis”, Journal of Immunological Methods, 49, pp 141-150 91 Ryu Y., Jin Z., Kang M S., et al (2011), “Increase in the detection sensitivity of a lateral flow assay for a cardiac marker by oriented immobilization of antibody”, BioChip Journal, 5(3), pp 193-198 92 Sajid M., Kawde A N., Daud M (2014), “Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review”, Journal of Saudi Chemical Society 93 Schade R., Staak C., Hendriksen C., et al (1996), “The production of avian (egg yolk) antibodies: IgY”, Alta-nottingham, 24, pp 925-934 94 Sells P G (2003), “Animal experimentation in snake venom research and in vitro alternatives”, Toxicon, 42(2), pp 115-133 95 Selvanayagam Z E., Gopalakrishnakone P (1999), “Tests for detection of snake venoms, toxins and venom antibodies: review on recent trends (1987–1997)”, Toxicon, 37(4), pp 565-586 96 Selvanayagam Z E., Gnanavendhan S G., Ganesh K A., et al (1999), “ELISA for the detection of venoms from four medically important snakes of India”, Toxicon, 37(5), pp 757-770 97 Shek K C., Tsui K L., Lam K K., et al (2009), “Oral bacterial flora of the Chinese cobra (Naja atra) and bamboo pit viper (Trimeresurus albolabris) in Hong Kong SAR, China”, Hong Kong Med J, 15(3), pp 183-190 98 Siigur J., Arumäe U., Neuman T., et al (1987), “Monoclonal antibody immunoaffinity chromatography of the nerve growth factor from snake venoms”, Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 87(2), pp 329-334 123 99 Silamut K., Ho M., Looareesuwan S., et al (1987), “Detection of venom by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in patients bitten by snakes in Thailand”, BMJ, 294(6569), pp 402-404 100 Singer J M., Plotz C M (1956), “The latex fixation test: I Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis”, The American Journal of Medicine, 21(6), pp 888-892 101 Stábeli R G., Magalhães L M P., Selistre-de-Araujo H S., et al (2005), “Antibodies to a fragment of the Bothrops moojenil-amino acid oxidase cross-react with snake venom components unrelated to the parent protein”, Toxicon, 46(3), pp 308-317 102 Sutherland S K (1992), “Antivenom use in Australia Premedication, adverse reactions and the use of venom detection kits”, Med J Aust, 157, pp 734–739 103 Sutherland S K., Couter A R., Broad A J (1975), “Human snake bite victims: the successful detection of circulating snake venom by radioimmunoassay”, Med J Aust, 1, pp 27-29 104 Tan J (2008), Analysis of Whole Blood Samples: Optimization of Sample Preparation for Rapid Assays, Master, Faculty of the Graduate School of Cornell University 105 The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora (2000), Sixteenth meeting of the Animals Committee Shepherdstown (United States of America) 11-15 December 2000, Washington, D.C 106 Theakston R D G., Laing G D (2014), “Diagnosis of Snakebite and the Importance of Immunological Research”, Toxins, 6(5), pp 1667-1695 Tests in Venom 124 107 Theakston R D G., Jones M J L., Reid H A (1977), “MicroELISA for detecting and assaying snake venom and venom antibody”, Lancet, 2, pp 639-641 108 Tiru‐chelvam R (1972), “Demonstration of sites of snake‐venom localisation by immunofluorescence techniques”, The Journal of pathology, 107(4), pp 303-305 109 Tseng L F., Chiu T H., Lee C Y (1968), “Absorption and distribution of 131 I-labeled cobra venom and its purified toxins”, Toxicology and Applied Pharmacology, 12(3), pp 526-535 110 Van Weemen B K., Schuurs A H W M (1971), “Immunoassay using antigen-enzyme conjugates”, FEBS Letters, 15(3), pp 232–236 111 Venkatesan C., Sarathi M., Balasubramanaiyan G., et al (2014), “Neutralization of cobra venom by cocktail antiserum against venom proteins of cobra (Naja naja naja)”, Biologicals, 42(1), pp 8-21 112 Viravan C., Veeravat U., Warrell M J., et al (1986), “ELISA confirmation of acute and past envenoming by the monocellate Thai cobra (Naja kaouthia)”, The American journal of tropical medicine and hygiene, 35(1), pp 173-181 113 Virekunnas L (2012), Colloidal Gold and Paramagnetic Labels in Lateral Flow Assay Detecting Ricin, Master of Science Thesis, Tampere University of Technology 114 Vithal K G., Raymond N H (1974), “Quantitation of antigens by immunoelectrophoresis”, Immunochemistry, 11, pp 305-308 115 Wagstaff S C., Laing G D., Theakston R D G., et al (2006), “Bioinformatics and multiepitope DNA immunization to design rational snake antivenom”, PLoS Med, 3(6), pp 832-844 116 Wallach V., Williams K L., Boundy J (2014), Snakes of the World: A catalogue of living and extinct species CRC Press 125 117 Wang J D., Tsan Y T., Yan-Chiao M., et al (2009), “Venomous snakebites and antivenom treatment according to a protocol for pediatric patients in taiwan”, Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 15(4), pp 667-679 118 Warrell D A (2010), “Snake bite”, The Lancet, 375(9708), pp 77-88 119 Warrell D A (2010), Guidelines for the management of snake-bites WHO Library Cataloguing-in-Publication data, World Health Organization, Regional Office for South-East Asia, New Delhi, India 120 WHO Expert Committee (2010), Guidelines for the production, control and regulation of snake antivenom immunoglobulins 121 Wide L., Porath J (1966), “Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 130(1), pp 257-260 122 Wong O F., Lam T S., Fung H T., et al (2010), “Five-year experience with Chinese cobra (Naja atra)-related injuries in two acute hospitals in Hong Kong”, Hong Kong Med J 16(1), pp 36-43 123 Wong R C., Harley Y T (2009), Lateral Flow Immunoassay, Springer, USA 124 World Health Organization (2005), “Guidelines for the clinical management of snake bite in the South-East Asia region”, New Delhi: WHO Regional Office for South-East Asia 125 Yalow R S., Berson S A (1996), “Immunoassay of endogenous plasma insulin in man”, Obesity research, 4(6), pp 583-600 126 PHỤ LỤC - Bệnh án nghiên cứu - Danh sách bệnh nhân nghiên cứu - Hướng dẫn sử dụng kít - Một số hình ảnh nghiên cứu 127 BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã số NC: Đề tài: “Nghiên cứu chế tạo kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra kỹ thuật sắc ký miễn dịch” I Hành chính: - Họ tên Bệnh nhân: Tuổi: Giới: - Mã số bệnh án: Mã số lưu trữ: - Khoa: Phòng: - Nghề nghiệp: Địa chỉ: - Thời gian nhập viện: Thời gian viện: II Các tiêu đánh giá: Khoảng thời gian nhập viện sau bị rắn cắn Trước giờ: Từ – 24 giờ: Sau 24 giờ: Liều huyết kháng nọc rắn điều trị: Dưới 10 lọ: Từ 10 – 30 lọ: Trên 30 lọ: Kết xét nghiệm test VDK: Dịch vết cắn: Dương tính Âm tính Huyết thanh: Dương tính Âm tính Nước tiểu: Dương tính Âm tính Chẩn đoán xác định: 128 129 130 131 132 HƯỚNG DẪN SỬ DỤNG BỘ KÍT Hướng dẫn sử dụng - Lấy kít khỏi túi kín sử dụng nhanh tốt Để đạt kết tốt nhất, toàn trình xét nghiệm phải hoàn thành vòng kể từ mở túi đựng - Đặt kít mặt phẳng nằm ngang Chuyển mẫu ống hút nhỏ giọt pipette: + Dùng pipette: hút 90µl mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, nước tiểu dịch vết cắn) cho vào giếng (hình 1), bắt đầu tính thời gian Tránh tạo bóng khí vùng nhỏ mẫu + Dùng ống hút nhỏ giọt: giữ ống nhỏ giọt theo phương thẳng đứng, hút mẫu bệnh phẩm nhỏ vào giếng giọt (~ 90 µl), bắt đầu tính thời gian Tránh tạo bóng khí vùng nhỏ mẫu - Chờ vạch đỏ xuất kit thử Đọc kết vòng 15 phút Kết nên đọc vòng 10 – 20 phút Không đọc kết sau 20 phút Hướng dẫn đọc kết C C C C C T T T T T Tra mẫu Âm tính Dương tínhtính Dương Test lỗi Hình Hướng dẫn đọc kết 133 + Dương tính: Xuất hai vạch đỏ rõ rệt vạch chứng (C) vạch phát (T) (Lưu ý: độ đậm màu vạch phát (T) khác tùy theo nồng độ nọc rắn có mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên, vạch mờ vùng phát coi dương tính + Âm tính: Chỉ xuất vạch chứng (C) Không thấy xuất vạch phát (T) dù đậm hay mờ + Kết giá trị: Không thấy xuất vạch chứng (C) Nguyên nhân thường gặp lượng mẫu bệnh phẩm không đủ thao tác xét nghiệm sai Đọc lại hướng dẫn làm lại xét nghiệm kít thử khác 134 MỘT SỐ HÌNH ẢNH NGHIÊN CỨU Hình 1: Thu thập nọc rắn Hình 3: Thử nghiệm LD50 Hình 5: Gây miễn dịch gà Hình 2: Đông khô nọc rắn Hình 4: Gây miễn dịch thỏ Hình 6: Lựa chọn cặp kháng thể dựa kỹ thuật ELISA 135 Hình 7: Kết điện di nọc rắn (Hổ mang N.a Đài loan, N.a Việt nam, Hổ đất N.k, Hổ chúa O.h) Hình 8: Kết định lượng Kháng thể Hình 9: Kiểm tra tính đặc hiệu Western blot Hình 10: Ủ màng PVDF với Kháng thể sau chuyển màng Hình 11: Dung dịch hạt nano vàng dùng thử nghiệm Hình 12: Gắn hạt nano vàng với kháng thể 136 Hình 13: Xử lý màng Hình 14: Các loại màng sử dụng que thử Hình 15: Tối ưu nồng độ KT vạch phát Hình 16: Tối ưu nồng độ KT vạch chứng Hình 17: Tối ưu nồng độ KT cộng hợp Hình 18: Kiểm tra ngưỡng phát ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Dị ứng Miễn. .. mang Naja atra kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm hai mục tiêu: Chế tạo kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo nguyên lý sắc ký miễn dịch Đánh giá khả phát nọc rắn Naja atra xét nghiệm thực... định rắn hổ mang cắn [3] Một loài rắn hổ mang thường gặp hay gây tai nạn rắn cắn Miền bắc rắn hổ mang Naja atra, hay gọi rắn hổ mang bành Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn dẫn tới nhiễm độc nọc rắn,