Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Listeria monocytogenes loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm nguy hiểm, đặc biệt với tỷ lệ tử vong lên đến 30% Bệnh L monocytogenes gây gọi chung listeriosis Đối tượng có nguy bị nhiễm bệnh thường người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi Nếu không điều trị kịp thời kháng sinh, bệnh nhân bị nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai tử vong Vi khuẩn L monocytogenes phổ biến môi sinh Chúng tìm thấy nhiều nơi đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, phân người phân động vật Chúng sống tăng trưởng chậm điều kiện kh c nghiệt nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH hoạt độ nước Đặc biệt loài vi khuẩn có khả sinh trưởng nhiệt độ lạnh (0-10oC) Chính lý mà khả nhiễm L monocytogenes thực phẩm cao, đặc biệt sản phẩm bảo quản lạnh thời gian dài Nhiều loại thực phẩm bày bán siêu thị thực phẩm ăn sẵn Thêm ngày người ta lại muốn sử dụng loại thực phẩm chất bảo quản không bị gia nhiệt để giữ nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu Những sản phẩm thường bảo quản lạnh trước sử dụng Vì vậy, sản phẩm thực phẩm loại có nguy nhiễm L monocytogenes cao Rất nhiều vụ ngộ độc triệu hồi sản phẩm thực phẩm nhiễm L monocytogenes kh p giới thông báo Các nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ vụ dịch lớn giới cho thấy, có chủng L monocytogenes có khả gây bệnh gây bùng phát dịch lớn, bên cạnh có kiểu huyết khả gây bệnh gây dịch Cho đến thời điểm chưa có công bố dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam Khả gây bệnh gây dịch L monocytogenes nhiễm thực phẩm Việt Nam ẩn số Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát L monocytogenes phương pháp nuôi cấy Một số phương pháp sinh học phân tử PCR, real-time PCR phương pháp miễn dịch (ELISA) tiêu chuẩn hóa Mấy năm trở lại đây, với đời số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát nhanh vi sinh vật gây bệnh đơn giản hóa thêm bước LAMP k thuật khuếch đại đ ng nhiệt sử dụng phổ biến Ngoài ra, khả phát trực tiếp sản phẩm phản ứng LAMP không cần điện di ưu điểm trội phương pháp này, giúp đơn giản hóa rút ng n thời gian phân tích K thuật nhanh chóng ứng dụng để phát L monocytogenes thực phẩm nhiều nghiên cứu giới Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát Listeria monocytogenes phương pháp nuôi cấy, sau khuẩn lạc đặc trưng kh ng định phản ứng sinh hóa Đã có số nghiên cứu phương pháp PCR que thử s c ký miễn dịch nhằm phát vi khuẩn này, nhiên thời gian phân tích dài yêu cầu cao trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng nhu cầu phân tích phát thực tế sản xuất Trong khuôn khổ luận án này, nghiên cứu đề tài có tên “Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm phát nhanh Listeria monocytogenes phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng phân lập số thực phẩm có nguy cao thị trường Việt Nam” Mục tiêu nội dung nghiên cứu luận án   Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ loại thực phẩm có nguy cao Việt Nam Xây dựng sinh phẩm phát nhanh L monocytogenes loại thực phẩm ăn liền dựa k thuật LAMP Những đóng góp luận án   Lần công bố kết qủa nghiên cứu dịch tễ học phân tử L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam Là công trình sử dụng gen inlJ làm gen đích phát triển k thuật LAMP cho phát L monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu phép phân tích Bố cục luận án Luận án bao gồm 123 trang có trang mở đầu, 38 trang tổng quan, trang vật liệu phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết NỘI DUNG CHÍNH Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan L monocytogenes Luận án đề cập đến vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa loài L monocytogenes, từ cho thấy loài có khả phân bố rộng thực phẩm môi trường Các thống kê cho thấy có nhiều công bố vụ gây dịch bệnh listeriosis L monocytogenes gây lên có liên quan đến loại thực phẩm khác chủ yếu loại thực phẩm có bảo quản lạnh thời gian dài Chính luận án phần phân lập tiến hành chủ yếu mẫu thực phẩm có trình bảo quản lạnh trước sử dụng 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân loại dƣới loài L monocytogenes Các phương pháp phân loại loài dựa theo kiểu enzyme kháng thể thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp nghiên cứu dịch tễ học chủng L monocytogenes gây dịch bệnh Các phương pháp phân loại loài dựa kiểu gen phổ biến Tuy nhiên kết phân loại phụ thuộc lớn vào sở liệu liên quan cho phân tích so sánh MLST phương pháp phân loại loài đơn giản sử dụng phổ biến Cơ sở liệu cho phương pháp MLST phong phú Chính luận án sử dụng phương pháp MLST sơ sở liệu viện Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học loài L monocytogenes phân lập Từ đánh giá nguy gây dịch bệnh loài vi khuân thực phẩm Việt Nam 1.3 Tổng quan phƣơng pháp phát L monocytogenes Hiện có nhiều phương pháp sử dụng phân tích phát L monocytogenes Ngoài phương pháp tiêu chuẩn phương pháp nuôi cấy theo ISO TCVN có phương pháp nhân gen real-time PCR phương pháp sử dụng kít miễn dịch tiêu chuẩn hóa Tuy nhiên phương pháp có thời gian phân tích dài yêu cầu sử dụng trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa đáp ứng yêu cầu việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm thực tế sản xuất Chính Luận án đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn giản đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao Chƣơng II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1  Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu thực phẩm Mẫu lấy siêu thị địa bàn Hà Nội Chủng vi sinh vật Một số chủng vi khuẩn lấy từ sưu tập giống Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Hóa chất - Hóa chất cho phản ứng PCR, LAMP, Real time PCR, điện di DNA, tách chiết DNA, nuôi cấy vi khuẩn Môi trường: Môi trường cho tăng sinh; môi trường phân lập L monocytogenes Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP 2.2 Các thiết bị sử dụng chủ yếu Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu  Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm  Phản ứng PCR khẳng định L monocytogenes khuếch đại gen giữ nhà cho giải trình tự  Phương pháp tinh sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn nhà sản xuất  Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại loài MLST sở liệu viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst)  Giải trình tự gen: Tiến hành Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Mỗi trình tự gen giải trình tự chiều  Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4  Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy phản ứng LAMP  Phản ứng Real-time PCR  Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn  Kiểm định sinh phẩm  Ứng dụng thử nghiệm sinh phẩm  Phương pháp phát L monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 ISO 112901:1996 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ số thực phẩm Việt Nam 3.1.1 Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm Trong nghiên cứu này, mẫu thực phẩm tăng sinh môi trường Half Fraser, mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình Hình 3-1 A) cấy trải môi trường RAPID’L.mono (Biorad) Các mẫu thực phẩm dương tính với L monocytogenes mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 3-1 B) có khuẩn lạc nghi ngờ kh ng định dương tính k thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu LM1-LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp (Hình 3-2) A B Hình 3-1 Kết phân lập L monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono A: T ng sinh môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu : Hình thái khuẩn lạc L monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono khuẩn lạc màu anh đen không c halo màu vàng tương ứng v i khuẩn lạc nghi ngờ L monocytogenes 702 bp Hình 3-2 Kết khẳng định PCR khuẩn lạc L monocytogenes giả định phân lập tr n môi trường RAPID’L.mono : Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng khẳng định L monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi ngờ từ mẫu sushi : mẫu âm t nh : thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TMcủa Fermentas Tổng hợp kết phân tích phát L monocytogenes mẫu thực phẩm phân tích từ năm 2011 đến 2015 trình bày Bảng 3-1 sau Bảng 3-1 Tổng hợp kết phát L monocytogenes mẫu thực phẩm Việt Nam khoảng thời gian từ Loại thực phẩm đến Số lƣợng mẫu thực phẩm Số lƣợng chủng phân lập đƣợc Tỷ lệ nhiễm (%) Xúc xích 145 21 14,48 Các loại thịt hun khói 112 34 30,36 Thịt sống 43 2,33 Cá, tôm, cua, ốc 49 2,04 Bơ, sữa trùng 45 2,22 Rau ăn sống 37 0 Sushi 52 1,92 Bánh mỳ kẹp thịt, hoa dầm 29 0 Nem chua 31 0 Tổng cộng 543 59 10,87 Có tổng số 59 543 mẫu phát nhiễm L monocytogenes Trong mẫu thịt hun khói xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao 3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm Việt Nam Kết phân lập 59 chủng L monocytogenes, nhiên trình giữ giống, số chủng phân lập bị chết, chủng lại tăng sinh, tách chiết DNA tiến hành phản ứng PCR với mồi nhân đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene) Tinh sản phẩm PCR, giải trình tự gen Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Dựa vào trình tự thu được, tra cứu kiểu trình tự tương ứng với đoạn gen Tổ hợp kiểu trình tự đoạn gen tra cứu kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (clone complex - CC) dòng giống (ligneage) tương ứng chủng phân lập Tra cứu kiểu trình tự đoạn gen giữ nhà 48 chủng L monocytogenes phân lập ngân hàng liệu kiểu trình tự tương ứng gen Tổ hợp kiểu trình tự đoạn gen chủng phân lập kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (CC) thuộc dòng giống Từ kiểu ST phân loại 48 chủng phân lập thành 16 nhóm có kiểu ST khác Nối đoạn gen giữ nhà nhóm với nhau, so sánh trình tự đoạn gen 16 nhóm với 25 trình tự đoạn gen tương ứng chủng gây dịch bệnh listeriosis giới Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000 Xây dựng phân loại Hình 3-3 Hình 3-3 Cây phân loại nh m chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Chữ đ : T n nh m ký hiệu chủng, dự đoán kiểu serotype chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam Chữ đen: Các chủng L monocytogenes gây vụ bùng phát dịch bệnh tr n gi i công b trình tự đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng liệu MLST Kết cho thấy, xuất dòng L monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ thịt ba rọi xông khói) có trình tự gen cấu trúc giống hệt chủng có tần suất cao gây vụ dịch lớn giới Nhóm chiếm 17 48 chủng có trình tự đoạn gen giống hệt với trình tự đoạn gen tương ứng số chủng gây vụ thai lưu năm 2005 Nga, vụ dịch Italia năm 1997 Và gần giống trình tự đoạn gen tương ứng từ chủng phân lập từ vụ dịch Pháp năm 1993 Đa số chủng lại, trình tự gen giống chủng phân lập từ thực phẩm gần giống trình tự phân lập từ người gây vụ dịch nhỏ giới 3.2 Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes thực phẩm dựa kỹ thuật LAMP 3.2.1 Xây dựng phản ứng LAMP 3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ Trong nghiên cứu này, sử dụng trình tự gen inlJ chủng chuẩn L monocytogenes EGD-e có số hiệu emb|AL591984.1 cho thiết kế mồi LAMP Kiểm tra độ tương đồng trình tự gen inlJ đưa vào thiết kế mồi so với trình tự gen ngân hàng gen phần mềm BlastN, cho thấy trình tự gen inlJ sử dụng cho thiết kế mồi LAMP chủng có độ tương đồng cao với trình tự gen inlJ với chủng L monocytogenes công bố ngân hàng gen NCBI Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 để thiết kế mồi Lựa chọn mồi theo số tiêu chí khuyến cáo hướng dẫn sử dụng phần mềm [https://primerexplorer.jp/e/v4_manual/pdf/PrimerExplorerV4_Manual_1.pdf] Đã lựa chọn mồi bảng 3-2 Bảng -2 Trình tự mồi LAMP thiết kế để khuếch đại gen inlJ Tên mồi 1-F3 1-B3 1-FIP 1-BIP 2-F3 2-B3 2-FIP 2-BIP 3-F3 3-B3 3-FIP 3-BIP 4-F3 4-B3 4-FIP 4-BIP 5-F3 5-B3 5-FIP 5-BIP 6-F3 6-B3 6-FIP 6-BIP 7-F3 7-B3 7-FIP 7-BIP 8-F3 8-B3 8-FIP 8-BIP 3.2.1.2 Trình tự (5’-3’) CATGGTTTCAAACCCGCT AATGCTGCTGCTACCTCT GTTGGTTGAGTTGAGCTTGTTTCTT-TTTAACATTCGCAGCAACG ACACACTCAAAGCCGGTCAA-TTTT-AGCAAAATTGTCATCAGGAA ACAAGCTCAACTCAACCAA GTTATGGATGAATTATGGCAATC TGTCATCAGGAAACCAGTCGTTA-TTTT-CTATAAAAAACACACTCAAAGCC GCTTCAGAGGTAGCAGCAGC-TTTT-CTTGTTAGAGTAGCTAGTTGTTCT GTTTCCTGATGACAATTTTGC TTTGGCTAAGATCAAGGGT AGTAGCTAGTTGTTCTTCGCTGAT-TTTT-AGAGGTAGCAGCAGCATT TCATCCATAACCGATATGACTGGT-TTTT-GGTAATGTTGTTACTTGTGCA TGCAAGCAACTGACACTA GGGTTACGTCAAGGTTTGT TACCAGTCATATCGGTTATGGATGA-TTTT-TCAGCGAAGAACAACTAGC TTGCACAAGTAACAACATTACCACC-TTT-TTATTTGAATCACATGCCAGAT GCGACACGAACAAACTCA CAGTCTAAGGTTGTTAATTGAGT ATTTCGGTTAAGGTGTTGCGC-TTTT-ATGTAAGTCAAAATCCACTGTT ATGTCAGCCACAATACACAATTAAC-TTTT-GGTGTCACATCTAATTTGGTG CCGCTTACAAAATTAACCTACT AAGCTACAGTCTAAGGTTGT TTGCGCGCGCAGTTTAAATAAG-TTTT-CGACACGAACAAACTCAC CCGAAATAGATGTCAGCCACAATAC-TTTT-GGTGTCACATCTAATTTGGTG GCACAGACAATCCAGCCGTA GTTGCGTTATCTGGAGTAGTCG GTCTTCTCCTTTGATGGGTTGAGG - ACGGAGCTATAGTAGGAACCGTA TGGCGGATGATGAAGTTCTAAGC - CGCTAGAAGTATAAGGATCGTCCA CATTACCACCCTTGATCTTAGC AGGTTGTTAATTGAGTTTGTGG TGTGAGTTTGTTCGTGTCG – CAAACCTTGACGTAACCCCGC GCGCAACACCTTAACCGAAA – TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG Lựa ch n mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t Thực phản ứng LAMP với mồi sử dụng DNA khuôn DNA tổng số tinh khiết L monocytogenes EGD-e với lượng 20, 2, 0,2 pg phản ứng Sau đó, điện di 10 l sản phẩm gel agarose Kết điện di thể Hình 3-4 Hình 3-4 Kết sàng l c mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA L monocytogenes Trong đ , , , , 7, , 0, , , , , 0, , , 7, , , , : , , , : DNA chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder (Thermo Scientific) : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng 7, : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng , 0: Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP v i mồi lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng Từ kết này, định chọn mồi cho nghiên cứu tối ưu hóa Phân tích tính phù hợp mồi cho thấy mồi phù hợp tiêu chí thiết kế khoảng cách mồi, chiều dài mồi Để tìm vị trí biến đổi loài trình tự nucleotit gen, tiến hành so sánh trình tự mồi với trình tự gen inlJ ngân hàng GenBank NCBI chương trình ClustalW BlastN Tại vị trí biến đổi, nucleotit biến đổi thay nuceotit suy biến Kết chạy kiểm tra mồi trình bày cụ thể Bảng 3-3 Bảng 3-3 Kết kiểm tra điểm sai khác mồi LAMP v i trình tự gen inlJ tr n ngân hàng gen NCBI Trình tự Tên mồi F3 CATTACCACCCTTGATCTTAGC Vị trí thay đổi CATTACTACTCTTGATCTTAGC Số lƣợng allele Trình tự mồi sau thay nucleotide suy biến CATTACYACYCTTGATCTTAGC CCACAAACTCAATTAACAACCT CAAACCTTGAYGTAACCCCGC CATTACCACCCTTGATCTTAGC B3C CCACAAACTCAATTAACAACCT F2 CAAACCTTGACGTAACCCCGC Mồi B3c nằm vùng bảo thủ hoàn toàn CAAACCTTGACGTAACCCCGC CAAACCTTGATGTAACCCCGC B2c TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCAGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCRGTTAATTGTGTATTGTGGCTG F1c TGTGAGTTTGTTCGTGTCG Mồi F1c nằm vùng bảo thủ hoàn toàn CGACACGAACAAACTCACA B1 GCGCAACACCTTAACCGAAA GCGCAACACCTTAACCGAAA GCGCAACACCCTAACCGAAA 3.2.1.3 GCGCAACACCYTAACCGAAA T i ưu phản ứng LAMP Ảnh hƣ ng nhiệt độ nồng độ betain đến hiệu khuếch đại phản ứng LAMP Khảo sát đồng thời ảnh hưởng nhiệt độ ủ nồng độ betaine đến hiệu khuếch đại phản ứng LAMP Kết điện di thể Hình 3-5 Từ kết này, lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain 0,9 M (giếng 13) cho thí nghiệm Hình 3-5 nh hư ng nhiệt độ ủ nồng độ betain đến hiệu khuếch đại phản ứng LAMP Trong đ : : DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder (Thermo Scientific) o , : Sản phẩm LAMP C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , : Sản phẩm LAMP C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , 7: Sản phẩm LAMP C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , : Sản phẩm LAMP C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o 0, : Sản phẩm LAMP C, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , : Sản phẩm LAMP C, 0,9 M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , : Sản phẩm LAMP C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , 7: Sản phẩm LAMP C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng o , : Sản phẩm LAMP C, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt 0, pg phản ứng Ảnh hƣ ng th i gian ủ đến hiệu khuếch đại phản ứng LAMP Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn L monocytogenes 0,2 pg phản ứng; thời gian ủ 45, 60, 75 phút Sau đó, điện di l lượng sản phẩm LAMP gel agarose Kết điện di thể Hình 3-6 đây: Hình 3-6 nh hư ng thời gian ủ đến hiệu khuếch đại phản ứng LAMP Trong đ : : DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific); : Sản phẩm LAMP sau ph t lượng DNA khuôn L monocytogenes pg phản ứng , , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt , 0, ph t Kết cho thấy kết khuếch đại thực bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số 4) Do vậy, lựa chọn thời gian ủ 60 phút cho phản ứng LAMP điều kiện tối ưu 65oC nồng độ betain 0,9 M 3.2.1.4 Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm phản ứng LAMP Xác định tính bao trùm phản ứng với tập hợp 16 chủng L monocytogenes Kết điện di sản phẩm LAMP (Hình 3-7) cho thấy độ bao trùm phản ứng LAMP với DNA chủng thuộc loài L monocytogenes 100% Hình 3-7 ộ bao trùm phản ứng LAMP v i chủng L monocytogenes Trong đ : : Thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific); : Mẫu kiểm chứng âm t nh , , , 7: Sản phẩm LAMP v i pg DNA khuôn l n lượt chủng L monocytogenes ATCC 19117, L monocytogenes EGD-e, L monocytogenes LO28; L monocytogenes CIP7835; L monocytogenes DSM20750; đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Hình 3-8 ộ ch n l c phản ứng LAMP v i loài Listeria khác vi khuẩn thường nhi m tạp thực phẩm Trong đ : : thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh , , , 7: sản phẩm LAMP v i pg DNA khuôn l n lượt chủng L monocytogenes ATCC 19117, L monocytogenes EGD-e, L monocytogenes LO28; L monocytogenes CIP7835; L monocytogenes DSM20750 đến : sản phẩm LAMP v i ng DNA khuôn l n lượt chủng L innocua ATCC L seeligeri ATCC 35967; L welshimeri ATCC 35897; L grayi ATCC 19120; L ivanovii ATCC 19119; Escherichia coli B41; Salmonella 9R12G2; Bacillus cereus H3081.97; B subtilis 353B Xác định tính chọn lọc phản ứng LAMP với loài Listeria khác loại vi khuẩn thường nhiễm tạp thực phẩm Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, B subtilis Kết điện di (Hình 3-8) cho thấy phản ứng LAMP có độ đặc hiệu đạt 100% tập hợp chủng thử nghiệm 3.2.1.5 ộ nhạy phản ứng LAMP Tiến hành phản ứng LAMP nồng độ DNA khác Kết cho thấy ngư ng phát phản ứng LAMP 50 fg/phản ứng tương đương với khoảng 16 tế bào phản ứng (Hình 3-9) 10 Hình 3-9 Ngư ng phát phản ứng LAMP đ i v i DNA tinh khiết L monocytogenes Trong đ : , , , , , 7: Sản phẩm LAMP v i l n lượt , pg 0, pg fg chủng L monocytogenes EGD-e 8: Mẫu âm t nh : Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific fg fg fg 1, fg DNA Hình 3-10 Phát sản phẩm LAMP phản ứng màu v i HN Trong đ : 7,6,5,4,3 Ống phản ứng LAMP v i l n lượt fg fg fg fg fg u hu g L monocytogenes EGD-e Kết cho thấy độ nhạy hai phương pháp phát sản phẩm LAMP nghiên cứu tương đương 3.2.1.6 So sánh độ nhạy mồi LAMP thiết kế v i mồi LAMP công b Tiến hành phản ứng LAMP với mồi, mồi LAMP thiết kế với mồi tham chiếu công bố trình tự Kết thể Hình 3-10 11 Hình 3-11 So sánh độ nhạy phản ứng LAMP phát triển nghiên cứu v i phương pháp LAMP phát L monocytogenes công b Trong đ : -): mẫu âm tính; (+): mẫu dương t nh 1: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-7 dung dịch DNA ban đ u 2: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-6 dung dịch DNA ban đ u 3: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-5 dung dịch DNA ban đ u 4: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 10-4 dung dịch DNA ban đ u L: DNA ladder (Sangon Biotech) A: Phản ứng LAMP v i mồi iap B: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA C: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA D: Phản ứng LAMP v i mồi LAMP inlJ nghiên cứu Kết cho thấy mồi LAMP gen inlJ nghiên cứu cho độ nhạy tốt (kết dương tính độ pha loãng DNA 10-6) 3.2.2 Xây dựng quy trình tăng sinh nh hư ng loại môi trường đến sinh trư ng L monocytogenes 3.2.2.1 Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói môi trường khác Sau 16 nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR Đánh giá khả tăng sinh dựa giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) phản ứng real-time PCR, kết thể Bảng 3-4 sau: Bảng 3-4 nh hư ng loại môi trường đến t ng sinh L monocytogenes canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng TSBYE TSBYE có không Kháng có sinh kháng sinh BLEB có kháng sinh BLEB kháng sinh Half fraser có kháng sinh UVM kháng sinh LEB có kháng sinh LEB kháng sinh Ct 21,40 ± 1,20 15,71 ± 1,52 23,94 ± 0,97 14,26 ± 1,16 21,47 ± 2,01 18,29 ± 1,45 25,77 ± 1,78 24,57 ± 1,13 12 Kết cho thấy môi trường HF BLEB cho giá trị Ct thấp gần ngang Trong thí nghiệm tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích môi trường BLEB với nồng độ kháng sinh môi trường Half Fraser (acriflavin nalidixic acid 12,5 mg l 10 mg l) 12 giờ, kết Bảng 3-5 Bảng 3-5 nh hư ng hai loại môi trường LE HF đến sự t ng sinh L monocytogenes canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại trƣ ng Ct môi BLEB có kháng sinh 31,57 ± 0,98 Half fraser có kháng sinh 33,29 ± 0,68 Qua thí nghiệm này, môi trường BLEB chọn môi trường cho tăng sinh L monocytogenes 3.2.2.2 nh hư ng s monocytogenes thành ph n môi trường đến sinh trư ng L Ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men Hình 3-12 nh hư ng nồng độ cao n m men đến sinh trư ng L monocytogenes môi trường LE canh trường thu n Tăng sinh với lượng giống ban đầu x 104 CFU ml Sau nuôi, đo độ đục canh trường bước sóng 600 nm Từ kết Hình 3-13, nồng độ cao nấm men g l chọn cho thí nghiệm Ảnh hưởng nồng độ pyruvate đến sinh trưởng phát triển L monocytogenes Nhiễm chủ động L monocytogenes vào môi trường BLEB có bổ sung pyruvate với nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm 2,7 x 102 CFU ml, sau nuôi, lấy canh trường đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 600 nm Kết cho thấy mật độ vi khuẩn đạt cao giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 1,4 g l Qua thí nghiệm lựa chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB 1,2 g l 3.2.2.3 nh hư ng nalidi ic acid acriflavin đến sinh trư ng L monocytogenes Vi khuẩn nuôi môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu kết Hình 3-14 sau: 13 Hình 3-13 nh hư ng nồng độ acriflavin axít nalidi ic đến sinh trư ng L monocytogenes môi trường LE canh trường thu n Khi nồng độ hai loại kháng sinh giảm xuống mg l, sinh trưởng L monocytogenes tương đương với mẫu kháng sinh (sự sai khác ý nghĩa) Do vậy, thí nghiệm tiến hành xem xét khả ức chế kháng sinh nồng độ thấp 3.2.2.4 nh hư ng kháng sinh đến sinh trư ng s loài vi khuẩn khác Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng acriflavin acid nalidixic lên ba loài vi khuẩn E coli, Staphylococcus aureus Lactobacillus plantarum nồng độ 2,5; 10 mg l môi trường BLEB nghiên cứu Kết cho thấy, với nồng độ kháng sinh mg l cho khả ức chế tốt loài vi khuẩn nghiên cứu Qua thí nghiệm chọn nồng độ loại kháng sinh acriflavin acid nalidixic mg l Bảng 3-6 nh hư ng nồng độ kháng sinh đến sinh trư ng s loài vi sinh vật thị môi trường LE Loài vi khuẩn E coli Th i gian tăng sinh (gi ) canh trường thu n Không kháng sinh 0,116 0,373 0,653 0,655 Acriflavin (2,5 mg/l) 0,116 0,105 0,096 0,231 Acriflavin (5 mg/l) 0,124 0,144 0,138 0,138 Acriflavin (10 mg/l) 0,115 0,105 0,103 0,087 Nadilixic (2,5 mg/l) 0,122 0,142 0,104 0,123 Nadilixic (5 mg/l) 0,112 0,114 0,09 0,083 Nadilixic (10 mg/l) 0,121 0,134 0,071 0,109 Không kháng sinh 0,031 0,596 2,357 4,5 Acriflavin (2,5 mg/l) 0,03 0,039 0,034 0,045 Acriflavin (5 mg/l) 0,039 0,041 0,037 0,047 Staphylococcus Acriflavin (10 mg/l) aureus 0,033 0,031 0,03 0,047 Nadilixic (2,5 mg/l) 0,024 0,035 0,036 0,038 Nadilixic (5 mg/l) 0,025 0,042 0,036 0,037 Nadilixic (10 mg/l) 0,025 0,036 0,036 0,047 Không kháng sinh 0,144 ND 2,254 2,959 Lactobacillus 14 plantarum Acriflavin (2,5 mg/l) 0,148 ND 1,722 1,743 Acriflavin (5 mg/l) 0,134 ND 0,114 0,147 Acriflavin (10 mg/l) 0,137 ND 0,162 0,131 Nadilixic (2,5 mg/l) 0,118 ND 0,541 0,943 Nadilixic (5 mg/l) 0,117 ND 0,142 0,055 Nadilixic (10 mg/l) 0,123 ND 0,138 0,052 ND: Không xác định Thử nghiệm t ng sinh tr n mẫu thực phẩm 3.2.2.5 Mẫu xúc xích hun khói đồng hóa môi trường BLED, bổ sung loại kháng sinh acriflavin acid nalidixic với nồng độ loại mg l 10 mg l Nhiễm chủ động với mật độ 10 CFU bình có chứa 100 ml hỗn dịch đồng hóa Sau 12 tăng sinh, lấy ml canh trường tăng sinh tiến hành tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR Kết thể Bảng 3-7 Bảng 3-7 nh hư ng nồng độ acriflavin axít nalidixic đến t ng sinh L monocytogenes môi trường LE c bổ sung cao n m men, pyruvate v i diện hệ vi sinh vật mẫu c ch Mẫu Acriflavin nalidixic acid Acriflavin nalidixic acid (5 mg/l) (10 mg/l) 22,7 ± 1,04 26,17 ± 1,17 Ct Các giá trị Ct giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Kết thêm lần kh ng định nồng độ kháng sinh mg l cho khả tăng sinh L monocytogenes tốt so với nồng độ kháng sinh 10 mg l 3.2.3 Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA Tro g ội du g ày phươ g pháp tá h hiết đượ đá h giá thô g qu giá trị Ct ủ phả ứ g re l-time PCR, giá trị Ct g hỏ hiệu suất tá h hiết g lớ 3.2.3.1 Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L monocytogenes sử dụng triton X 00 kết o hợp si u âm gia nhiệt C Mỗi thí nghiệm tiến hành tách chiết với lượng sinh khối tế bào Lần lượt thay đổi yếu tố: Nồng độ triton X100 đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian gia nhiệt 95 °C (2-15 phút); thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch có chứa DNA cho phản ứng Real-time PCR Kết trình bày bảng sau Bảng 3-8 nh hư ng nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes Nồng độ triton X100 (%) Ct 0,6 1,2 1,8 2,4 15,56 ± 1,01 15,41 ± 0,63 15,93 ± 1,20 15,98 ± 0,78 Các giá trị Ct giá trị trung bình  độ lệch chuẩn 15 Bảng 3-9 nh hư ng thời gian lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes quy trình sử dụng Triton X 00 Th i gian xử lý nhiệt (phút) Ct 10 15 15,92± 0,51 15,56 ± 1,04 15,61 ± 1,12 15,73 ± 0,75 Các giá trị Ct giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Bảng 3-10 nh hư ng thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes quy trình sử dụng Triton X 00 Th i gian siêu âm (phút) Không siêu âm 0,5 Ct 21,22 ± 0,63 18,35 ± 1,01 17,74 ± 0,81 15,72 ± 0,53 16,23 ± 0,22 Các giá trị Ct giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Kết bảng điều kiện tách chiết chọn nồng độ triton X100 1,2%; gia nhiệt 95oC phút siêu âm phút 3.2.3.2 Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L monocytogenes sử dụng NaOH kết hợp o si u âm gia nhiệt C Mỗi thí nghiệm tiến hành tách chiết với lượng sinh khối tế bào Lần lượt thay đổi yếu tố: thời gian gia nhiệt 95 °C (5-20 phút); nồng độ NaOH (10mM 200mM), thời gian siêu âm (0-4 phút), ly tâm thu dịch có chứa DNA cho phản ứng Real-time PCR Kết trình bày bảng sau Bảng 3-11 nh hư ng thời gian lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes quy trình sử dụng NaOH Th i gian (phút) 10 15 20 Ct 21,53 ± 1,12 21,86 ± 0,45 21,13 ± 1,21 21,89 ± 1,04 Các giá trị Ct giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Bảng 3-12 nh hư ng nồng độ NaOH đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes Nồng độ NaOH (mM) Ct 10 30 70 100 150 200 22,73 ± 1,02 22,40 ± 0,64 21,86 ± 0,73 20,65± 0,52 20,79 ± 0,91 20,37 ± 0,85 Các giá trị Ct giá trị trung bình  độ lệch chuẩn 16 Bảng 3-13 nh hư ng thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L monocytogenes quy trình sử dụng NaOH Th i gian siêu âm (phút) Ct 20,72 ± 1,12 0,5 19,46 ± 17,72 ± 16,35 ± 16,81 ± 18,93 0,71 1,04 0,54 0,84 ± 0,97 Kết bảng điều kiện tách chiết chọn nồng độ NaOH 100 mM; gia nhiệt 95oC phút siêu âm phút, So sánh phương pháp tách chiết nghi n cứu đ i v i canh trường L monocytogenes thu n không c mẫu thực phẩm Dùng phương pháp tách chiết DNA (2 phương pháp sử dụng NaOH Triton X100 tối ưu phương pháp sử dụng kít tách chiết thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit) Mỗi phương pháp tách chiết thực mẫu Thực phản ứng real-time PCR với DNA thu từ phương pháp tách chiết Kết trình bày Hình 3-15 3.2.3.3 Hình 3-14 So sánh hiệu tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường thu n quy trình sử dụng NaOH, Triton X 00 sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit Kết cho thấy canh trường khả tách chiết DNA phương pháp không chênh lệch nhiều, Ct khoảng chu kỳ 3.2.3.4 ánh giá hiệu tách chiết DNA phương pháp đ i v i mẫu thực phẩm t ng sinh Thí nghiệm thực với mẫu xúc xích nhiễm chủ động, tách chiết theo phương pháp tách chiết DNA(3 phương pháp tách chiết phương pháp tách chiết thông thường có sử dụng dung môi hữu cơ) thực phản ứng Real-time PCR Kết trình bày Hình 3-16 sau 17 33 Ct 30 27 24 21 18 15 NaOH Tri ton Ki t Thông thường Hình 3-15 So sánh hiệu tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường t ng sinh mẫu c ch sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit quy trình tách chiết thông thường Kết phân tích cho thấy khả tách chiết DNA từ mẫu xúc xích phương pháp sử dụng kít cho kết tách chiết tốt Hai phương pháp sử dụng NaOH phương pháp sử dụng Triton X100 cho kết tách chiết tương đương Phương pháp tách chiết DNA thông thường làm DNA tốt, qúa trình tách chiết phực tạp nhiều thời gian sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích thực tế số mẫu lớn Kết cho thấy mật độ vi khuẩn đích không đủ (tăng sinh ng n, mật độ ban đầu thấp), phản ứng nhân gen yêu cầu DNA có độ tinh cao (real-time PCR) cần sử dụng phương pháp tách chiết DNA có công đoạn làm tốt phương pháp kít phương pháp thông thường để đảm bảo kết phân tích không bị âm tính giả Ngược lại mật độ vi khuẩn đích đủ lớn cho phản ứng nhân gen thêm có phản ứng nhân gen yêu cầu DNA với độ tinh không cao (LAMP) sử dụng phương pháp tách chiết đơn giản (NaOH Triton X100) cho đơn giản mà hiệu Trong nghiên cứu sử dụng bi từ g n kháng thể để cô đặc làm vi khuẩn sau giai đoạn tăng sinh Tuy nhiên hiệu làm cô đặc L monocytogenes từ mẫu thực phẩm sau tăng sinh cho hiệu không cao, nên kết cụ thể không trình bày phần kết luận án Tuy nhiên thí nghiệm rửa giải vi khuẩn khỏi hạt từ tách chiết DNA từ vi khuẩn thu được, kết cho thấy sử dụng đệm glycine-tris pH 8,3 theo khuyến cáo nhà cung cấp hạt từ (Gencrip) cho khả tách chiết DNA tốt so với NaOH 100 mM Chính thí nghiệm tiếp theo, tiến hành so sánh khả tách chiết DNA từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích hun khói theo phương pháp: sử dụng Triton X100 1,2 % với điều kiện tối ưu sử dụng đệm glycine-Tris 100 mM pH 8,3 với điều kiện tương tự DNA sử dụng cho phản ứng realtime PCR Kết thể Hình 3-17 18 Hình 3-16 So sánh hiệu tách chiết DNA thể gen L monocytogenes từ canh trường t ng sinh mẫu c ch sử dụng quy trình tách chiết đệm Glycine-Tris pH 8,3 Triton X 100 Từ kết phương pháp tách chiết lựa chọn nghiên cứu sử dụng đệm glycine 100 mM, pH 8,3 gia nhiệt 95 oC phút, siêu âm phút 3.2.3.5 nh hư ng lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn CFU/25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho phản ứng real-time PCR LAMP Kết thể Bảng 3-14 sau: Bảng Error! No text of specified style in document.-14 nh hư ng thể t ch mẫu canh trường t ng sinh sử dụng đến khả n ng phát L monocytogenes kỹ thuật LAMP real-time PCR Thể tích mẫu (ml) Real time PCR 10 ức chế + 20 30 ức chế ức chế LAMP (quan sát kết tủa sản Khó phát phẩm phụ m t thường) + + + LAMP (điện di sản phẩm) + + + + Xác định sản phẩm LAMP phản ứng màu với HNB + + + + Qua thí nghiệm chọn thể tích mẫu lấy phân tích 10 ml 3.2.3.6 Thử nghiệm phản ứng LAMP tr n mẫu khác Trong thí nghiệm sử dụng loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14 giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP Kết thể Hình 319 19 Hình 3-17 Ảnh hưởng thời gian tăng sinh mẫu đến khả phát L monocytogenes dựa kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ Trong đ : (- Mẫu âm t nh phản ứng LAMP , , : L n lượt mẫu c ch, mẫu mayonair mẫu sữa không nhi m L monocytogenes , , : L n lượt mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , 7, , : l n lượt mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , 0, : L n lượt mẫu mayonair nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , , : L n lượt mẫu sữa nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , Qua thí nghiệm chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt ≥ 10 giờ, cho mẫu sữa mayonair ≥ 12 3.2.4 Đề xuất quy trình phân tích Từ kết thu đề xuất quy trình phân tích L monocytogenes dựa phản ứng LAMP sau: Tăng sinh chọn lọc 37oC/12 gi Lấy mẫu tách chiết DNA (ly tâm 10.000 g/3 phút, gia nhiệt 95 oC/5 phút, siêu âm phút, ly tâm 10.000 g/2 phút) Thực phản ứng LAMP 65oC/40-60 phút; 80oC/5 phút Đọc kết Hình 3-18 Sơ đồ quy trình phát nhanh L monocytogenes phát triển nghi n cứu 20 Tăng sinh chọn lọc: Cân 25 g thực phẩm cần phân tích, đồng hóa với 225 ml môi trường tăng sinh vô trùng (môi trường BLEB có thành phần: 17 g/l casein enzymic hydrolysate; g/l papaic digest of soyabean meal; g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4, 2,5 g l dextrose; g l cao nấm men;1,35 g l KH2PO4; 9,6 g/l Na2HPO4; pyruvate 1,2 g l, nalidixic acriflavin mg l) pH (tại 25°C) = 7,3 Các hóa chất hãng Himedia (hoặc tương đương trở lên) Ủ 37 oC 12 Lấy mẫu tách chiết DNA Lấy 10 ml canh trường tăng sinh chuyển sang ống falcon 15 ml sạch, ly tâm thu sinh khối tốc độ 10.000 g phút, chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml Rửa lần bổ sung ml nước deion, trộn đều, ly tâm 10.000 g phút, loại bỏ dịch thu sinh khối, rửa lần tương tự lần Bổ sung 100 l đệm chiết (đệm glycine 100 mM, pH 8,3), trộn đều, phá v tế bào 95 oC phút; siêu âm phút, ly tâm 10.000 g phút thu dịch chứa DNA cho phản ứng LAMP Hóa chất yêu cầu mức tinh khiết phù hợp cho sinh học phân tử Thực phản ứng LAMP Sử dụng µl DNA cho phản ứng LAMP Thực phản ứng LAMP với thể tích 20 l có thành phần sau: 20 mM Tris-HCl pH 8,8 25 °C; 10 mM (NH4)2SO4; 10 mM KCl; mM MgSO4; 0,1 % Triton X-100; 1,2 mM dNTP; 1,2 M betaine; 1,6 M mồi FIP BIP; 0,2 M mồi F3 B3; U Bst 2.0 DNA polymerase Phản ứng ủ nhiệt độ 65 °C thời gian 40-60 phút Dừng phản ứng ủ 80 °C phút Song song thực mẫu dương tính (thay DNA mẫu DNA tách chiết từ L monocytogenes EGD-e với nồng độ l), mẫu âm tính phản ứng LAMP (thay DNA từ mẫu nước cất) Các hóa chất yêu cầu mức tinh khiết phù hợp cho sinh học phân tử Đọc kết quả: Sau phản ứng LAMP, quan sát màu dung dịch phản ứng, mẫu chuyển dung dịch phản ứng từ màu xanh tím than sang màu xanh da trời mẫu dương tính (Hình 3-10) 3.2.5 n n n n Để xác định độ nhạy toàn quy trình phân tích, nhiễm mẫu mật độ khác dao động khoảng xấp xỉ 1-10 CFU/ 25 g mẫu bình 225 ml môi trường Tăng sinh 12 lấy mẫu xác định có mặt L monocytogenes Xác định mật độ xác nhiễm vào mẫu hậu kiểm canh trường giống sử dụng để nhiễm mẫu phương pháp trải đĩa môi trường O.A Listeria, sau quy ngược lại mật độ nhiễm ban đầu Sau tăng sinh 12 giờ, lấy mẫu xác định có mặt L monocytogenes phương pháp LAMP cấy trải đĩa sau lấy khuẩn lạc đặc trưng chạy real-time PCR Những mẫu dương tính với phản ứng real-time PCR coi mẫu nhiễm Kết thí nghiệm trình bày bảng sau: 21 Bảng 3-15 ộ nhạy quy trình phát L monocytogenes theo kỹ thuật LAMP Mật độ nhiễm (CFU/ml) 1-3 4-7 8-10 10-15 Số mẫu dƣơng tính với phản ứng LAMP/tổng số mẫu phân tích 5/5 5/5 5/5 3/3 Kết cho thấy độ nhạy quy trình phòng thí nghiệm đạt ≥ CFU 25 g mẫu 3.2.5 Thiết kế, sản xuất thử nghiệm sinh phẩm LAMP phát L monocytogenes 3.2.5.1 Thiết kế sinh phẩm Thành phần kít Bộ kít thiết kế gồm hai hợp phần cho hợp lý mặt k thuật, bảo quản tiện mặt sử dụng Thành ph n cho t ng sinh LAMP-L’MONO – M) Gồm 10 túi túi chứa 10,83 g môi trường BLEB Thành ph n cho tách chiết DNA phản ứng LAMP LAMP-L’MONO – D) - Dung dịch số 1: Đệm Glycine 0,1 M, pH 8,3 Thể tích x 1,5 ml - Dung dịch A: 33,33 mM Tris-HCl; 16,66 mM KCl; 13,33 mM MgSO4; 0,16 % Triton X-100; 1,66 mM dNTP, M betain, 2,66 M mồi FIP BIP; 0,33 µM mồi F3 B3; 200 µM HNB Thể tích 12 l, số lượng 10 ống eppendorf 0,5 ml - Dung dịch B: Bst 120 U (1 ống x 15 l) - Dung dịch C: Nước (ultrapure, DNAse, RNAse free) (1 ống x 50 µl) - Dung dịch D: Kiểm chứng dương tính: 20 monocytogenes với nồng độ 1000 l 3.2.5.2 l dung dịch DNA Listeria iều kiện bảo quản sinh phẩm Bộ sinh phẩm thiết kế gồm phần riêng biệt phần môi trường tăng sinh (LAMPL’MONO – M) bảo quản oC, phần loại hóa chất cho tách chiết phản ứng LAMP (LAMP-L’MONO – D) bảo quản điều kiện - 20 oC Theo hướng dẫn sử dụng bảo quản hóa chất thể chưa trộn lẫn thành hỗn hợp hoá chất cho phản ứng LAMP tách chiết DNA hoàn toàn bền nhiệt độ - 20 oC 3.2.5.3 Sản u t thử nghiệm sinh phẩm Bộ sinh phẩm sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm 3.2.6 Kiểm định sinh phẩm LAMP-L’MONO Bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO kiểm định Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm 30 mẫu thực phẩm nhiễm chủ động từ 5-250 CFU/25 g Xác định có mặt L monocytogenes theo phương pháp ISO 11290-1 : 1996 (thay đổi lần 1:2004) phương pháp sử dụng kít LAMP-L’MONO Kết kiểm định cho thấy sai khác mẫu nhiễm mật độ CFU 25 g thực phẩm cho kết dương tính với 22 phương pháp ISO cho kết âm tính với phương pháp LAMP Kết tính toán cụ thể số thông số độ nhạy độ đặc hiệu, độ xác Độ xác tương đối: (27+2)*100/(27+2+1)= 96,66 % AC = ((PA+NA)*100) (PA+NA+PD) = Độ nhạy tương đối: SE= PA *100 (PA+PD) = 27 *100 (27+1) = 96,43 % Độ đặc hiệu tương đối: SP = NA*100 (ND+NA) = 2*100 (0+2) = 100 % Tỷ lệ dương tính giả PN = ND * 100/(PA+NA+PD) = % 3.2.7 Ứng dụng thử nghiệm sinh phẩm Bộ sinh phẩm ứng dụng sử dụng Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội Thử nghiệm phân tích 30 mẫu thực phẩm lấy thị trường Hà Nội Sử dụng phương pháp phân tích song song, phương pháp sử dụng sinh phẩm đề tài, phương pháp PCR với cặp mồi hlyA 177 nhân đặc hiệu đoạn gen hlyA có kích thước 112 bp, phương pháp nuôi cấy theo TCVN 7700-1:2007 Kết cho thấy 30 mẫu thực phẩm lấy thị trường có 10 mẫu cho kết dương tính phương pháp Phương pháp sử dụng sinh phẩm có độ tương đồng 100% với hai phương pháp tham chiếu PCR TCVN 7700-1:2007 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án thu đƣợc kết sau: Đã phân lập 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung 10,87 % Trong có loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao xúc xich thịt hun khói c t lát Đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập cho thấy: 48 chủng L monocytogenes phân lập chia thành lineage, lineage I có 40 chủng lineage II có chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy gây dịch bệnh cao lineage II Các chủng phân lập chia thành CC có 19 chủng thuộc ECIV chủng thuộc ECI có nguy gây bùng phát dịch bệnh cao 48 chủng có tất 16 ST có ST1 đặc biệt nguy hiểm ST1 gây nhiều vụ bùng phát dịch lớn giới Đã thiết kế phản ứng LAMP cho phát nhanh L monocytogenes, bao gồm: thiết kế mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M Đã tối ưu quy trình phân tích trực tiếp L monocytogenes từ thực phẩm dựa phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu môi trường BLEB 37oC, tốc độ l c 150 vòng/phút thời gian 10 cho sản phẩm thịt 12 cho sản phẩm sữa mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm Quy trình phân tích đạt độ nhạy CFU/25 g với tổng thời gian phân tích 12-14 Đã thiết kế chế tạo thành công sinh phẩm LAMP-L’MONO phát nhanh Listeria monocytogenes thực phẩm Bộ sinh phẩm kiểm định cho kết có độ 23 tương đồng cao với phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 TCVN 7700-1:2007 Kiến nghị: Do nghiên cứu bước đầu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes Việt Nam nên số lượng chủng phân lập chưa nhiều Thiếu chủng phân lập từ người từ vụ dịch bệnh listeriosis chủng phân lập từ môi trường nhà máy nguyên liệu sản xuất thực phẩm Cần có nghiên cứu bổ sung mảng thiếu để có tranh hoàn thiện tình hình dịch tễ chủng L monocytogenes lưu hành Việt Nam phán đoán mối liên quan môi trường sản xuất, sản phẩm thực phẩm người bệnh loài vi khuẩn này, từ có biện pháp thích hợp phòng ngừa hạn chế tối đa dịch bệnh listeriosis Đối với sinh phẩm LAMP-L’MONO, số lượng mẫu thử nghiệm chưa nhiều, chủng loại mẫu chưa đa dạng, cần có nghiên cứu để phát triển tiếp kết đạt nghiên cứu này, bao gồm: - Thử nghiệm sản xuất chế phẩm dạng bột đông khô - Nghiên cứu thời gian bảo quản sinh phẩm - Phát triển mẫu nội chuẩn Từ đưa phương pháp thành phương pháp thay phương pháp nuôi cấy tốn nhiều thời gian nhân công, nhằm góp phần kiểm soát nhiễm tạp loài vi khuẩn nguy hiểm dễ dàng 24 [...]... nhiễm cao nhất là xúc xich và thịt hun khói c t lát 2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và lineage II có 8 chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có. .. thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả có độ 23 tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 và TCVN 7700-1:2007 Kiến nghị: Do đây mới chỉ là các nghiên cứu bước đầu về dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes tại Việt Nam nên số lượng chủng phân lập được chưa... các chủng phân lập từ người và từ các vụ dịch bệnh listeriosis cũng như các chủng phân lập từ môi trường nhà máy hoặc nguy n liệu sản xuất thực phẩm Cần có các nghiên cứu tiếp theo bổ sung các mảng còn thiếu trên để có thể có một bức tranh hoàn thiện về tình hình dịch tễ các chủng L monocytogenes đang lưu hành tại Việt Nam và các phán đoán về các mối liên quan giữa môi trường sản xuất, sản phẩm thực phẩm. .. tăng sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng real-time PCR, kết quả được thể hiện trên Bảng 3-4 sau: Bảng 3-4 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng cơ bản TSBYE TSBYE có không Kháng có sinh kháng sinh BLEB có kháng sinh BLEB không có kháng sinh Half fraser có kháng sinh UVM không có kháng sinh. .. và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 3-5 Bảng 3-5 nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại trƣ ng Ct môi BLEB có kháng sinh 31,57 ± 0,98 Half fraser có kháng sinh 33,29 ± 0,68 Qua thí nghiệm này, môi trường BLEB được chọn là môi trường cơ bản cho tăng sinh L monocytogenes 3.2.2.2 nh hư ng của một. .. mẫu thực phẩm lấy trên thị trường có 10 mẫu cho kết quả dương tính cả 3 phương pháp Phương pháp sử dụng bộ sinh phẩm có độ tương đồng 100% với hai phương pháp tham chiếu là PCR và TCVN 7700-1:2007 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án đã thu đƣợc những kết quả chính sau: 1 Đã phân lập được 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 % Trong đó có 2 loại thực phẩm có. .. nghiệm bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được ứng dụng sử dụng tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội Thử nghiệm phân tích trên 30 mẫu thực phẩm lấy trên thị trường Hà Nội Sử dụng 3 phương pháp phân tích song song, phương pháp sử dụng bộ sinh phẩm của đề tài, phương pháp PCR với cặp mồi hlyA 177 nhân đặc hiệu đoạn gen hlyA có kích thước 112 bp, và phương pháp nuôi cấy theo TCVN 7700-1:2007 Kết quả trên cho thấy trong. .. quy trình phân tích trực tiếp L monocytogenes từ thực phẩm dựa trên phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ l c 150 vòng/phút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU/25 g với tổng thời gian phân tích 12-14... phẩm và người bệnh về loài vi khuẩn này, từ đó có các biện pháp thích hợp trong phòng ngừa và hạn chế tối đa dịch bệnh listeriosis Đối với bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO, số lượng mẫu thử nghiệm chưa nhiều, chủng loại mẫu chưa đa dạng, còn cần có các nghiên cứu tiếp theo để phát triển tiếp các kết quả đã đạt được của nghiên cứu này, bao gồm: - Thử nghiệm sản xuất chế phẩm dưới dạng bột đông khô - Nghiên cứu. .. trình phát hiện L monocytogenes theo kỹ thuật LAMP Mật độ nhiễm (CFU/ml) 1-3 4-7 8-10 10-15 Số mẫu dƣơng tính với phản ứng LAMP/tổng số mẫu phân tích 5/5 5/5 5/5 3/3 Kết quả trên cho thấy độ nhạy của quy trình trong phòng thí nghiệm đạt được ≥ 1 CFU 25 g mẫu 3.2.5 Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L monocytogenes 3.2.5.1 Thiết kế bộ sinh phẩm Thành phần bộ kít Bộ kít được thiết