Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng Dot Blot với các Protein GP120, GP41, P24 tái tổ hợp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔNG QUAN Mở đầu -1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS thế giới -1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS -1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS thế giới 1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cƣ́u HIV Việt Nam 1.3 Đặc điểm HIV 1.3.1 Giới thiệu chung -1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV. 1.4 Phân loại HIV 1.4.1 HIV-1 -1.4.2 HIV-2 -1.5 Đặc điểm sinh vật học HIV -1.6 Nguồn truyền nhiễm và đối tƣợng cảm thụ HIV 1.7 Các phƣơng thức lây truyền HIV 1.8 Sƣ̣ xâm nhập tế bào và nhân lên của HIV -1.9 Đáp ƣ́ng miễn dị ch của thể nhiễm HIV/AIDS 1.9.1 Nhƣ̃ng thay đổi miễn dị ch nhiễm HIV 1.9.2 Suy giảm miễn dị ch nhiễm HIV -1.9.3 Diễn biến huyết ngƣời nhiễm HIV/AIDS -1.10 Các kĩ thuật phát hiện HIV thể -1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt HIV -1.10.2 Phát hiện kháng nguyên HIV 1.10.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử xét nghiệm HIV 1.10.4 Phát hiện gián tiếp sự có mặt HIV -1.10.5 Các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV -1.10.6 Nghiên cƣ́u các protein tái tổ hợp để tạo kit chẩn đoán 1.11 Điều trị HIV/AIDS - 5 10 10 10 15 15 18 18 19 19 20 23 23 24 26 28 28 29 30 31 34 35 37 40 Đối tƣợng, vật liệu - 40 Đối tƣợng 40 Các sinh phẩm 40 Hóa chất vật liệu 40 Dung dị ch và môi trƣờng 40 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 2.1.5 Thiết bị và máy móc 2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u 2.2.1 Phƣơng pháp điện di gel và polyacrylamide 2.2.2 Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp E coli chủng BL21 -2.2.3 Tinh chế protein dung hợp bằng cột Probond Nikel Resin -2.2.4 Phƣơng pháp Western blot -2.2.5 Đị nh lƣợng protein bằng phƣơng pháp Bradford -2.2.6 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp120 -2.2.7 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp gp41 -2.2.8 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợp p24 -2.2.9 Phƣơng pháp chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV CHƢƠNG III KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC 3.1 Biểu hiện protein tái tổ hợp gp120 -3.2 Tinh chế protein tái tổ hợp -3.3 Nghiên cƣ́u khả phản ƣ́ng gp120 tái tổ hợp với kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân HIV bằng western blot 3.4 Kết quả biểu hiện, tinh sạch gp41 HIV-1 phân type CRF01_AE 3.4.1 Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và xác đị nh trạng thái gp41 tái tổ hợp -3.4.2 Tinh sạch gp41 tái tổ hợp 3.5 Kiểm tra khả phát hiện khá ng thể kháng HIV huyết bệnh nhân bằng western blot 3.6 Biểu hiện và tinh sạch protein p24 3.7 Phát hiện kháng thể huyết bệnh nhân -3.8 Kết quả nghiên cƣ́u chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV KẾT LUẬN . KIẾN NGHỊ PHỤ LỤC 44 45 45 46 47 50 50 53 53 54 55 57 57 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh 59 61 61 62 65 66 66 66 68 75 77 http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 MỞ ĐẦU Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đƣơng đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chƣa có vacxin phòng bệnh chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu HIV/AIDS không nguyên nhân cƣớp hàng triệu sinh mạng giới mà hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh đời sống xã hội làm ảnh hƣởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống quốc gia Theo báo cáo Tổ chức phòng chống AIDS Liên Hợp Quốc (UNAIDS) Tổ chức Y tế giới (WHO), đến năm 2008 giới có 33,4 triệu ngƣời sống chung với HIV, năm có 2,7 triệu ngƣời nhiễm mới triệu ngƣời tử vong AIDS Tại Việt Nam, từ ca nhiễm đƣợc thông báo vào năm 1990 thành phố Hồ Chí Minh, số lƣợng ngƣời nhiễm HIV ngày tăng lên Tính đên 31/3/2009, toàn quốc có 144.483 ngƣời nhiễm HIV, 30.996 ngƣời chuyển sang giai đoạn AIDS sống, 42.447 ngƣời tử vong AIDS Có hai type HIV gây bệnh ngƣời HIV-1 HIV-2 Tuy nhiên, HIV-2 lƣu hành châu Phi, HIV-1 thì lƣu hành rộng rãi gây bệnh chủ yếu tất châu lục Dựa vào sự biến đổi về gen HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 thành nhóm M, N O Các nhóm có thể đƣợc chia thành phân type, phân type lại có phân vùng địa lý khác Ngoài phân type, thể tái tổ hợp phân type (CRF) xuất hiện ngày nhiều làm cho việc nghiên cứu về HIV-1 ngày trở nên phức tạp khó khăn [41] Hiểu đƣợc sự lƣu hành các phân type HIV nhƣ các thể tái tổ hợp chúng vùng địa lý khác không có ý nghĩa định cho việc nghiên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 cứu triển khai vắc xin phòng chống HIV mà có giá trị sản xuất kit chẩn đoán thích hợp cho vùng Các công trình nghiên cứu về HIV có sự phân biệt ƣu tiên theo địa lý nƣớc giàu nghèo Phân type C xuất hiện chủ yếu châu Phi, châu Á phân type CRF01_AE lƣu hành chủ yếu các nƣớc khu vực Đông Nam Á, nhiên hầu hết nghiên cứu về HIV hiện đều tập trung vào phân type B, vì phân type lƣu hành chủ yếu các nƣớc phát triển Nghiên cứu để biết rõ về đặc tính di truyền kháng nguyên phân typ HIV lƣu hành chủ yếu Việt Nam từ đó chế tạo bộ kit chẩn đoán huyết học có độ nhạy độ đặc hiệu cao sở kháng nguyên tái tổ hợp GP120, GP41 P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lƣu hành Việt nam mục tiêu đề tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV dot blot với protein GP120, Gp41 P24 tái tổ hợp” Đề tài đƣợc đặt với mục tiêu cụ thể sau: - Tạo đƣợc kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ tinh sạch, độ đặc hiệu đảm bảo cho chế tạo kit chẩn đoán - Xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán HIV dot blot,độ đặc hiệu cao có thể sử dụng cho chẩn đoán HIV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1 Lịch sử trình phát HIV/AIDS Quá trình diễn biến HIV/AIDS giới chia giai đoạn [21] - Thời kỳ “yên lặng” 1970-1981 HIV bắt đầu xuất hiện âm thầm từ năm 70 kỷ XX Ngƣời ta tìm thấy kháng thể (KT) kháng HIV mẫu máu đƣợc bảo quản Zaire (1959) Mỹ (1970) - Thời kỳ phát hiện virus 1981-1985 Ở thời kỳ này, nhà khoa học phân lập đƣợc virus, xác định đƣợc phƣơng thức truyền bệnh phát triển kỹ thuật phát hiện virus + Năm 1981, Trung tâm kiểm soát phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) xác định đƣợc bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) giới dựa sự phát hiện mô tả bệnh bác sỹ Michạel Gottlieb về niên đồng tính luyến bị viêm phổi nặng Pneumocystis carinii Los Angeles 226 nam niên đồng tính luyến mắc ung thƣ da Sarcoma Kaposi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 Điều đặc biệt bệnh nhân đều có sự suy giảm nặng nề hệ thống miễn dịch, về số lƣợng chức tế bào miễn dịch, quan trọng sự giảm tế bào TCD4 + Năm 1982, nhiều nơi công bố bệnh tƣơng tự nhƣ bệnh nhân phải truyền máu nhiều lần, các đối tƣợng nghiện chích ma tuý, ngƣời mẹ đứa họ đẻ Cuối 1982, dựa trƣờng hợp AIDS đƣợc thông báo, CDC đƣa tiêu chuẩn về triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh AIDS chƣa có phƣơng pháp xét nghiệm nguyên + Năm 1985, Hội nghị danh pháp quốc tế thống gọi tên virus LAV (Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III), ARV (AIDS Related Virus) virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human Immunodefiency Virus- HIV) + Năm1984-1985, xác định kỹ thuật phát hiện KT kháng HTLV III chuẩn hoá bộ sinh phẩm phát hiện KT kháng HIV kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym ELISA để sàng lọc máu phát hiện lâm sàng - Thời kỳ 1985- nay: Đây thời kỳ toàn giới chống AIDS + Năm 1987, thử nghiệm lâm sàng với AZT (Azidothymidine) nhƣ một thuốc chống Retrovirus + Năm 1989, đƣa các hƣớng dẫn điều trị AZT cho ngƣời nhiễm HIV bệnh nhân AIDS sở số lƣợng tế bào TCD4 ngƣời bệnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 + Năm 1993, CDC đƣa tiêu chuẩn để xác định bệnh AIDS Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn cao họcK12 1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS giới Đại dịch HIV/AIDS xuất hiện chƣa lâu, mới bắt đầu vào năm 70-80 kỷ XX nhƣng nhanh chóng lan tràn toàn cầu, công mọi đối tƣợng không phân biệt lứa tuổi, nghề nghiệp, địa vị xã hội nhƣ phụ nữ, trẻ em, niên, ngƣời có tuổi, ngƣời đồng tính luyến ái, ngƣời nghiện chích ma tuý Dịch liên tục phát triển về không gian thời gian trở thành đại dịch nguy hiểm Đại dịch gồm nhiều vụ dịch xảy nƣớc, lục địa, có phƣơng thức lây truyền, biểu hiện lâm sàng đặc trƣng riêng phụ thuộc vào nguồn gốc virus, đối tƣợng nhiễm, điều kiện kinh tế xã hội tập quán nƣớc Ban đầu xuất hiện, dịch chủ yếu xảy các nƣớc công nghiệp phát triển Bắc Mỹ, Úc, Tây Âu, thành phố lớn, ngƣời đồng tính luyến ái ngƣời nghiện chích ma tuý Từ đó, dịch lan tràn khắp các nƣớc, gây tác hại to lớn châu Phi, vùng Caribe với số lƣợng ngƣời nhiễm HIV cao Đến nay, khu vực Nam phi vùng có số lƣợng bệnh nhân cao giới riêng khu vực Sahara có tới 25,8 triệu ngƣời nhiễm HIV, chiếm 64% tổng số ngƣời nhiễm HIV giới Ở Châu Á, dịch HIV/AIDS đến muộn cuối năm 80 kỷ XX nhƣng phát triển nhanh với phƣơng thức lây truyền đa dạng phản ánh tính đa dạng về xã hội, kinh tế văn hoá.Theo dự đoán WHO, đại dịch HIV/AIDS có xu dịch chuyển về Châu Á mà điểm nóng Thái lan, Ấn Độ, Campuchia Indonesia.Vì cần phải có các chƣơng trình khống chế dự phòng HIV/AIDS kịp thời, mạnh mẽ Một tình trạng đáng báo động 70% ngƣời dân Ontania đảo Bomeo, Indonesia kết xét nghiệm HIV dƣơng tính Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyễn Quang Anh http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH. .. Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV dot blot với protein GP120, Gp41 P24 tái tổ hợp Đề tài đƣợc đặt với mục tiêu cụ thể sau: - Tạo đƣợc kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ... đó chế tạo bộ kit chẩn đoán huyết học có độ nhạy độ đặc hiệu cao sở kháng nguyên tái tổ hợp GP120, GP41 P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lƣu hành Việt nam mục tiêu đề tài “Nghiên