Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường việt nam

(Thông tin đưa lên trang Web) Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 Nghiên cứu sinh: Phùng Thị Thủy Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Lê Quang Hòa 2. PGS.TS. Tô Kim Anh Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa +à Nội 7Ï07²7.Â78°10Þ,ê8°1È1 1. Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất là xúc xich và thịt hun khói cắt lát. 2. Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L. monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới. 3. Đã thiết kế được phản ứng LAMP cho phát hiện nhanh L. monocytogenes, bao gồm: thiết kế bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP là nhiệt độ 65oC, thời gian 4060 phút, nồng độ betain 0,9 M. 4. Đã tối ưu được quy trình phân tích trực tiếp L. monocytogenes từ thực phẩm dựa trên phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu trong môi trường BLEB ở 37oC, tốc độ lắc 150 vòngphút trong thời gian 10 giờ cho sản phẩm thịt và 12 giờ cho sản phẩm sữa và mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm. Quy trình phân tích đạt độ nhạy 1 CFU25 g với tổng thời gian phân tích 1214 giờ. 5. Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMPL’MONO phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm. Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 112901: 1996 và TCVN 77001:2007. Hà Nội, ngày 28 tháng 3 năm 2016 T± p thÇ Km ß ng d¯ n 1JKLrQFíXVLQK TS. Lê Quang Hòa PGS.TS. Tô Kim Anh Phùng ThÏ Thë yINFORMATION ON NEW CONCLUTION OF DOCTORAL THESIS (Information will be posted on the Website) Name of thesis: Study on rapid method for direct detection and molecular epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from Vietnam foods Specialization: Biotechnology Code No.: 62420201 Name of PhD. student: Phung Thi Thuy Advisor: 1. Dr. Le Quang Hoa 2. Assoc. Prof. Dr. To Kim Anh Training Institution: Hanoi University of Science and Technology Summary of the new contributions of the Thesis 1. Fifty nine strains of L. monocytogenes were isolated from 543 Vietnam food samples. The average infection rate of L. monocytogenes in foods was 10.87% with the highest found in sausage and slide meat products. 2. Forty eight strains out of 59 isolated of L. monocytogenes were divided into two lineages, of which 40 isolates belonging to lineage I and 8 isolates belonging to lineage II. The lineage I strains was considered high risky than those of the lineage II. On the other hand, the isolates could be divided into 9 clonal clusters, among them 19 ECIV strains and one ECI strain were seen as outbreak causing strains. The 48 isolates also can be divided into 16 ST, of which ST1 strains were highly dangerous, causing many sever outbreaks worldwide. 3. A molecular method for rapid detection of L. monocytogenes based on LAMP reaction was established: a set of LAMP primers was designed to amplify inlJ gene, optimal condition for the reaction was 65 °C for 4060 min. with betaine concentration of 0.9 M. 4. The direct detection procedure of L. monocytogenes based on the LAM reaction was optimized, including enrichment for the bacteria in BLEB media at 37 °C, 150 rpm for 10 and 12 hours respectively for meat and dairy products; modified method for rapid DNA extraction. The sensitivity of detection procedure attained 1 CFU L. monocytogenes 25 g food with total analysis time of 1214 hours. 7. A LAMPLMONO kit for L. monocytogenes rapid detection based on LAMP technique was designed and validated and found to be conformed with ISO 112901: 1996 and TCVN 7700 1: 2007 methods. Hanoi, 28th, March, 2016 Advisor: PhD. Student Le Quang Hoa To Kim Anh Phung Thi ThuyTRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ 1. Tên tác giả: Phùng Thị Thủy Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam 2. Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 3. Tên cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 4. Mục đích và đối tượng nghiên cứu của luận án  Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam. Thiết kế, chế tạo thử nghiệm và kiểm định bộ sinh phẩm LAMP phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền.  Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thực phẩm: Tổng số 543 được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội Chủng vi khuẩn phân lập: Tổng số 48 chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm đang lưu hành tại Việt Nam, Chủng vi khuẩn chuẩn: 17 chủng vi sinh vật khác ngoài L. monocytogenes 5. Các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng  Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm  Điện di DNA trên gel agarose  Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các housekeeping gen cho giải trình tự  Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch GeneJETTM PCR Purification (Fermentase)  Phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp  Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen được giải trình tự 2 chiều.  Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4  Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP  Phản ứng Realtime PCR  Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn  Kiểm định bộ sinh phẩm Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 77001: 2007 và ISO 11290 1:1996  Xây dựng cây phân loại bằng phần mềm ClustalW 6. Các kết quả chính và kết luận  Các kết quả chính đã đạt được trong đề tài nghiên cứu: Đã phân lập được 59 chủng L. monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 %. Trong đó có 2 loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao nhất (lần lượt là 30,34 % và 14,48 %). Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L. monocytogeneses phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và lineage II có 8 chủng. Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II. Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có nguy cơ gây bùng phát dịch bệnh cao. 48 chủng có tất cả 16 ST trong đó có ST1 đặc biệt nguy hiểm vì ST1 đã từng gây ra nhiều vụ bùng phát dịch lớn trên thế giới. Đã Thiết kế được bộ mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ với độ nhậy trên mẫu vi khuẩn thuần là 16 CFU phản ứng, trên canh trường tăng mẫu xúc xích là 336 CFUml. Bộ mồi cho độ đặc hiệu, độ bao trùm cao (100 % số chủng nghiên cứu) Đã tối ưu được điều kiện cho phản ứng LAMP đó là thực hiện phản ứng tại nhiệt độ 65oC, thời gian 4060 phút, nồng độ betain là 0,9 M. Đã tối ưu được điều kiện tăng sinh cho phát hiện L. monocytogenes là: sử dụng môi trường BLEB (17 gl casein enzymeic hydrolysate; 3 gl papaic digest of soyabean meal; 5 gl NaCl; 2,5 gl K2HPO4, 2,5 gl dextrose; 6 gl cao nấm men;1,35 gl KH2PO4; 9,6 gl Na2HPO4; pyruvate 1,2 gl, nalidixic và acriflavin đều là 5 mgl), tăng sinh ở 37oC tốc độ lắc 150 vòng phút, thời gian 10 giờ (với sản phẩm thịt); 12 giờ (với sản phẩm sữa và mayonair). Đã tìm được điều kiện tách chiết nhanh thu DNA cho phản ứng LAMP từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm đó là sử dụng đệm glycine –tris 100 mM pH 8,3, gia nhiệt 5 phút tại 95oC, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g trong 3 phút thu dịch DNA cho phản ứng LAMP. Đã xây dựng được quy trình phân tích nhanh L. monocytogenes monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP với độ nhạy đạt 1 cfu25 g với tổng thời gian phân tích khoảng 1214 giờ. Đã thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP mang tên LAMPL’MONO. Đã kiểm định và ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMPL’MONO cho kết quả có độ tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 112901: 1996 (sửa đổi lần 1: 2004) và TCVN 77001:2007. Độ đặc hiệu đạt 100 % (phòng thí nghiệm, trên mẫu thực và kiểm định). Độ chính xác (ổn định) đạt 100 % (phòng thí nghiệm, mẫu thực) và đạt 96 % (kiểm định), tỷ lệ dương tính giả 0% (phòng thí nghiệm và mẫu thực).  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cho thấy thực tế tỷ lệ nhiễm vi khuẩn L. monocytogenes trên thực phẩm khá cao, có những dòng phân lập được có khả năng gây dịch bệnh lớn. Tuy rằngcho đến hiện nay mới chỉ có công bố về một vài trường hợp bệnh nhên bị listeriosis, nhưng nếu không kiểm soát tốt vi khuẩn này trong chuỗi cung cấp thực phẩm thì đây có thể sẽ là nguy cơ lớn về dịch bệnh cho người tiêu dùng. Kết quả đề tài này cũng đã chế tạo thành công bộ kít phân tích phát hiện nhanh L. monocytogenes. Bộ kít này cho kết quả phân tích tương đồng với các phương pháp tiêu chuẩn như TCVN và ISO. Thêm nữa bộ kít còn có nhiều ưu điểm hơn các phương pháp hiện nay đang sử dụng về giá thành, thời gian phân tích cũng như độ nhạy, độ đặc hiệu. Những ưu điểm này sẽ góp phần tích cực vào việc giảm thiểu sự tạp nhiễm loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực phẩm nhằm giảm tổn thất cho nhà sản xuất cũng như người tiêu dùng. Tập thể hướng dẫn Nghiên cứu sinh TS. Lê Quang Hòa PGS.TS. Tô Kim Anh Phùng Thị Thủy1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Listeria monocytogenes là loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm rất nguy hiểm, đặc biệt với tỷ lệ tử vong lên đến 30%. Bệnh do L. monocytogenes gây ra được gọi chung là listeriosis. Đối tượng có nguy cơ bị nhiễm bệnh này thường là những người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi. Nếu không được điều trị kịp thời bằng kháng sinh, bệnh nhân có thể bị nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và tử vong. Vi khuẩn L. monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh. Chúng được tìm thấy ở nhiều nơi như đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, trong phân người hoặc phân động vật. Chúng có thể sống và tăng trưởng chậm ở các điều kiện kh c nghiệt về nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH và hoạt độ nước. Đặc biệt loài vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ lạnh (010oC). Chính vì những lý do đó mà khả năng nhiễm L. monocytogenes trên thực phẩm là khá cao, đặc biệt các sản phẩm được bảo quản lạnh trong thời gian dài. Nhiều loại thực phẩm được bày bán trong siêu thị hiện nay là các thực phẩm ăn sẵn. Thêm nữa càng ngày người ta lại càng muốn sử dụng các loại thực phẩm không có chất bảo quản hoặc không bị gia nhiệt để giữ được nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu. Những sản phẩm như vậy thường được bảo quản lạnh trước khi sử dụng. Vì vậy, các sản phẩm thực phẩm loại này có thể có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Rất nhiều các vụ ngộ độc và triệu hồi sản phẩm do thực phẩm nhiễm L. monocytogenes trên kh p thế giới đã được thông báo. Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các vụ dịch lớn trên thế giới cho thấy, có những chủng L. monocytogenes có khả năng gây bệnh và gây bùng phát dịch rất lớn, bên cạnh đó cũng có những kiểu huyết thanh hầu như không có khả năng gây bệnh và gây dịch. Cho đến thời điểm này chưa có công bố nào về dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm tại Việt Nam. Khả năng gây bệnh và gây dịch của L. monocytogenes nhiễm trong các thực phẩm tại Việt Nam vẫn là một ẩn số. Phương pháp ISO 112901:1996 phát hiện L. monocytogenes là phương pháp nuôi cấy. Một số các phương pháp sinh học phân tử như PCR, realtime PCR hoặc các phương pháp miễn dịch (ELISA) cũng đã được tiêu chuẩn hóa. Mấy năm trở lại đây, cùng với sự ra đời của một số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh đã được đơn giản hóa thêm một bước. LAMP là k thuật khuếch đại đ ng nhiệt được sử dụng phổ biến hơn cả. Ngoài ra, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm của phản ứng LAMP không cần điện di là một trong các ưu điểm nổi trội của phương pháp này, giúp đơn giản hóa và rút ng n thời gian phân tích. K thuật này đã nhanh chóng được ứng dụng để phát hiện L. monocytogenes trong thực phẩm ở nhiều nghiên cứu trên thế giới. Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 77001:2007 phát hiện Listeria monocytogenes là phương pháp nuôi cấy, sau đó khuẩn lạc đặc trưng được kh ng định bằng các phản ứng sinh hóa. Đã có một số nghiên cứu về phương pháp PCR và que thử s c2 ký miễn dịch nhằm phát hiện vi khuẩn này, tuy nhiên thời gian phân tích còn dài hoặc yêu cầu cao về trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng được nhu cầu phân tích phát hiện trong thực tế sản xuất. Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi nghiên cứu đề tài có tên là “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện nhanh Listeria monocytogenes và phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của chủng phân lập được trong một số thực phẩm có nguy cơ cao trên thị trường Việt Nam”. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của luận án  Phân tích được đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng L. monocytogenes phân lập được từ các loại thực phẩm có nguy cơ cao tại Việt Nam.  Xây dựng được một bộ sinh phẩm phát hiện nhanh L. monocytogenes trong các loại thực phẩm ăn liền dựa trên k thuật LAMP. 3. Những đóng góp mới của luận án  Lần đầu tiên công bố các kết qủa nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của L. monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam  Là công trình đầu tiên sử dụng gen inlJ làm gen đích trong phát triển k thuật LAMP cho phát hiện L. monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu của phép phân tích 4. Bố cục của luận án Luận án bao gồm 123 trang trong đó có 2 trang mở đầu, 38 trang tổng quan, 9 trang vật liệu và phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết quả. NỘI DUNG CHÍNH Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về L. monocytogenes. Luận án đề cập đến các vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của loài L. monocytogenes, từ đó cho thấy đây là một loài có khả năng phân bố rộng trong thực phẩm môi trường. Các thống kê cũng cho thấy có rất nhiều các công bố về các vụ gây dịch bệnh listeriosis do L. monocytogenes gây lên có liên quan đến các loại thực phẩm khác nhau trong đó chủ yếu là các loại thực phẩm có bảo quản lạnh trong thời gian dài. Chính vì vậy trong luận án này phần phân lập cũng được tiến hành chủ yếu trên các mẫu thực phẩm có quá trình bảo quản lạnh trước khi sử dụng. 1.2 Tổng quan về các phƣơng pháp phân loại dƣới loài L. monocytogenes Các phương pháp phân loại dưới loài dựa theo kiểu hình như enzyme hoặc kháng thể thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp trong các nghiên cứu dịch tễ học các chủng L. monocytogenes gây dịch bệnh. Các phương pháp phân loại dưới loài dựa trên kiểu gen hiện nay khá phổ biến. Tuy nhiên kết quả phân loại phụ thuộc rất lớn vào cơ sở dữ liệu liên quan cho phân tích so sánh. MLST là một phương pháp phân loại dưới loài đơn giản và được sử dụng khá phổ biến. Cơ sở dữ liệu cho phương pháp MLST khá phong phú. Chính vì vậy luận án này sử dụng phương pháp MLST và sơ sở dữ liệu của viện3 Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học các loài L. monocytogenes phân lập được. Từ đó đánh giá nguy cơ gây dịch bệnh của loài vi khuân này trên thực phẩm Việt Nam. 1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp phát hiện L. monocytogenes Hiện nay có khá nhiều các phương pháp được sử dụng trong phân tích phát hiện L. monocytogenes. Ngoài các phương pháp tiêu chuẩn như phương pháp nuôi cấy theo ISO hoặc TCVN còn có các phương pháp nhân gen như realtime PCR hoặc các phương pháp sử dụng kít miễn dịch được tiêu chuẩn hóa. Tuy nhiên các phương pháp hiện nay có thời gian phân tích khá dài hoặc yêu cầu sử dụng các trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa đáp ứng được yêu cầu của việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm này trong thực tế sản xuất. Chính vì vậy Luận án này đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao. Chƣơng II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu  Mẫu thực phẩm Mẫu được lấy tại các siêu thị trên địa bàn Hà Nội Chủng vi sinh vật Một số chủng vi khuẩn được lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Hóa chất Hóa chất cho phản ứng PCR, LAMP, Real time PCR, điện di DNA, tách chiết DNA, nuôi cấy vi khuẩn Môi trường: Môi trường cơ bản cho tăng sinh; môi trường phân lập L. monocytogenes Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP 2.2. Các thiết bị sử dụng chủ yếu Một số thiết bị sử dụng cho PCR, realtime PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh và lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu  Phân lập L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm  Phản ứng PCR khẳng định L. monocytogenes và khuếch đại các gen giữ nhà cho giải trình tự  Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh sạch GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.  Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại dưới loài MLST và cơ sở dữ liệu của viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.frmlst)  Giải trình tự gen: Tiến hành tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Mỗi trình tự gen được giải trình tự 2 chiều.  Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4  Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy của phản ứng LAMP  Phản ứng Realtime PCR  Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn  Kiểm định bộ sinh phẩm  Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm  Phương pháp phát hiện L. monocytogenes theo TCVN 77001: 2007 và ISO 11290 1:19964 1 2 A B Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập từ một số thực phẩm Việt Nam 3.1.1. Phân lập L. monocytogenes từ các mẫu thực phẩm Trong nghiên cứu này, các mẫu thực phẩm được tăng sinh trên môi trường Half Fraser, những mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình 1 Hình 31 A) được cấy trải trên môi trường RAPID’L.mono (Biorad). Các mẫu thực phẩm dương tính với L. monocytogenes là những mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 31 B) và có ít nhất một khuẩn lạc nghi ngờ được kh ng định dương tính bằng k thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu LM1LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp. (Hình 32). Hình 31 Kết quả phân lập L. monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono. A: T ng sinh trong môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu . : Hình thái khuẩn lạc L. monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono các khuẩn lạc màu anh đen không c halo màu vàng tương ứng v i các khuẩn lạc nghi ngờ là L. monocytogenes. Hình 32 Kết quả khẳng định bằng PCR các khuẩn lạc L. monocytogenes giả định phân lập được tr n môi trường RAPID’L.mono : Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng 7 được khẳng định là L. monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi ngờ từ một mẫu sushi : mẫu âm t nh : thang chuẩn 00 bp O’GeneRulerTMcủa Fermentas 702 bp5 Tổng hợp các kết quả phân tích phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm đã phân tích từ năm 2011 đến 2015 được trình bày trong Bảng 31 sau. Bảng 31 Tổng hợp kết quả phát hiện L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm tại Việt Nam trong khoảng thời gian từ 0 đến 0 Loại thực phẩm Số lƣợng mẫu thực phẩm Số lƣợng chủng phân lập đƣợc Tỷ lệ nhiễm (%) Xúc xích 145 21 14,48 Các loại thịt hun khói 112 34 30,36 Thịt sống 43 1 2,33 Cá, tôm, cua, ốc 49 1 2,04 Bơ, sữa thanh trùng 45 1 2,22 Rau ăn sống 37 0 0 Sushi 52 1 1,92 Bánh mỳ kẹp thịt, hoa quả dầm 29 0 0 Nem chua 31 0 0 Tổng cộng 543 59 10,87 Có tổng số 59 543 mẫu được phát hiện là nhiễm L. monocytogenes. Trong đó các mẫu thịt hun khói và xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao nhất. 3.1.2. Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L. monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm Việt Nam Kết quả phân lập được 59 chủng L. monocytogenes, tuy nhiên trong quá trình giữ giống, một số chủng phân lập được đã bị chết, những chủng còn lại được tăng sinh, tách chiết DNA và tiến hành phản ứng PCR với các bộ mồi nhân 7 đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene). Tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự gen tại Công ty Macrogen (Hàn Quốc). Dựa vào trình tự thu được, tra cứu các kiểu trình tự tương ứng với các đoạn gen. Tổ hợp các kiểu trình tự của 7 đoạn gen tra cứu được kiểu trình tự (ST), các dòng phức hợp (clone complex CC) và các dòng giống (ligneage) tương ứng của chủng phân lập. Tra cứu kiểu trình tự từng đoạn gen giữ nhà của 48 chủng L. monocytogenes phân lập được trên ngân hàng dữ liệu được các kiểu trình tự tương ứng của từng gen. Tổ hợp kiểu trình tự 7 đoạn gen của từng chủng phân lập là một kiểu trình tự (ST), một dòng phức hợp (CC) và thuộc một dòng giống. Từ các kiểu ST này phân loại 48 chủng phân lập được thành 16 nhóm có kiểu ST khác nhau. Nối 7 đoạn gen giữ nhà của mỗi nhóm với nhau, so sánh trình tự 7 đoạn gen của 16 nhóm này với 25 trình tự 7 đoạn gen tương ứng của các chủng đã từng gây dịch bệnh listeriosis trên thế giới. Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô6 hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000. Xây dựng được cây phân loại như Hình 33. Hình 33 Cây phân loại các nh m chủng L. monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L. monocytogenes phân lập được từ thực phẩm Việt Nam Chữ đen: Các chủng L. monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b trình tự 7 đoạn gen giữ nhà tr n ngân hàng dữ liệu MLST Kết quả cho thấy, đã xuất hiện dòng L. monocytogenes (chủng ký hiệu M49 phân lập từ thịt ba rọi xông khói) có trình tự các gen cấu trúc giống hệt các chủng có tần suất cao gây các vụ dịch lớn trên thế giới. Nhóm 1 chiếm 17 48 chủng có trình tự 7 đoạn gen giống hệt với trình tự các đoạn gen tương ứng của một số chủng gây ra vụ thai lưu năm 2005 tại Nga, vụ dịch tại Italia năm 1997. Và gần giống trình tự các đoạn gen tương ứng từ chủng phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993. Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các vụ dịch nhỏ trên thế giới. 3.2. Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP 3.2.1. Xây dựng phản ứng LAMP 3.2.1.1. Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ7 Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng trình tự gen inlJ của chủng chuẩn L. monocytogenes EGDe có số hiệu emb|AL591984.1 cho thiết kế mồi LAMP. Kiểm tra độ tương đồng của trình tự gen inlJ đưa vào thiết kế mồi so với các trình tự gen trên ngân hàng gen bằng phần mềm BlastN, cho thấy trình tự gen inlJ sử dụng cho thiết kế mồi LAMP của chủng này có độ tương đồng khá cao với trình tự gen inlJ với các chủng L. monocytogenes đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI. Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 để thiết kế mồi. Lựa chọn các bộ mồi theo một số tiêu chí chính đã được khuyến cáo trong hướng dẫn sử dụng phần mềm https:primerexplorer.jpev4_manualpdfPrimerExplorerV4_Manual_1.pdf. Đã lựa chọn được 8 bộ mồi như bảng 32. Bảng 3 2. Trình tự các bộ mồi LAMP được thiết kế để khuếch đại gen inlJ Tên mồi Trình tự (5’3’) 1F3 CATGGTTTCAAACCCGCT 1B3 AATGCTGCTGCTACCTCT 1FIP GTTGGTTGAGTTGAGCTTGTTTCTTTTTAACATTCGCAGCAACG 1BIP ACACACTCAAAGCCGGTCAATTTTAGCAAAATTGTCATCAGGAA 2F3 ACAAGCTCAACTCAACCAA 2B3 GTTATGGATGAATTATGGCAATC 2FIP TGTCATCAGGAAACCAGTCGTTATTTTCTATAAAAAACACACTCAAAGCC 2BIP GCTTCAGAGGTAGCAGCAGCTTTTCTTGTTAGAGTAGCTAGTTGTTCT 3F3 GTTTCCTGATGACAATTTTGC 3B3 TTTGGCTAAGATCAAGGGT 3FIP AGTAGCTAGTTGTTCTTCGCTGATTTTTAGAGGTAGCAGCAGCATT 3BIP TCATCCATAACCGATATGACTGGTTTTTGGTAATGTTGTTACTTGTGCA 4F3 TGCAAGCAACTGACACTA 4B3 GGGTTACGTCAAGGTTTGT 4FIP TACCAGTCATATCGGTTATGGATGATTTTTCAGCGAAGAACAACTAGC 4BIP TTGCACAAGTAACAACATTACCACCTTTTTATTTGAATCACATGCCAGAT 5F3 GCGACACGAACAAACTCA 5B3 CAGTCTAAGGTTGTTAATTGAGT 5FIP ATTTCGGTTAAGGTGTTGCGCTTTTATGTAAGTCAAAATCCACTGTT 5BIP ATGTCAGCCACAATACACAATTAACTTTTGGTGTCACATCTAATTTGGTG 6F3 CCGCTTACAAAATTAACCTACT 6B3 AAGCTACAGTCTAAGGTTGT 6FIP TTGCGCGCGCAGTTTAAATAAGTTTTCGACACGAACAAACTCAC 6BIP CCGAAATAGATGTCAGCCACAATACTTTTGGTGTCACATCTAATTTGGTG 7F3 GCACAGACAATCCAGCCGTA 7B3 GTTGCGTTATCTGGAGTAGTCG 7FIP GTCTTCTCCTTTGATGGGTTGAGG ACGGAGCTATAGTAGGAACCGTA 7BIP TGGCGGATGATGAAGTTCTAAGC CGCTAGAAGTATAAGGATCGTCCA 8F3 CATTACCACCCTTGATCTTAGC 8B3 AGGTTGTTAATTGAGTTTGTGG 8FIP TGTGAGTTTGTTCGTGTCG – CAAACCTTGACGTAACCCCGC 8BIP GCGCAACACCTTAACCGAAA – TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG 3.2.1.2. Lựa ch n bộ mồi LAMP cho độ nhạy khuếch đại cao nh t Thực hiện các phản ứng LAMP với từng bộ mồi và sử dụng DNA khuôn là DNA tổng số tinh khiết của L. monocytogenes EGDe với lượng là 20, 2, 0,2 và 0 pg phản ứng. Sau đó, điện di 10 l sản phẩm trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 34.8 Hình 34. Kết quả sàng l c các bộ mồi LAMP dựa tr n khả n ng khuếch đại DNA của L. monocytogenes Trong đ : , , , : DNA chuẩn GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific) , , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , 7, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng 0, , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , , 7, : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , 0, , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng 7, , , 0: Sản phẩm LAMP v i bộ mồi 7 lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng , , , : Sản phẩm LAMP v i bộ mồi lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, 0 pg phản ứng Từ kết quả này, chúng tôi quyết định chọn bộ mồi 8 cho các nghiên cứu tối ưu hóa tiếp theo. Phân tích tính phù hợp của mồi 8 cho thấy các mồi đều phù hợp tiêu chí thiết kế về khoảng cách giữa các mồi, chiều dài mồi. Để tìm các vị trí có thể biến đổi trong loài của trình tự nucleotit trên gen, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự mồi với các trình tự gen inlJ trên ngân hàng GenBank của NCBI bằng chương trình ClustalW và BlastN. Tại những vị trí biến đổi, nucleotit biến đổi được thay thế bằng nuceotit suy biến. Kết quả chạy kiểm tra các mồi được trình bày cụ thể trong Bảng 33. Bảng 33 Kết quả kiểm tra các điểm sai khác của bộ mồi LAMP v i các trình tự gen inlJ tr n ngân hàng gen NCBI Tên mồi Trình tự Vị trí thay đổi Số lƣợng allele Trình tự mồi sau thay thế nucleotide suy biến F3 CATTACCACCCTTGATCTTAGC CATTACTACTCTTGATCTTAGC CATTACCACCCTTGATCTTAGC 2 CATTACYACYCTTGATCTTAGC B3C CCACAAACTCAATTAACAACCT Mồi B3c nằm trong vùng bảo thủ hoàn toàn 1 CCACAAACTCAATTAACAACCT F2 CAAACCTTGACGTAACCCCGC CAAACCTTGACGTAACCCCGC CAAACCTTGATGTAACCCCGC 2 CAAACCTTGAYGTAACCCCGC B2c TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCGGTTAATTGTGTATTGTGGCTG TCAGTTAATTGTGTATTGTGGCTG 2 TCRGTTAATTGTGTATTGTGGCTG F1c TGTGAGTTTGTTCGTGTCG Mồi F1c nằm trong vùng bảo thủ hoàn toàn 1 CGACACGAACAAACTCACA B1 GCGCAACACCTTAACCGAAA GCGCAACACCTTAACCGAAA GCGCAACACCCTAACCGAAA 2 GCGCAACACCYTAACCGAAA 3.2.1.3. T i ưu phản ứng LAMP9 Ảnh hƣ ng của nhiệt độ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP Khảo sát đồng thời ảnh hưởng của nhiệt độ ủ và nồng độ betaine đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 35. Từ kết quả này, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain là 0,9 M (giếng 13) cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 35 nh hư ng của nhiệt độ ủ và nồng độ betain đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP. Trong đ : : DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder (Thermo Scientific) , : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , 7: Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng 0, : Sản phẩm LAMP oC, 0, M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, 0,9 M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , 7: Sản phẩm LAMP oC, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng , : Sản phẩm LAMP oC, , M betain lượng DNA khuôn l n lượt là 0 0, pg phản ứng Ảnh hƣ ng của th i gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP Thử nghiệm phản ứng LAMP với lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 và 0,2 pg phản ứng; thời gian ủ là 45, 60, 75 phút. Sau đó, điện di 3 l lượng sản phẩm LAMP trên gel agarose. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 36 dưới đây: Hình 36 nh hư ng của thời gian ủ đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng LAMP Trong đ : : DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific); : Sản phẩm LAMP sau 7 ph t lượng DNA khuôn của L. monocytogenes là 0 pg phản ứng , , : Sản phẩm LAMP v i lượng DNA khuôn là 0, pg phản ứng, thời gian ủ l n lượt là , 0, 7 ph t10 Kết quả cho thấy kết quả khuếch đại thực sự bão hòa sau 60 phút phản ứng (đường chạy số 4). Do vậy, chúng tôi lựa chọn thời gian ủ là 60 phút cho phản ứng LAMP ở điều kiện tối ưu là 65oC và nồng độ betain là 0,9 M. 3.2.1.4. Kiểm tra độ đặc hiệu, độ bao trùm của phản ứng LAMP Xác định tính bao trùm của phản ứng với một tập hợp 16 chủng L. monocytogenes. Kết quả điện di sản phẩm LAMP (Hình 37) cho thấy độ bao trùm của phản ứng LAMP với DNA của các chủng thuộc loài L. monocytogenes là 100%. Hình 37 ộ bao trùm của phản ứng LAMP v i các chủng L. monocytogenes Trong đ : : Thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Thermo Scientific); : Mẫu kiểm chứng âm t nh , , , và 7: Sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC 19117, L. monocytogenes EGDe, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes DSM20750; đến : sản phẩm LAMP v i DNA khuôn của các chủng L. monocytogenes được phân lập từ thực phẩm Hình 38 ộ ch n l c của phản ứng LAMP v i các loài Listeria khác và các vi khuẩn thường nhi m tạp trong thực phẩm Trong đ : : thang chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder Mi Thermo Scientific : âm t nh , , , và 7: sản phẩm LAMP v i 0 pg DNA khuôn của l n lượt các chủng L. monocytogenes ATCC 19117, L. monocytogenes EGDe, L. monocytogenes LO28; L. monocytogenes CIP7835; L. monocytogenes DSM20750 đến : sản phẩm LAMP v i 0 ng DNA khuôn của l n lượt các chủng L. innocua ATCC 0 L. seeligeri ATCC 35967; L. welshimeri ATCC 35897; L. grayi ATCC 19120; L. ivanovii ATCC 19119; Escherichia coli B41; Salmonella 9R12G2; Bacillus cereus H3081.97; B. subtilis 353B. Xác định tính chọn lọc của phản ứng LAMP với các loài Listeria khác và các loại vi khuẩn thường nhiễm tạp trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella, Bacillus cereus, B. subtilis. Kết quả điện di (Hình 38) cho thấy phản ứng LAMP có độ đặc hiệu đạt 100% trên tập hợp các chủng thử nghiệm. 3.2.1.5. ộ nhạy phản ứng LAMP Tiến hành phản ứng LAMP ở các nồng độ DNA khác nhau. Kết quả cho thấy ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP là 50 fgphản ứng tương đương với khoảng 16 tế bào phản ứng (Hình 39).11 Hình 39 Ngư ng phát hiện của phản ứng LAMP đ i v i DNA tinh khiết của L. monocytogenes Trong đ : , , , , , và 7: Sản phẩm LAMP v i l n lượt , pg 0, pg 0 fg 0 fg fg fg 1, fg DNA của chủng L. monocytogenes EGDe 8: Mẫu âm t nh : Thang chuẩn GeneRulerTM kb DNA Ladder Thermo Scientific . Hình 310 Phát hiện sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu v i HN Trong đ : 7,6,5,4,3 Ống phản ứng LAMP v i l n lượt 0 fg fg fg fg fg u hu g L. monocytogenes EGDe Kết quả trên cho thấy độ nhạy của hai phương pháp phát hiện sản phẩm LAMP nghiên cứu tương đương nhau. 3.2.1.6. So sánh độ nhạy bộ mồi LAMP thiết kế v i các bộ mồi LAMP đã công b Tiến hành phản ứng LAMP với 4 bộ mồi, 1 bộ mồi LAMP đã thiết kế được với 3 bộ mồi tham chiếu đã được công bố trình tự. Kết quả thể hiện trên Hình 310.12 Hình 311 So sánh độ nhạy của phản ứng LAMP phát triển trong nghiên cứu này v i các phương pháp LAMP phát hiện L. monocytogenes đã được công b Trong đ : ): mẫu âm tính; (+): mẫu dương t nh 1: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 107 dung dịch DNA ban đ u 2: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 106 dung dịch DNA ban đ u 3: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 105 dung dịch DNA ban đ u 4: Sản phẩm LAMP v i độ pha loãng 104 dung dịch DNA ban đ u L: DNA ladder (Sangon Biotech) A: Phản ứng LAMP v i mồi iap B: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA C: Phản ứng LAMP v i mồi hlyA D: Phản ứng LAMP v i bộ mồi LAMP inlJ trong nghiên cứu này Kết quả trên cho thấy bộ mồi LAMP của gen inlJ trong nghiên cứu này cho độ nhạy tốt nhất (kết quả dương tính ở độ pha loãng DNA là 106). 3.2.2. Xây dựng quy trình tăng sinh 3.2.2.1. nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự sinh trư ng L. monocytogenes Tăng sinh mẫu xúc xích hun khói trong các môi trường cơ bản khác nhau. Sau 16 giờ nuôi, thu sinh khối, tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR. Đánh giá khả năng tăng sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng realtime PCR, kết quả được thể hiện trên Bảng 34 sau: Bảng 34 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L. monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng cơ bản TSBYE có Kháng sinh TSBYE không có kháng sinh BLEB có kháng sinh BLEB không có kháng sinh Half fraser có kháng sinh UVM không có kháng sinh LEB có kháng sinh LEB không có kháng sinh Ct 21,40 ± 1,20 24,57 ± 1,13 15,71 ± 1,52 23,94 ± 0,97 14,26 ± 1,16 21,47 ± 2,01 18,29 ± 1,45 25,77 ± 1,7813 Kết quả cũng cho thấy môi trường HF và BLEB cho giá trị Ct thấp nhất và gần ngang nhau. Trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành tăng sinh mẫu xúc xích trên môi trường BLEB với nồng độ kháng sinh như ở môi trường Half Fraser (acriflavin và nalidixic acid lần lượt là 12,5 mg l và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 35. Bảng 35 nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L. monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng BLEB có kháng sinh Half fraser có kháng sinh Ct 31,57 ± 0,98 33,29 ± 0,68 Qua thí nghiệm này, môi trường BLEB được chọn là môi trường cơ bản cho tăng sinh L. monocytogenes. 3.2.2.2. nh hư ng của một s thành ph n môi trường đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men Hình 312 nh hư ng của nồng độ cao n m men đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes trong môi trường LE canh trường thu n Tăng sinh với lượng giống ban đầu 3 x 104 CFU ml. Sau 4 giờ nuôi, đo độ đục canh trường ở bước sóng 600 nm. Từ kết quả Hình 313, nồng độ cao nấm men 6 g l được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Ảnh hưởng của nồng độ pyruvate đến sinh trưởng phát triển của L. monocytogenes Nhiễm chủ động L. monocytogenes vào môi trường BLEB có bổ sung pyruvate với nồng độ từ 0,6 đến 1,6 g l với mật độ nhiễm là 2,7 x 102 CFU ml, sau 3 giờ nuôi, lấy canh trường đo độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 600 nm. Kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn đạt cao nhất là tại giá trị nồng độ pyruvate đạt 1,2 và 1,4 g l. Qua thí nghiệm này chúng tôi lựa chọn nồng độ pyruvate cần bổ sung vào môi trường BLEB là 1,2 g l. 3.2.2.3. nh hư ng của nalidi ic acid và acriflavin đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes Vi khuẩn được nuôi trong những môi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau, sau 4 giờ, xác định giá trị OD 600 nm thu được kết quả như Hình 314 sau:14 Hình 313 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidi ic đến sự sinh trư ng của L. monocytogenes trong môi trường LE canh trường thu n Khi nồng độ hai loại kháng sinh trên giảm xuống 5 mg l, thì sự sinh trưởng của L. monocytogenes là tương đương với mẫu không có kháng sinh (sự sai khác không có ý nghĩa). Do vậy, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi tiến hành xem xét khả năng ức chế của các kháng sinh ở nồng độ thấp. 3.2.2.4. nh hư ng của kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi khuẩn khác Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của acriflavin và acid nalidixic lên ba loài vi khuẩn E. coli, Staphylococcus aureus và Lactobacillus plantarum ở 3 nồng độ 2,5; 5 và 10 mg l trong môi trường BLEB đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy, với nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng ức chế tốt trên cả 3 loài vi khuẩn nghiên cứu. Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ 2 loại kháng sinh acriflavin và acid nalidixic đều là 5 mg l. Bảng 36 nh hư ng của nồng độ kháng sinh đến sự sinh trư ng của một s loài vi sinh vật chỉ thị trong môi trường LE canh trường thu n Loài vi khuẩn Th i gian tăng sinh (gi ) 0 3 5 7 E. coli Không kháng sinh 0,116 0,373 0,653 0,655 Acriflavin (2,5 mgl) 0,116 0,105 0,096 0,231 Acriflavin (5 mgl) 0,124 0,144 0,138 0,138 Acriflavin (10 mgl) 0,115 0,105 0,103 0,087 Nadilixic (2,5 mgl) 0,122 0,142 0,104 0,123 Nadilixic (5 mgl) 0,112 0,114 0,09 0,083 Nadilixic (10 mgl) 0,121 0,134 0,071 0,109 Staphylococcus aureus Không kháng sinh 0,031 0,596 2,357 4,5 Acriflavin (2,5 mgl) 0,03 0,039 0,034 0,045 Acriflavin (5 mgl) 0,039 0,041 0,037 0,047 Acriflavin (10 mgl) 0,033 0,031 0,03 0,047 Nadilixic (2,5 mgl) 0,024 0,035 0,036 0,038 Nadilixic (5 mgl) 0,025 0,042 0,036 0,037 Nadilixic (10 mgl) 0,025 0,036 0,036 0,047 Lactobacillus Không kháng sinh 0,144 ND 2,254 2,95915 plantarum Acriflavin (2,5 mgl) 0,148 ND 1,722 1,743 Acriflavin (5 mgl) 0,134 ND 0,114 0,147 Acriflavin (10 mgl) 0,137 ND 0,162 0,131 Nadilixic (2,5 mgl) 0,118 ND 0,541 0,943 Nadilixic (5 mgl) 0,117 ND 0,142 0,055 Nadilixic (10 mgl) 0,123 ND 0,138 0,052 ND: Không xác định 3.2.2.5. Thử nghiệm t ng sinh tr n mẫu thực phẩm Mẫu xúc xích hun khói được đồng hóa trong môi trường BLED, bổ sung 2 loại kháng sinh là acriflavin và acid nalidixic với nồng độ mỗi loại là 5 mg l và 10 mg l. Nhiễm chủ động với mật độ 10 CFU bình có chứa 100 ml hỗn dịch đồng hóa. Sau 12 giờ tăng sinh, lấy 1 ml canh trường tăng sinh tiến hành tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR. Kết quả thể hiện trên Bảng 37. Bảng 37 nh hư ng của nồng độ acriflavin và axít nalidixic đến sự t ng sinh của L. monocytogenes trong môi trường LE c bổ sung cao n m men, pyruvate và v i sự hiện diện của hệ vi sinh vật trong mẫu c ch Mẫu Acriflavin và nalidixic acid (5 mgl) Acriflavin và nalidixic acid (10 mgl) Ct 22,7 ± 1,04 26,17 ± 1,17 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Kết quả trên thêm một lần nữa kh ng định ở nồng độ kháng sinh 5 mg l cho khả năng tăng sinh L. monocytogenes tốt hơn so với nồng độ kháng sinh 10 mg l. 3.2.3. Tối ƣu hóa qui trình tách chiết DNA Tro g ội du g ày á phươ g pháp tá h hiết đượ đá h giá thô g qu giá trị Ct ủ phả ứ g re ltime PCR, giá trị Ct à g hỏ hiệu suất tá h hiết à g lớ . 3.2.3.1. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng triton X 00 kết hợp si u âm và gia nhiệt oC Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần lượt thay đổi từng yếu tố: Nồng độ triton X100 trong đệm chiết (0,6% đến 2,4%), thời gian gia nhiệt ở 95 °C (215 phút); thời gian siêu âm (04 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng Realtime PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau. Bảng 38 nh hư ng của nồng độ Triton X 00 đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes. Nồng độ triton X100 (%) 0,6 1,2 1,8 2,4 Ct 15,56 ± 1,01 15,41 ± 0,63 15,93 ± 1,20 15,98 ± 0,78 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn16 Bảng 39 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00 Th i gian xử lý nhiệt (phút) 2 5 10 15 Ct 15,92± 0,51 15,56 ± 1,04 15,61 ± 1,12 15,73 ± 0,75 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Bảng 310 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng Triton X 00. Th i gian siêu âm (phút) Không siêu âm 0,5 1 2 4 Ct 21,22 ± 0,63 18,35 ± 1,01 17,74 ± 0,81 15,72 ± 0,53 16,23 ± 0,22 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ triton X100 là 1,2%; gia nhiệt 95oC trong 5 phút siêu âm 2 phút. 3.2.3.2. Hiệu su t tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes khi sử dụng NaOH kết hợp si u âm và gia nhiệt oC Mỗi thí nghiệm được tiến hành tách chiết với các lượng sinh khối tế bào như nhau. Lần lượt thay đổi từng yếu tố: thời gian gia nhiệt ở 95 °C (520 phút); nồng độ NaOH (10mM 200mM), thời gian siêu âm (04 phút), ly tâm thu dịch nổi có chứa DNA cho phản ứng Realtime PCR. Kết quả được trình bày trong các bảng sau. Bảng 311 nh hư ng của thời gian ử lý nhiệt đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. Th i gian (phút) 5 10 15 20 Ct 21,53 ± 1,12 21,86 ± 0,45 21,13 ± 1,21 21,89 ± 1,04 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn Bảng 312 nh hư ng của nồng độ NaOH đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes Nồng độ NaOH (mM) 10 30 70 100 150 200 Ct 22,73 ± 1,02 22,40 ± 0,64 21,86 ± 0,73 20,65± 0,52 20,79 ± 0,91 20,37 ± 0,85 Các giá trị Ct là các giá trị trung bình  độ lệch chuẩn17 Bảng 313 nh hư ng của thời gian si u âm đến khả n ng tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes trong quy trình sử dụng NaOH. Th i gian siêu âm (phút) 0 0,5 1 2 3 4 Ct 20,72 ± 1,12 19,46 ± 0,71 17,72 ± 1,04 16,35 ± 0,54 16,81 ± 0,84 18,93 ± 0,97 Kết quả ở các bảng trên điều kiện tách chiết được chọn là nồng độ NaOH là 100 mM; gia nhiệt 95oC trong 5 phút siêu âm 2 phút, 3.2.3.3. So sánh các phương pháp tách chiết nghi n cứu đ i v i canh trường L. monocytogenes thu n không c mẫu thực phẩm Dùng 3 phương pháp tách chiết DNA (2 phương pháp sử dụng NaOH và Triton X100 đã tối ưu ở trên và 1 phương pháp sử dụng kít tách chiết thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit). Mỗi phương pháp tách chiết thực hiện trên 3 mẫu. Thực hiện phản ứng realtime PCR với DNA thu được từ 3 phương pháp tách chiết trên. Kết quả trình bày ở Hình 315 Hình 314 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường thu n của các quy trình sử dụng NaOH, Triton X 00 và sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit. Kết quả cho thấy trong canh trường thuần khả năng tách chiết DNA của 3 phương pháp trên không chênh lệch nhau nhiều, Ct hơn kém nhau khoảng 1 chu kỳ. 3.2.3.4. ánh giá hiệu quả tách chiết DNA của các phương pháp đ i v i mẫu thực phẩm t ng sinh Thí nghiệm được thực hiện với mẫu xúc xích được nhiễm chủ động, tách chiết theo 4 phương pháp tách chiết DNA(3 phương pháp tách chiết ở trên và phương pháp tách chiết thông thường có sử dụng dung môi hữu cơ) thực hiện phản ứng Realtime PCR. Kết quả trình bày tại Hình 316 sau.18 15 18 21 24 27 30 33 NaOH Triton Kit Thông thường Ct Hình 315 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh mẫu c ch khi sử dụng quy trình tách chiết NaOH, Triton X 00, sinh phẩm thương mại GeneJET Genomic DNA Purification Kit và quy trình tách chiết thông thường. Kết quả phân tích cho thấy khả năng tách chiết DNA từ mẫu xúc xích bằng phương pháp sử dụng kít cho kết quả tách chiết tốt nhất. Hai phương pháp sử dụng NaOH và phương pháp sử dụng Triton X100 cho kết quả tách chiết tương đương nhau. Phương pháp tách chiết DNA thông thường làm sạch DNA rất tốt, tuy vậy qúa trình tách chiết khá phực tạp mất nhiều thời gian và sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích trong thực tế khi số mẫu lớn. Kết quả này cho thấy nếu mật độ vi khuẩn đích không đủ (tăng sinh ng n, mật độ ban đầu thấp), phản ứng nhân gen yêu cầu DNA có độ tinh sạch cao (realtime PCR) thì cần sử dụng phương pháp tách chiết DNA có công đoạn làm sạch tốt như phương pháp kít hoặc phương pháp thông thường để đảm bảo kết quả phân tích không bị âm tính giả. Ngược lại nếu mật độ vi khuẩn đích đủ lớn cho phản ứng nhân gen và thêm nữa có những phản ứng nhân gen yêu cầu DNA với độ tinh sạch không quá cao (LAMP) thì có thể sử dụng phương pháp tách chiết đơn giản (NaOH hoặc Triton X100) cho đơn giản mà vẫn hiệu quả. Trong nghiên cứu sử dụng bi từ g n kháng thể để cô đặc và làm sạch vi khuẩn sau giai đoạn tăng sinh. Tuy nhiên hiệu quả làm sạch và cô đặc L. monocytogenes từ mẫu thực phẩm sau tăng sinh cho hiệu quả không cao, nên kết quả cụ thể không được trình bày trong phần kết quả của luận án này. Tuy nhiên trong thí nghiệm rửa giải vi khuẩn khỏi hạt từ và tách chiết DNA từ vi khuẩn thu được, kết quả cho thấy sử dụng đệm glycinetris pH 8,3 theo khuyến cáo của nhà cung cấp hạt từ (Gencrip) cho khả năng tách chiết DNA tốt hơn so với NaOH 100 mM. Chính vì vậy trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi tiến hành so sánh khả năng tách chiết DNA từ canh trường tăng sinh mẫu xúc xích hun khói theo 2 phương pháp: sử dụng Triton X100 1,2 % với điều kiện đã được tối ưu ở trên và sử dụng đệm glycineTris 100 mM pH 8,3 với điều kiện tương tự. DNA sử dụng cho phản ứng realtime PCR. Kết quả thể hiện trên Hình 317.19 Hình 316 So sánh hiệu quả tách chiết DNA thể gen L. monocytogenes từ canh trường t ng sinh mẫu c ch khi sử dụng quy trình tách chiết bằng đệm GlycineTris pH 8,3 và Triton X 100 Từ kết quả trên phương pháp tách chiết được lựa chọn trong nghiên cứu này là sử dụng đệm glycine 100 mM, pH 8,3 gia nhiệt 95 oC trong 5 phút, siêu âm 2 phút. 3.2.3.5. nh hư ng của lượng mẫu l y tách chiết DNA cho phản ứng LAMP Nhiễm chủ động lượng tế bào vi khuẩn 6 CFU25 g, tăng sinh 12 giờ, tách chiết DNA cho phản ứng realtime PCR và LAMP. Kết quả thể hiện ở Bảng 314 sau: Bảng Error No text of specified style in document.14 nh hư ng của thể t ch mẫu canh trường t ng sinh được sử dụng đến khả n ng phát hiện L. monocytogenes bằng kỹ thuật LAMP và realtime PCR Thể tích mẫu (ml) 1 10 20 30 Real time PCR + ức chế ức chế ức chế LAMP (quan sát kết tủa sản phẩm phụ bằng m t thường) Khó phát hiện + + + LAMP (điện di sản phẩm) + + + + Xác định sản phẩm LAMP bằng phản ứng màu với HNB + + + + Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thể tích mẫu lấy đi phân tích là 10 ml 3.2.3.6. Thử nghiệm phản ứng LAMP tr n các nền mẫu khác nhau Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng 3 loại mẫu, nhiễm chủ động, tăng sinh 10, 12, 14 giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP. Kết quả thể hiện trên Hình 3 1920 Hình 317 Ảnh hưởng của thời gian tăng sinh và nền mẫu đến khả năng phát hiện L. monocytogenes dựa trên kỹ thuật LAMP khuếch đại gen inlJ Trong đ : ( Mẫu âm t nh phản ứng LAMP , , : L n lượt là mẫu c ch, mẫu mayonair và mẫu sữa không nhi m L. monocytogenes. , , : L n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , giờ. 7, , : l n lượt là mẫu c ch nhi m chủ động CFU g, t ng sinh 0, , giờ. 0, : L n lượt là mẫu mayonair nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , giờ. , : L n lượt là mẫu sữa nhi m chủ động CFU g, t ng sinh , giờ Qua thí nghiệm này chúng tôi chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt là ≥ 10 giờ, cho mẫu sữa và mayonair là ≥ 12 giờ. 3.2.4. Đề xuất quy trình phân tích Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi đề xuất quy trình phân tích L. monocytogenes dựa trên phản ứng LAMP như sau: Hình 318 Sơ đồ quy trình phát hiện nhanh L. monocytogenes được phát triển trong nghi n cứu này Lấy mẫu tách chiết DNA (ly tâm 10.000 g3 phút, gia nhiệt 95oC5 phút, siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g2 phút) Thực hiện phản ứng LAMP 65oC4060 phút; 80oC5 phút Đọc kết quả Tăng sinh chọn lọc 37oC12 gi 21 Tăng sinh chọn lọc: Cân 25 g thực phẩm cần phân tích, đồng hóa với 225 ml môi trường tăng sinh đã vô trùng (môi trường BLEB có thành phần: 17 gl casein enzymic hydrolysate; 3 gl papaic digest of soyabean meal; 5 gl NaCl; 2,5 gl K2HPO4, 2,5 g l dextrose; 6 g l cao nấm men;1,35 g l KH2PO4; 9,6 gl Na2HPO4; pyruvate 1,2 g l, nalidixic và acriflavin đều là 5 mg l). pH (tại 25°C) = 7,3. Các hóa chất của hãng Himedia (hoặc tương đương trở lên). Ủ ở 37 oC trong 12 giờ. Lấy mẫu tách chiết DNA Lấy 10 ml canh trường tăng sinh chuyển sang 1 ống falcon 15 ml sạch, ly tâm thu sinh khối ở tốc độ 10.000 g 3 phút, chuyển sang 1 ống eppendorf 1,5 ml. Rửa lần 1 bổ sung 1 ml nước deion, trộn đều, ly tâm 10.000 g 3 phút, loại bỏ dịch nổi thu sinh khối, rửa lần 2 tương tự lần 1. Bổ sung 100 l đệm chiết (đệm glycine 100 mM, pH 8,3), trộn đều, phá v tế bào ở 95 oC 5 phút; siêu âm 2 phút, ly tâm 10.000 g 2 phút thu dịch nổi chứa DNA cho phản ứng LAMP. Hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử. Thực hiện phản ứng LAMP Sử dụng 3 µl DNA cho phản ứng LAMP. Thực hiện phản ứng LAMP với thể tích 20 l có thành phần như sau: 20 mM TrisHCl pH 8,8 ở 25 °C; 10 mM (NH4)2SO4; 10 mM KCl; 8 mM MgSO4; 0,1 % Triton X100; 1,2 mM dNTP; 1,2 M betaine; 1,6 M các mồi FIP và BIP; 0,2 M mồi F3 và B3; 8 U Bst 2.0 DNA polymerase. Phản ứng được ủ ở nhiệt độ 65 °C trong thời gian 4060 phút. Dừng phản ứng bằng ủ ở 80 °C trong 5 phút. Song song thực hiện 1 mẫu dương tính (thay DNA mẫu bằng DNA tách chiết từ L. monocytogenes EGDe với nồng độ bản sao l), 1 mẫu âm tính phản ứng LAMP (thay DNA từ mẫu bằng nước cất). Các hóa chất yêu cầu ở mức tinh khiết và phù hợp cho sinh học phân tử. Đọc kết quả: Sau phản ứng LAMP, quan sát màu dung dịch phản ứng, mẫu chuyển dung dịch phản ứng từ màu xanh tím than sang màu xanh da trời là mẫu dương tính (Hình 310). 3.2.5. n n n n Để xác định độ nhạy toàn bộ quy trình phân tích, chúng tôi nhiễm mẫu ở các mật độ khác nhau dao động trong khoảng xấp xỉ 110 CFU 25 g mẫu bình 225 ml môi trường. Tăng sinh 12 giờ lấy mẫu xác định sự có mặt của L. monocytogenes. Xác định mật độ chính xác đã nhiễm vào mẫu bằng hậu kiểm canh trường giống đã sử dụng để nhiễm mẫu bằng phương pháp trải trên đĩa môi trường O.A Listeria, sau đó quy ngược lại ra mật độ nhiễm ban đầu. Sau tăng sinh 12 giờ, lấy mẫu xác định sự có mặt của L. monocytogenes bằng phương pháp LAMP và cấy trải đĩa sau đó lấy khuẩn lạc đặc trưng chạy realtime PCR. Những mẫu dương tính với phản ứng realtime PCR mới được coi là mẫu đã được nhiễm. Kết quả thí nghiệm này được trình bày ở bảng sau:22 Bảng 315 ộ nhạy quy trình phát hiện L. monocytogenes theo kỹ thuật LAMP Mật độ nhiễm (CFUml) 13 47 810 1015 Số mẫu dƣơng tính với phản ứng LAMPtổng số mẫu phân tích 55 55 55 33 Kết quả trên cho thấy độ nhạy của quy trình trong phòng thí nghiệm đạt được ≥ 1 CFU 25 g mẫu. 3.2.5. Thiết kế, sản xuất thử nghiệm bộ sinh phẩm LAMP phát hiện L. monocytogenes 3.2.5.1. Thiết kế bộ sinh phẩm Thành phần bộ kít Bộ kít được thiết kế gồm hai hợp phần cho hợp lý về mặt k thuật, bảo quản và tiện về mặt sử dụng. Thành ph n cho t ng sinh LAMPL’MONO – M) Gồm 10 túi mỗi túi chứa 10,83 g môi trường BLEB Thành ph n cho tách chiết DNA và phản ứng LAMP LAMPL’MONO – D) Dung dịch số 1: Đệm Glycine 0,1 M, pH 8,3. Thể tích 2 x 1,5 ml Dung dịch A: 33,33 mM TrisHCl; 16,66 mM KCl; 13,33 mM MgSO4; 0,16 % Triton X100; 1,66 mM dNTP, 2 M betain, 2,66 M các mồi FIP và BIP; 0,33 µM các mồi F3 và B3; 200 µM HNB. Thể tích 12 l, số lượng 10 ống eppendorf 0,5 ml Dung dịch B: Bst 120 U (1 ống x 15 l) Dung dịch C: Nước (ultrapure, DNAse, RNAse free) (1 ống x 50 µl) Dung dịch D: Kiểm chứng dương tính: 20 l dung dịch DNA Listeria monocytogenes với nồng độ 1000 bản sao l 3.2.5.2. iều kiện bảo quản bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được thiết kế gồm 2 phần riêng biệt là phần môi trường tăng sinh (LAMPL’MONO – M) được bảo quản ở 4 oC, và phần các loại hóa chất cho tách chiết và phản ứng LAMP (LAMPL’MONO – D) được bảo quản ở điều kiện 20 oC. Theo các hướng dẫn sử dụng và bảo quản các hóa chất ở thể chưa trộn lẫn thành hỗn hợp thì các hoá chất cho phản ứng LAMP và tách chiết DNA hoàn toàn bền ở nhiệt độ 20 oC. 3.2.5.3. Sản u t thử nghiệm bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm. 3.2.6. Kiểm định bộ sinh phẩm LAMPL’MONO Bộ sinh phẩm LAMPL’MONO được kiểm định tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm trên 30 mẫu thực phẩm nhiễm chủ động từ 5250 CFU25 g. Xác định sự có mặt của L. monocytogenes theo 2 phương pháp ISO 112901 : 1996 (thay đổi lần 1:2004) và phương pháp sử dụng bộ kít LAMPL’MONO. Kết quả kiểm định cho thấy chỉ sai khác duy nhất một mẫu được nhiễm ở mật độ 5 CFU 25 g thực phẩm cho kết quả dương tính với23 phương pháp ISO và cho kết quả âm tính với phương pháp LAMP. Kết quả tính toán cụ thể một số thông số về độ nhạy độ đặc hiệu, độ chính xác như dưới đây. Độ chính xác tương đối: AC = ((PA+NA)100) (PA+NA+PD) = (27+2)100(27+2+1)= 96,66 % Độ nhạy tương đối: SE= PA 100 (PA+PD) = 27 100 (27+1) = 96,43 % Độ đặc hiệu tương đối: SP = NA100 (ND+NA) = 2100 (0+2) = 100 % Tỷ lệ dương tính giả PN = ND 100(PA+NA+PD) = 0 % 3.2.7. Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm Bộ sinh phẩm được ứng dụng sử dụng tại Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội. Thử nghiệm phân tích trên 30 mẫu thực phẩm lấy trên thị trường Hà Nội. Sử dụng 3 phương pháp phân tích song song, phương pháp sử

THÔNG TIN TÓM TẮT VỀ NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN TIẾN SĨ (Thông tin đưa lên trang Web) Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm phát nhanh Listeria monocytogenes phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng phân lập số thực phẩm có nguy cao thị trường Việt Nam Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 Nghiên cứu sinh: Phùng Thị Thủy Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quang Hòa PGS.TS Tô Kim Anh Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội TÓM TẮT KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã phân lập 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung 10,87 % Trong có loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao xúc xich thịt hun khói cắt lát Đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập cho thấy: 48 chủng L monocytogenes phân lập chia thành lineage, lineage I có 40 chủng lineage II có chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy gây dịch bệnh cao lineage II Các chủng phân lập chia thành CC có 19 chủng thuộc ECIV chủng thuộc ECI có nguy gây bùng phát dịch bệnh cao 48 chủng có tất 16 ST có ST1 đặc biệt nguy hiểm ST1 gây nhiều vụ bùng phát dịch lớn giới Đã thiết kế phản ứng LAMP cho phát nhanh L monocytogenes, bao gồm: thiết kế mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ, điều kiện tối ưu cho phản ứng LAMP nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M Đã tối ưu quy trình phân tích trực tiếp L monocytogenes từ thực phẩm dựa phản ứng LAMP, bao gồm: tăng sinh mẫu môi trường BLEB 37oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút thời gian 10 cho sản phẩm thịt 12 cho sản phẩm sữa mayonair; cải tiến phương pháp tách chiết nhanh thu DNA từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm Quy trình phân tích đạt độ nhạy CFU/25 g với tổng thời gian phân tích 12-14 Đã thiết kế chế tạo thành công sinh phẩm LAMP-L’MONO phát nhanh Listeria monocytogenes thực phẩm Bộ sinh phẩm kiểm định cho kết có độ tương đồng cao với phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 TCVN 7700-1:2007 Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2016 Tập thể hướng dẫn TS Lê Quang Hòa PGS.TS Tô Kim Anh Nghiên cứu sinh Phùng Thị Thủy INFORMATION ON NEW CONCLUTION OF DOCTORAL THESIS (Information will be posted on the Website) Name of thesis: Study on rapid method for direct detection and molecular epidemiology of Listeria monocytogenes isolated from Vietnam foods Specialization: Biotechnology Code No.: 62420201 Name of PhD student: Phung Thi Thuy Advisor: Dr Le Quang Hoa Assoc Prof Dr To Kim Anh Training Institution: Hanoi University of Science and Technology Summary of the new contributions of the Thesis Fifty nine strains of L monocytogenes were isolated from 543 Vietnam food samples The average infection rate of L monocytogenes in foods was 10.87% with the highest found in sausage and slide meat products Forty eight strains out of 59 isolated of L monocytogenes were divided into two lineages, of which 40 isolates belonging to lineage I and isolates belonging to lineage II The lineage I strains was considered high risky than those of the lineage II On the other hand, the isolates could be divided into clonal clusters, among them 19 ECIV strains and one ECI strain were seen as outbreak causing strains The 48 isolates also can be divided into 16 ST, of which ST1 strains were highly dangerous, causing many sever outbreaks worldwide A molecular method for rapid detection of L monocytogenes based on LAMP reaction was established: a set of LAMP primers was designed to amplify inlJ gene, optimal condition for the reaction was 65 °C for 40-60 with betaine concentration of 0.9 M The direct detection procedure of L monocytogenes based on the LAM reaction was optimized, including enrichment for the bacteria in BLEB media at 37 °C, 150 rpm for 10 and 12 hours respectively for meat and dairy products; modified method for rapid DNA extraction The sensitivity of detection procedure attained CFU L monocytogenes /25 g food with total analysis time of 12-14 hours A LAMP-L'MONO kit for L monocytogenes rapid detection based on LAMP technique was designed and validated and found to be conformed with ISO 11290-1: 1996 and TCVN 7700 -1: 2007 methods Hanoi, 28th, March, 2016 Advisor: Le Quang Hoa PhD Student To Kim Anh Phung Thi Thuy TRÍCH YẾU LUẬN ÁN TIẾN SĨ Tên tác giả: Phùng Thị Thủy Tên luận án: Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm phát nhanh Listeria monocytogenes phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng phân lập số thực phẩm có nguy cao thị trường Việt Nam Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 Tên sở đào tạo: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Mục đích đối tượng nghiên cứu luận án  Mục đích nghiên cứu: - Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ loại thực phẩm có nguy cao Việt Nam - Thiết kế, chế tạo thử nghiệm kiểm định sinh phẩm LAMP phát nhanh L monocytogenes loại thực phẩm ăn liền  Đối tượng nghiên cứu: - Mẫu thực phẩm: Tổng số 543 lấy siêu thị địa bàn Hà Nội - Chủng vi khuẩn phân lập: Tổng số 48 chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm lưu hành Việt Nam, - Chủng vi khuẩn chuẩn: 17 chủng vi sinh vật khác L monocytogenes Các phương pháp nghiên cứu sử dụng  Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm   Điện di DNA gel agarose Phản ứng PCR khẳng định L monocytogenes khuếch đại housekeeping gen cho giải trình tự Phương pháp tinh sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) Phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại loài MLST sở liệu viện Pasteur Pháp    Giải trình tự gen: Tiến hành Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Mỗi trình tự gen giải trình tự chiều      Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4 Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy phản ứng LAMP Phản ứng Real-time PCR Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn Kiểm định sinh phẩm   Phương pháp phát L monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 ISO 112901:1996 Xây dựng phân loại phần mềm ClustalW Các kết kết luận  Các kết đạt đề tài nghiên cứu: - Đã phân lập 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung 10,87 % Trong có loại thực phẩm có tỷ lệ nhiễm cao (lần lượt 30,34 % 14,48 %) Đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập cho thấy: 48 chủng L monocytogeneses phân lập chia thành lineage, lineage I có 40 chủng lineage II có chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy gây dịch bệnh cao lineage II Các chủng phân lập chia thành CC có 19 chủng thuộc ECIV chủng thuộc ECI có nguy gây bùng phát dịch bệnh cao 48 chủng có tất 16 ST có ST1 đặc biệt nguy hiểm ST1 gây nhiều vụ bùng phát dịch lớn giới - Đã Thiết kế mồi LAMP nhân đặc hiệu gen inlJ với độ nhậy mẫu vi khuẩn 16 CFU/ phản ứng, canh trường tăng mẫu xúc xích 336 CFU/ml Bộ mồi cho độ đặc hiệu, độ bao trùm cao (100 % số chủng nghiên cứu) - Đã tối ưu điều kiện cho phản ứng LAMP thực phản ứng nhiệt độ 65oC, thời gian 40-60 phút, nồng độ betain 0,9 M - Đã tối ưu điều kiện tăng sinh cho phát L monocytogenes là: sử dụng môi trường BLEB (17 g/l casein enzymeic hydrolysate; g/l papaic digest of soyabean meal; g/l NaCl; 2,5 g/l K2HPO4, 2,5 g/l dextrose; g/l cao nấm men;1,35 g/l KH2PO4; 9,6 g/l Na2HPO4; pyruvate 1,2 g/l, nalidixic acriflavin mg/l), tăng sinh 37oC tốc độ lắc 150 vòng/ phút, thời gian 10 (với sản phẩm thịt); 12 (với sản phẩm sữa mayonair) - Đã tìm điều kiện tách chiết nhanh thu DNA cho phản ứng LAMP từ canh trường tăng sinh mẫu thực phẩm sử dụng đệm glycine –tris 100 mM pH 8,3, gia nhiệt phút 95oC, siêu âm phút, ly tâm 10.000 g phút thu dịch DNA cho phản ứng LAMP - Đã xây dựng quy trình phân tích nhanh L monocytogenes monocytogenes thực phẩm dựa kỹ thuật LAMP với độ nhạy đạt cfu/25 g với tổng thời gian phân tích khoảng 12-14 - Đã thiết kế chế tạo thành công sinh phẩm phát nhanh Listeria monocytogenes thực phẩm dựa kỹ thuật LAMP mang tên LAMP-L’MONO - Đã kiểm định ứng dụng thử nghiệm sinh phẩm LAMP-L’MONO cho kết có độ tương đồng cao với phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 (sửa đổi lần 1: 2004) TCVN 7700-1:2007 Độ đặc hiệu đạt 100 % (phòng thí nghiệm, mẫu thực kiểm định) Độ xác (ổn định) đạt 100 % (phòng thí nghiệm, mẫu thực) đạt 96 % (kiểm định), tỷ lệ dương tính giả 0% (phòng thí nghiệm mẫu thực)  Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Kết nghiên cứu đề tài cho thấy thực tế tỷ lệ nhiễm vi khuẩn L monocytogenes thực phẩm cao, có dòng phân lập có khả gây dịch bệnh lớn Tuy có công bố vài trường hợp bệnh nhên bị listeriosis, không kiểm soát tốt vi khuẩn chuỗi cung cấp thực phẩm nguy lớn dịch bệnh cho người tiêu dùng Kết đề tài chế tạo thành công kít phân tích phát nhanh L monocytogenes Bộ kít cho kết phân tích tương đồng với phương pháp tiêu chuẩn TCVN ISO Thêm kít có nhiều ưu điểm phương pháp sử dụng giá thành, thời gian phân tích độ nhạy, độ đặc hiệu Những ưu điểm góp phần tích cực vào việc giảm thiểu tạp nhiễm loài vi khuẩn nguy hiểm thực phẩm nhằm giảm tổn thất cho nhà sản xuất người tiêu dùng Tập thể hướng dẫn Nghiên cứu sinh TS Lê Quang Hòa PGS.TS Tô Kim Anh Phùng Thị Thủy MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Listeria monocytogenes loài vi khuẩn truyền bệnh qua thực phẩm nguy hiểm, đặc biệt với tỷ lệ tử vong lên đến 30% Bệnh L monocytogenes gây gọi chung listeriosis Đối tượng có nguy bị nhiễm bệnh thường người có hệ thống miễn dịch bị suy yếu trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi Nếu không điều trị kịp thời kháng sinh, bệnh nhân bị nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai tử vong Vi khuẩn L monocytogenes phổ biến môi sinh Chúng tìm thấy nhiều nơi đất, nước, thực vật, thực phẩm, thức ăn gia súc, phân người phân động vật Chúng sống tăng trưởng chậm điều kiện kh c nghiệt nhiệt độ, hàm lượng khí oxy, pH hoạt độ nước Đặc biệt loài vi khuẩn có khả sinh trưởng nhiệt độ lạnh (0-10oC) Chính lý mà khả nhiễm L monocytogenes thực phẩm cao, đặc biệt sản phẩm bảo quản lạnh thời gian dài Nhiều loại thực phẩm bày bán siêu thị thực phẩm ăn sẵn Thêm ngày người ta lại muốn sử dụng loại thực phẩm chất bảo quản không bị gia nhiệt để giữ nguyên vẹn hương vị, cấu trúc nguyên liệu ban đầu Những sản phẩm thường bảo quản lạnh trước sử dụng Vì vậy, sản phẩm thực phẩm loại có nguy nhiễm L monocytogenes cao Rất nhiều vụ ngộ độc triệu hồi sản phẩm thực phẩm nhiễm L monocytogenes kh p giới thông báo Các nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ vụ dịch lớn giới cho thấy, có chủng L monocytogenes có khả gây bệnh gây bùng phát dịch lớn, bên cạnh có kiểu huyết khả gây bệnh gây dịch Cho đến thời điểm chưa có công bố dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam Khả gây bệnh gây dịch L monocytogenes nhiễm thực phẩm Việt Nam ẩn số Phương pháp ISO 11290-1:1996 phát L monocytogenes phương pháp nuôi cấy Một số phương pháp sinh học phân tử PCR, real-time PCR phương pháp miễn dịch (ELISA) tiêu chuẩn hóa Mấy năm trở lại đây, với đời số k thuật khuếch đại đ ng nhiệt axit nucleic, việc phát nhanh vi sinh vật gây bệnh đơn giản hóa thêm bước LAMP k thuật khuếch đại đ ng nhiệt sử dụng phổ biến Ngoài ra, khả phát trực tiếp sản phẩm phản ứng LAMP không cần điện di ưu điểm trội phương pháp này, giúp đơn giản hóa rút ng n thời gian phân tích K thuật nhanh chóng ứng dụng để phát L monocytogenes thực phẩm nhiều nghiên cứu giới Ở Việt Nam, phương pháp tiêu chuẩn TCVN: 7700-1:2007 phát Listeria monocytogenes phương pháp nuôi cấy, sau khuẩn lạc đặc trưng kh ng định phản ứng sinh hóa Đã có số nghiên cứu phương pháp PCR que thử s c ký miễn dịch nhằm phát vi khuẩn này, nhiên thời gian phân tích dài yêu cầu cao trang thiết bị hóa chất nên chưa đáp ứng nhu cầu phân tích phát thực tế sản xuất Trong khuôn khổ luận án này, nghiên cứu đề tài có tên “Nghiên cứu chế tạo sinh phẩm phát nhanh Listeria monocytogenes phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng phân lập số thực phẩm có nguy cao thị trường Việt Nam” Mục tiêu nội dung nghiên cứu luận án   Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ loại thực phẩm có nguy cao Việt Nam Xây dựng sinh phẩm phát nhanh L monocytogenes loại thực phẩm ăn liền dựa k thuật LAMP Những đóng góp luận án   Lần công bố kết qủa nghiên cứu dịch tễ học phân tử L monocytogenes phân lập từ thực phẩm Việt Nam Là công trình sử dụng gen inlJ làm gen đích phát triển k thuật LAMP cho phát L monocytogenes, giúp nâng cao tính đặc hiệu phép phân tích Bố cục luận án Luận án bao gồm 123 trang có trang mở đầu, 38 trang tổng quan, trang vật liệu phương pháp nghiên cứu, 56 trang kết NỘI DUNG CHÍNH Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan L monocytogenes Luận án đề cập đến vấn đề liên quan đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa loài L monocytogenes, từ cho thấy loài có khả phân bố rộng thực phẩm môi trường Các thống kê cho thấy có nhiều công bố vụ gây dịch bệnh listeriosis L monocytogenes gây lên có liên quan đến loại thực phẩm khác chủ yếu loại thực phẩm có bảo quản lạnh thời gian dài Chính luận án phần phân lập tiến hành chủ yếu mẫu thực phẩm có trình bảo quản lạnh trước sử dụng 1.2 Tổng quan phƣơng pháp phân loại dƣới loài L monocytogenes Các phương pháp phân loại loài dựa theo kiểu enzyme kháng thể thường cho độ phân loại không cao, nên không phù hợp nghiên cứu dịch tễ học chủng L monocytogenes gây dịch bệnh Các phương pháp phân loại loài dựa kiểu gen phổ biến Tuy nhiên kết phân loại phụ thuộc lớn vào sở liệu liên quan cho phân tích so sánh MLST phương pháp phân loại loài đơn giản sử dụng phổ biến Cơ sở liệu cho phương pháp MLST phong phú Chính luận án sử dụng phương pháp MLST sơ sở liệu viện Pasteur Pháp làm công cụ phân tích dịch tễ học loài L monocytogenes phân lập Từ đánh giá nguy gây dịch bệnh loài vi khuân thực phẩm Việt Nam 1.3 Tổng quan phƣơng pháp phát L monocytogenes Hiện có nhiều phương pháp sử dụng phân tích phát L monocytogenes Ngoài phương pháp tiêu chuẩn phương pháp nuôi cấy theo ISO TCVN có phương pháp nhân gen real-time PCR phương pháp sử dụng kít miễn dịch tiêu chuẩn hóa Tuy nhiên phương pháp có thời gian phân tích dài yêu cầu sử dụng trang thiết bị, hóa chất đ t tiền, nên chưa đáp ứng yêu cầu việc kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm thực tế sản xuất Chính Luận án đặt mục tiêu phát triển phương pháp phân tích nhanh, đơn giản đạt độ nhạy, độ đặc hiệu cao Chƣơng II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1  Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu thực phẩm Mẫu lấy siêu thị địa bàn Hà Nội Chủng vi sinh vật Một số chủng vi khuẩn lấy từ sưu tập giống Viện Công nghệ Sinh học - Công nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội Hóa chất - Hóa chất cho phản ứng PCR, LAMP, Real time PCR, điện di DNA, tách chiết DNA, nuôi cấy vi khuẩn Môi trường: Môi trường cho tăng sinh; môi trường phân lập L monocytogenes Các cặp mồi cho PCR, real time PCR, LAMP 2.2 Các thiết bị sử dụng chủ yếu Một số thiết bị sử dụng cho PCR, real-time PCR, điện di, siêu âm, ly tâm, bảo quản lạnh lạnh đông, nuôi cấy vi sinh vật 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu  Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm  Phản ứng PCR khẳng định L monocytogenes khuếch đại gen giữ nhà cho giải trình tự  Phương pháp tinh sản phẩm PCR cho giải trình tự gen: Sử dụng kít tinh GeneJETTM PCR Purification (Fermentase) theo hướng dẫn nhà sản xuất  Các phương pháp phân tích dịch tễ học phân tử: Sử dụng phương pháp phân loại loài MLST sở liệu viện Pasteur Pháp ( www.pasteur.fr/mlst)  Giải trình tự gen: Tiến hành Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Mỗi trình tự gen giải trình tự chiều  Thiết kế mồi cho phản ứng LAMP: Sử dụng phần mềm PrimerExplorer V4  Xác định độ đặc hiệu, độ bao trùm, độ nhạy phản ứng LAMP  Phản ứng Real-time PCR  Các phương pháp tách chiết DNA hệ gen vi khuẩn  Kiểm định sinh phẩm  Ứng dụng thử nghiệm sinh phẩm  Phương pháp phát L monocytogenes theo TCVN 7700-1: 2007 ISO 112901:1996 Chƣơng III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập từ số thực phẩm Việt Nam 3.1.1 Phân lập L monocytogenes từ mẫu thực phẩm Trong nghiên cứu này, mẫu thực phẩm tăng sinh môi trường Half Fraser, mẫu cho chuyển màu canh trường sang màu đen (bình Hình 3-1 A) cấy trải môi trường RAPID’L.mono (Biorad) Các mẫu thực phẩm dương tính với L monocytogenes mẫu cho khuẩn lạc có hình thái đặc trưng (Hình 3-1 B) có khuẩn lạc nghi ngờ kh ng định dương tính k thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu LM1-LM2 khuếch đại đoạn gen hlyA có kích thước 702 bp (Hình 3-2) A B Hình 3-1 Kết phân lập L monocytogenes sử dụng môi trường RAPID’L.mono A: T ng sinh môi trường l ng Half Fraser : mẫu dương t nh giả định môi trường chuyển sang màu đen : mẫu âm t nh môi trường không m t màu : Hình thái khuẩn lạc L monocytogenes tr n môi trường RAPID’L.mono khuẩn lạc màu anh đen không c halo màu vàng tương ứng v i khuẩn lạc nghi ngờ L monocytogenes 702 bp Hình 3-2 Kết khẳng định PCR khuẩn lạc L monocytogenes giả định phân lập tr n môi trường RAPID’L.mono : Mẫu dương t nh , , : a khuẩn lạc nghi ngờ từ mẫu cá hồi , ,7: a khuẩn lạc nghi ngờ từ mẫu c ch v i khuẩn lạc giếng khẳng định L monocytogenes , , 0, : n khuẩn lạc nghi ngờ từ mẫu sushi : mẫu âm t nh : thang chuẩn 00 bp O’GeneRuler TMcủa Fermentas Tổng hợp kết phân tích phát L monocytogenes mẫu thực phẩm phân tích từ năm 2011 đến 2015 trình bày Bảng 3-1 sau Bảng 3-1 Tổng hợp kết phát L monocytogenes mẫu thực phẩm Việt Nam khoảng thời gian từ Loại thực phẩm đến Số lƣợng mẫu thực phẩm Số lƣợng chủng phân lập đƣợc Tỷ lệ nhiễm (%) Xúc xích 145 21 14,48 Các loại thịt hun khói 112 34 30,36 Thịt sống 43 2,33 Cá, tôm, cua, ốc 49 2,04 Bơ, sữa trùng 45 2,22 Rau ăn sống 37 0 Sushi 52 1,92 Bánh mỳ kẹp thịt, hoa dầm 29 0 Nem chua 31 0 Tổng cộng 543 59 10,87 Có tổng số 59 543 mẫu phát nhiễm L monocytogenes Trong mẫu thịt hun khói xúc xích có tỷ lệ nhiễm cao 3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử chủng L monocytogenes phân lập đƣợc từ thực phẩm Việt Nam Kết phân lập 59 chủng L monocytogenes, nhiên trình giữ giống, số chủng phân lập bị chết, chủng lại tăng sinh, tách chiết DNA tiến hành phản ứng PCR với mồi nhân đoạn gen giữ nhà (housekeeping gene) Tinh sản phẩm PCR, giải trình tự gen Công ty Macrogen (Hàn Quốc) Dựa vào trình tự thu được, tra cứu kiểu trình tự tương ứng với đoạn gen Tổ hợp kiểu trình tự đoạn gen tra cứu kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (clone complex - CC) dòng giống (ligneage) tương ứng chủng phân lập Tra cứu kiểu trình tự đoạn gen giữ nhà 48 chủng L monocytogenes phân lập ngân hàng liệu kiểu trình tự tương ứng gen Tổ hợp kiểu trình tự đoạn gen chủng phân lập kiểu trình tự (ST), dòng phức hợp (CC) thuộc dòng giống Từ kiểu ST phân loại 48 chủng phân lập thành 16 nhóm có kiểu ST khác Nối đoạn gen giữ nhà nhóm với nhau, so sánh trình tự đoạn gen 16 nhóm với 25 trình tự đoạn gen tương ứng chủng gây dịch bệnh listeriosis giới Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô 4,16 M41, M42 766 1/2a 8/ECV II 10 2,08 M49 4b 1/ECI I 11 4,16 M1, M2 CPL 1/2b 87 I 12 2,08 M9 CPL 155 II 13 2,08 M15 CPL 155 II 14 2,08 M20 CPL 15 4,16 M21, M36 CPL 16 2,08 M17 CPL 2/ECIa/ECIV 2/ECIa/ECIV I I I Bảng 3-5 cho thấy 48 chủng nghiên cứu, tồn 16 kiểu trình tự khác ST2, với kiểu huyết đoán 4b chiếm tỷ lệ cao (35,42%), sau đến ST3 với kiểu huyết đoán 1/2b (25,00%) Đặc biệt có chủng thuộc kiểu trình tự chƣa tồn sở liệu Các kiểu trình tự thuộc vào hai dòng giống I II dòng giống I chiếm đa số Kết Bảng 3-5 cho thấy dòng phức hợp CC2 CC3 chiếm phần lớn chủng phân lập (lần lƣợt 19/48 13/48 chủng) Các kết tƣơng đồng với nghiên cứu Viviane cộng [46] phân bố CC2 CC3 Theo nghiên cứu đó, CC2 (kiểu huyết 4b) CC3 (kiểu huyết 1/2b) chiếm tỷ lệ phân bố cao chủng nghiên cứu từ ngƣời, thực phẩm, môi trƣờng động vật vùng địa lý khác từ 42 quốc gia (lần lƣợt 64/300 32/300 chủng) Các chủng CC2 xuất số vụ dịch giới nhƣ vụ dịch sữa trùng năm 1983 Massachusetts, vụ dịch pa tê năm 19871988 Anh Ireland, vụ dịch viêm dày, ruột năm 1997 Italia vụ dịch rau Boston năm 1983 [36]; [45] Về phân loại dịch tễ học, CC2 đƣợc xếp vào dòng bệnh dịch ECIa sau đƣợc xếp vào ECIV [36] Bên cạnh đó, dòng phức hợp CC3 đƣợc xác định nguyên nhân gây dịch sữa chocolate năm 1994 Illinois [36] Hơn nữa, số 48 chủng đƣợc nghiên cứu, xác định đƣợc chủng thuộc CC1 vốn đƣợc xếp vào ECI Các chủng thuộc CC1 đƣợc xác định nguyên nhân loạt vụ dịch listeriosis giới nhƣ vụ dịch xà lách trộn năm 1981 Nova Scotia; vụ dịch phomat mềm từ năm 1983-1987 Thụy Điển, California năm 1985 vụ dịch lƣỡi lợn năm 1992 Pháp [36] Một số dòng phức hợp khác nhƣ CC155, CC8, CC121 CC199 phát nghiên cứu xuất nghiên cứu Viviane cộng với mật độ thấp [46] Đặc biệt có chủng đƣợc xác định thuộc CC8 vốn dòng phức hợp xuất vụ dịch thịt ăn liền năm 2008 Canada đƣợc coi dòng bệnh dịch ECV [36] Nghiên cứu xác định đƣợc chủng có kiểu trình tự ST121, vốn 77 kiểu trình tự đƣợc xác định có khả tồn lâu môi trƣờng nhà máy thực phẩm (đến năm sở sản xuất thực phẩm Áo Ireland) [173] Kiểu trình tự đƣợc xác định đƣợc tìm thấy phổ biến sản phẩm thịt Trung Quốc khoảng thời gian từ 2001 đến 2008 [197] Ở Việt Nam chƣa có công bố liên quan đến ST chủng phân lập ngƣời, nhiên nghiên cứu giới cho thấy có ST xuất thực phẩm tồn ngƣời tỷ lệ có khác nhau, có ST tồn thực phẩm mà không xuất ngƣời Nghiên cứu Yan cộng cho thấy, ST3 ST7 chiếm tỷ lệ thực phẩm (lần lƣợt 3,8 3,3 %) Trong ST3 ST7 lại chiếm tỷ lệ cao (lần lƣợt 24.1 % 13.8 %) tập hợp chủng phân lập ca bệnh dịch listeriosis Trung Quốc [196] Ngƣợc lại, nghiên cứu này, ST3 đƣợc phát nhiều thực phẩm Việt Nam (25 % số chủng phân lập đƣợc) Nhƣ vậy, kết MLST tập hợp 48 chủng L monocytogenes phân lập đƣợc cho thấy lƣợng lớn chủng thuộc nhóm có khả cao gây dịch bệnh Điều cho thấy nguy mắc bệnh listeriosis nƣớc ta không nhỏ cần thiết phải có giải pháp tổng thể để kiểm soát loại bệnh nguy hiểm 3.1.2.4 So sánh chủng L monocytogenes phân lập với chủng gây bệnh dịch giới Để phân tích sâu nguy gây bệnh, gây dịch chủng L monocytogenes phân lập, đoạn gen giải trình tự chủng đƣợc nối lại với đƣợc so sánh với trình tự tƣơng ứng toàn 25 chủng L monocytogenes có liên quan đến vụ bùng phát dịch bệnh listeriosis giới đƣợc công bố sở liệu MLST (danh sách chủng so sánh đƣợc trình bày Phụ lục VI) Sử dụng phần mềm clustal W thông qua mô hình NJ (Neighber joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000 Kết phân tích phả hệ (Hình 3-3) lần cho thấy chủng L monocytogenes phân lập đƣợc xếp vào hai nhóm tƣơng ứng với dòng giống I II Kết Hình 3-3 cho thấy có số nhóm trình tự đặc điểm dịch tễ nhƣ sau:  Dòng giống I - Nhóm 10 (M49) nhóm có chủng, ký hiệu M49 phân lập từ thịt ba rọi xông khói có trình tự đoạn gen giống hệt với trình tự các đoạn gen tƣơng ứng nhiều chủng gây dịch giới nhƣ vụ dịch gây sảy thai Isarel năm 1959; vụ dịch gây sảy thai Pháp năm 1989; vụ dịch sảy thai Nga năm 2005 Trình tự giống hệt chủng phân lập từ máu ngƣời bệnh Tây Ban Nha năm 2000, kiểu ST1 nguyên nhân gây vụ dịch Thụy Điển năm 1995 [197] Đặc biệt trình tự gần gũi với trình tự chủng L monocytogenes gây vụ dịch listeriosis lớn Pháp năm 1992 Trong vụ dịch này, 279 trƣờng hợp mắc bệnh listeriosis có 92 ngƣời mang thai 187 78 thai thai nhi, nên đƣợc coi vụ dịch lẻ tẻ số ngƣời liên quan vụ dịch (mẹ thai nhi) Nhóm 14 (M20) có trình tự đoạn gen gần gũi với chủng gây dịch nhƣ nhóm 1, nên nhóm có nguy gây dịch cao Tuy nhiên tần suất xuất nhóm thấp có 1/48 chủng nên mức độ nguy hiểm giảm đáng kể - Nhóm gồm 12 chủng, Nhóm 15 (M21, M36), nhóm (M8, M26) nhóm 11 (M1, M2) nhóm 16 (M17) thuộc dòng giống I nhƣng nhóm nằm riêng biệt nhánh trình tự đƣợc công bố gây dịch bệnh phân lập đƣợc ngƣời Chính vậy, 19 chủng thuộc nhóm đƣợc coi “lành tính” trình tự thuộc nhóm Trong nhóm có nhóm 11 nhóm 16 chƣa phân loại đƣợc nên cần có nghiên cứu thêm có kết luận xác  Dòng giống II - Nhóm 12, 13, thuộc CC155 có tính gây bệnh thấp chủng thuộc Lineage I, nhiên có chủng thuộc CC155 đƣợc công bố phân lập ngƣời Tại Trung quốc năm 1991, Hy Lạp năm 2003, Newzealand năm 1991 Pháp năm 1990 [46] - Nhóm có quan hệ gần gũi với chủng gây vụ dịch thịt ăn liền Canada 2008 Đặc biệt nhóm (M39) có kiểu ST8 kiểu trình tự đƣợc phân lập từ ngƣời Algeria năm 1991 1992 [46] - Nhóm có quan hệ gần gũi với chủng gây dịch Mỹ năm 2000 Nhóm đƣợc công bố nhóm phổ biến thực phẩm nhiên có chủng thuộc nhóm (ST121) đƣợc phân lập từ ngƣời Phần Lan năm 1989 Tây Ban Nha năm 2005 [46] Kết nghiên cứu cho thấy, thực phẩm Việt Nam có tỷ lệ nhiễm L monocytogenes cao chủng nhiễm tạp thực phẩm có chủng có khả gây dịch bệnh lớn Đây mối nguy lớn ngƣời tiêu dùng Trong sản phẩm thực phẩm có nguy nhiễm L monocytogenes cao sản phẩm thịt hun khói thái lát đặc biệt có nguy cao tỷ lệ nhiễm L monocytogenes cao sản phẩm phân tích Mặt khác nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, nhóm sản phẩm chứa chủng có nguy gây dịch cao Mặc dù đến chƣa có nhiều công bố liên quan đến dịch bệnh listeriosis Việt Nam, nhiên nhà sản xuất cần có cải tiến công nghệ phù hợp nhằm ngăn chặn lây nhiễm vi khuẩn nơi sản xuất, đặc biệt khâu thái lát, đóng gói hoàn thiện sản phẩm Đây công đoạn có nguy tái nhiễm vào sản phẩm cuối cao Thêm việc vận chuyển sản 80 10, 11, 12, 13: Sản phẩm LAMP với mồi 3; lượng DNA khuôn 0; 0,2; 2; 20 pg phản ứng 15, 16, 17, 18: Sản phẩm LAMP với mồi 4; lượng DNA khuôn 0; 0,2; 2; 20 pg phản ứng 19, 20, 21, 22: Sản phẩm LAMP với mồi 5; lượng DNA khuôn 0; 0,2; 2; 20 pg phản ứng 23, 24, 25, 26: Sản phẩm LAMP với mồi 6; lượng DNA khuôn 0; 0,2; 2; 20 pg phản ứng 27, 28, 29, 30: Sản phẩm LAMP với mồi 7; lượng DNA khuôn 0; 0,2; 2; 20 pg phản ứng 33, 34, 35, 36: Sản phẩm LAMP với mồi 8; lượng DNA khuôn 0; 0,2; 2; 20 pg phản ứng Kết cho thấy tất mẫu âm tính không cho kết khuếch đại Bộ mồi số cho kết khuếch đại âm tính với tất lƣợng DNA khuôn sử dụng; mồi cho kết khuếch đại dƣơng tính với lƣợng DNA khuôn 20 pg/phản ứng; mồi 2, 5, cho kết khuếch đại dƣơng tính với lƣợng DNA khuôn 20 pg/phản ứng Chỉ có mồi cho kết khuếch đại dƣơng tính từ lƣợng DNA khuôn 0,2 pg/phản ứng Từ kết này, định chọn mồi cho nghiên cứu tối ƣu phản ứng LAMP  F3 inlj F2 inlj F1 inlJ B1C inlJ B2c inlJ B2c inlJ B3c inlj B3c inlj  Trình tự vùng đặc hiệu mồi LAMP gen mục tiêu: -CATTACCACCCTTGATCTTAGC ATTTGCACAAGTAACAACATTACCACCCTTGATCTTAGCCAAAACACTAATTTAACTTAT ********************** -CAAACCTTGACGTAACCCCGC -CTGGCATGTGATTCAAATAAACTTACAAACCTTGACGTAACCCCGCTTACAAAATTAACC ********************* -CGACACGAACAAACTCACA -TACTTAAATTGCGACACGAACAAACTCACAAAGTTAGATGTAAGTCAAAATCCACTGTTA ******************* -GCGCAACACCTTAACCGAAA ACTTATTTAAACTGCGCGCGCAACACCTTAACCGAAATAGATGTCAGCCACAATACACAA ******************** CAGCCACAATACACAA ACTTATTTAAACTGCGCGCGCAACACCTTAACCGAAATAGATGTCAGCCACAATACACAA **************** TTAACCGA -TTAACCGAGCTAGACTGCCATTTAAATAAAAAAATCACCAAATTAGATGTGACACCACAA ******** CCACAA TTAACCGAGCTAGACTGCCATTTAAATAAAAAAATCACCAAATTAGATGTGACACCACAA ****** ACTCAATTAACAACCT -ACTCAATTAACAACCTTAGACTGTAGCTTTAATAAAATAACTGAATTAGATGTAAGTCAA **************** 22 420 21 480 19 540 20 600 16 600 24 660 660 22 720 Phân tích tính phù hợp mồi LAMP - Khoảng cách đầu 5’ F2 5’ B2 163 bp (gần phù hợp tiêu chí từ 120 – 160 bp) - Khoảng cách F2 F3 46 bp, khoảng cách B2 B3 46 bp (phù hợp tiêu chí – 60 bp) - Khoảng cách từ đầu 5’ F2 đến đầu 5’ F1 46 bp (phù hợp điều kiện 40 – 60 bp); Khoảng cách đầu 5’ B2 3’ B1 31 bp (hơi ngắn so với điều kiện 40 – 60 bp) Nhƣ mồi thiết kế tƣơng đối phù hợp điều kiện độ dài khoảng cách mồi Mục tiêu nghiên cứu thiết kế đƣợc tất mồi thuộc vùng bảo thủ, nhiên trình tự mồi LAMP thƣờng dài nên để đạt đƣợc điều thƣờng khó Vì 85 1: DNA chuẩn GeneRulerTM DNA Ladder (Thermo Scientific) 2, 3: Sản phẩm LAMP 61oC, 0,6 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 4, 5: Sản phẩm LAMP 63oC, 0,6 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 6, 7: Sản phẩm LAMP 65oC, 0,6 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 8, 9: Sản phẩm LAMP 61oC, 0,9 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 10, 11: Sản phẩm LAMP 63oC, 0,9 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 12, 13: Sản phẩm LAMP 65oC, 0,9 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 14, 15: Sản phẩm LAMP 61oC, 1,2 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 16, 17: Sản phẩm LAMP 63oC, 1,2 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng 18, 19: Sản phẩm LAMP 65oC, 1,2 M betain; lượng DNA khuôn 0; 0,2 pg phản ứng Kết Hình 3-5 cho thấy tất điều kiện thử nghiệm, mẫu âm tính không cho kết khuếch đại, mẫu với lƣợng DNA khuôn 0,2 pg/phản ứng cho kết khuếch đại dƣơng tính với cƣờng độ rõ nét Kết cho thấy betain nhiệt độ không ảnh hƣởng nhiều đến hiệu khuếch đại giải nhiệt độ nồng độ betain nghiên cứu Tuy nhiên, điều kiện nhiệt độ 65oC, nồng độ betain 0,9 M (đƣờng chạy số 13) cho hiệu khuếch đại cao với sản phẩm có kích thƣớc lớn so với điều kiện lại Điều có ý nghĩa quan trọng việc phát mẫu dƣơng tính phƣơng pháp quan sát kết tủa Mg2P2O7 tạo thành quan sát đổi màu chất thị HNB Do vậy, lựa chọn điều kiện nhiệt độ ủ 65 oC với nồng độ betain 0,9 M cho thí nghiệm Kết tƣơng đồng với số nghiên cứu trƣớc nồng độ betain thích hợp cho phản ứng LAMP nhƣ nồng độ betain phản ứng LAMP 0,8 M [206] Kết Lê Nguyễn Nguyên Hạ phát đoạn gen ELIP 18 chủng Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 phƣơng pháp LAMP cho thấy cho thấy, betaine nồng độ 0,1 M, sản phẩm phản ứng LAMP đƣợc khuếch đại rõ ràng Khi nồng độ betaine phản ứng tăng lên băng DNA xuất to rõ ràng Nhƣng sản phẩm phản ứng bắt đầu giảm nồng độ betaine phản ứng cao 0,6 mM [4] Ở đƣờng chạy số 15,17,19 tƣơng ứng với nồng độ betain 1,2 M, băng DNA mờ rõ rệt so với đƣờng chạy khác, điều nồng độ betain cao làm liên kết mồi khuôn giảm mặt khác tỷ lệ GC L monocytogenes vốn thấp liên kết mồi khuôn giảm dẫn đến hiệu khuếch đại phản ứng giảm Ảnh hưởng thời gian ủ đến hiệu khuếch đại phản ứng LAMP Nhƣ đề cập trên, để tránh tƣợng dƣơng tính giả, nghiên cứu này, định không sử dụng mồi bắt cặp với vùng vòm (loop primers) Điều dẫn đến thời gian phản ứng LAMP bị kéo dài Với mục tiêu rút ngắn thời gian phân tích nhƣng đảm bảo độ nhạy phản ứng, thử nghiệm phản ứng LAMP với lƣợng DNA khuôn L monocytogenes 0,2 pg/phản ứng; thời gian ủ 45, 60, 75 phút Sau đó, thực việc đánh giá hiệu khuếch đại điều kiện cách điện di sản phẩm LAMP gel agarose Kết điện di thể Hình 3-6 Kết Hình 3-6 cho thấy mẫu âm tính ủ điều kiện tối ƣu 75 phút không 88 Theo nghiên cứu trƣớc cho thấy phƣơng pháp phát sản phẩm LAMP có ảnh hƣởng trực tiếp đến độ nhạy phản ứng LAMP Trong nghiên cứu tiến hành so sánh độ nhạy phản ứng LAMP sử dụng hai phƣơng pháp phát sản phẩm LAMP hay đƣợc sử dụng phƣơng pháp điện di phát chất thị màu hydroxy naphthol blue (HNB) [79] Kết thể Hình 3-9 Hình 3-10 Kết cho thấy độ nhạy hai phƣơng pháp phát sản phẩm LAMP nghiên cứu tƣơng đƣơng Trong nghiên cứu sử dụng hai phƣơng pháp phát thay nhau, nhiên phân tích thực tế sử dụng phƣơng pháp phát sản phẩm LAMP phản ứng màu cho nhiều ƣu điểm nhƣ nhanh, tránh nhiễm chéo mở nắp ống dễ dàng thực trƣờng sử dụng thiết bị điện di So sánh độ nhạy mồi LAMP thiết kế với mồi LAMP công bố Khi so sánh độ nhạy mồi thiết kế đƣợc với mồi nghiên cứu khác phát L monocytogenes kỹ thuật LAMP thấy độ nhạy dao động lớn Có nghiên cứu có độ nhạy tƣơng tự nhƣ nghiên cứu nhƣ nghiên cứu Rina cho độ nhạy với phản ứng LAMP 100 CFU/ phản ứng 25 ml [202] Wang sử dụng mồi LAMP dựa trình tự gen hlyA cho độ nhạy 100 CFU/ phản ứng [194] Tuy nhiên có nghiên cứu trƣớc cho thấy, độ nhạy phản ứng LAMP phát đƣợc ngƣỡng nhiễm tạp thấp nhƣ 8-10 tế bào/ ống phản ứng [192]; CFU/ phản ứng [183] Để định có sử dụng mồi thiết kế đƣợc cho phƣơng pháp LAMP, tiến hành phản ứng LAMP với mồi, mồi LAMP thiết kế đƣợc với mồi tham chiếu đƣợc công bố trình tự (trình tự cụ thể phụ lục) cho gen iap [192]; hlyA [183] mồi hlyA [195] Các phản ứng LAMP đƣợc tiến hành điều kiện tối ƣu nghiên cứu công bố với lƣợng DNA thể gen từ chủng L monocytogenes EGD-e độ pha loãng liên tiếp (10-7; 10-6; 10-5; 10-4) Đánh giá hiệu khuếch đại điện di µl sản phẩm gel agarose % Kết thể Hình 3-11 Kết cho thấy công bố trƣớc phản ứng LAMP gen khác cho độ nhạy cao, nhiên thử nghiệm so sánh với mồi nghiên cứu thấy mồi hlyA [183] mồi hlyA [194] cho kết dƣơng tính giả Hiện tƣợng bắt cặp mồi với Mồi iap [192] cho kết dƣơng tính độ pha loãng 10-5 Trong mồi LAMP gen inlJ nghiên cứu cho kết dƣơng tính độ pha loãng 10-6 Qua kết cho thấy mồi đƣợc thiết kế cho kết tốt mồi thử nghiệm 92 đồng thời với việc loại bỏ tạp chất gây ức chế phản ứng nhân gen Giải pháp thích hợp cho vấn đề sử dụng bi từ gắn kháng thể để cô đặc đồng thời làm sinh khối tế bào Theo nghiên cứu trƣớc đây, hiệu suất thu hồi sử dụng bi từ gắn kháng thể để cô đặc làm sinh khối L monocytogenes đạt khoảng 0.05-3.35% số kít thƣơng mại, số kít sử dụng kháng thể đơn chuỗi phòng thí nghiệm đạt khoảng 1,38-19,04% [138] Với hiệu suất trên, mẫu có mật độ nhiễm thấp (xấp xỉ 10 CFU/25 g) việc sử dụng bi từ gắn kháng thể để cô đặc mẫu không tăng sinh không khả thi Trong nghiên cứu này, sử dụng loại kháng thể sau: Kháng thể đa dòng thỏ kháng L monocytogenes ab35132 Kháng thể đặc hiệu với toàn tế bào L monocytogenes, nhiên phản ứng với số loài có nguồn gốc gần gũi khác Kháng thể đơn dòng chuột kháng L monocytogenes ab11439 Kháng thể phản ứng với màng tế bào toàn tế bào Kháng thể không phản ứng với loài E coli, Salmonella, Y pestis, F tularensis, L pneumophila B abortus Tuy vậy, Ab11439 phản ứng với L innocua L ivanovii Hai kháng thể đƣợc gắn bi từ nhằm cô đặc tế bào vi khuẩn sau tăng sinh nhẹ Tuy nhiên hiệu suất thu hồi đạt không cao, thể giá trị Ct phản ứng realtime PCR với DNA đƣợc tách chiết từ mẫu có sử dụng bi từ gắn kháng thể để cô đặc làm cao hẳn so với mẫu đối chứng (kết đƣợc trình bày cụ thể phần phụ lục) Chính không sử dụng phƣơng pháp cô đặc làm tế bào vi khuẩn từ canh trƣờng tăng sinh hạt từ gắn kháng thể mà chuyển hƣớng giảm thời gian tăng sinh sang việc tìm điều kiện tăng sinh thích hợp cho quy trình phân tích phát L monocytogenes mẫu thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu tìm điều kiện tăng sinh chọn lọc thích hợp cho sinh trƣởng L monocytogenes từ làm giảm thời gian toàn trình phân tích Có hai đích cần nhắm tới Một là thành phần giúp vi sinh vật đích phát triển tốt nhƣ loại môi trƣờng tăng sinh số thành phần dinh dƣỡng quan trọng nhƣ nito giúp xây dựng tế bào, piruvate giúp phục hồi tế bào bị tổn thƣơng Hai thành phần giúp ức chế phát triển vi sinh vật khác nhiễm tạp mẫu, giảm ức chế cạnh tranh với vi sinh vật đích Trong phƣơng pháp phân tích L monocytogenes, có nhiều môi trƣờng sử dụng tăng sinh đƣợc thƣơng mại hóa Tuy nhiên môi trƣờng đƣợc sản xuất với mục tiêu sử dụng cho nhiều phƣơng pháp phát L monocytogenes khác Trong có phƣơng pháp phát dựa nuôi cấy cần chọn lọc lớn (nồng độ kháng sinh cao) nhằm ức chế loại vi sinh vật khác L monocytogenes Tuy nhiên điều làm loại môi trƣờng có khả ức chế tƣơng đối lớn lên phát triển vi khuẩn đích L monocytogenes Trong sử dụng phƣơng pháp phát dựa kỹ thuật nhân gen nhƣ PCR; LAMP, độ đặc hiệu 94 pháp sử dụng Triton X100 cho kết tách chiết tƣơng đƣơng Phƣơng pháp tách chiết DNA thông thƣờng làm DNA tốt, qúa trình tách chiết phực tạp nhiều thời gian sử dụng nhiều dung môi độc hại, không phù hợp cho phân tích thực tế số mẫu lớn So sánh kết với kết Hình 3-15 cho thấy độ chênh lệch hiệu làm DNA phƣơng pháp đơn giản (NaOH Triton X100) so với phƣơng pháp kít thông thƣờng mẫu thực phẩm đƣợc khuếch đại nhiều so với tiến hành mẫu (không có thực phẩm) Kết cho thấy mật độ vi khuẩn đích không đủ (tăng sinh ngắn, mật độ ban đầu thấp), phản ứng nhân gen yêu cầu DNA có độ tinh cao (real-time PCR) cần sử dụng phƣơng pháp tách chiết DNA có công đoạn làm tốt nhƣ phƣơng pháp kít phƣơng pháp thông thƣờng để đảm bảo kết phân tích không bị âm tính giả Ngƣợc lại mật độ vi khuẩn đích đủ lớn cho phản ứng nhân gen thêm có phản ứng nhân gen yêu cầu DNA với độ tinh không cao (LAMP) sử dụng phƣơng pháp tách chiết đơn giản (NaOH Triton X100) cho đơn giản mà hiệu Trong nghiên cứu có thử nghiệm sử dụng bi từ gắn kháng thể để cô đặc làm vi khuẩn sau giai đoạn tăng sinh Tuy nhiên hiệu làm cô đặc L monocytogenes từ mẫu thực phẩm sau tăng sinh cho hiệu không cao Mục tiêu cô đặc làm mẫu không đạt yêu cầu nên kết cụ thể không đƣợc trình bày phần kết luận án (đƣợc trình bày phần phụ lục) Tuy nhiên thí nghiệm rửa giải vi khuẩn khỏi hạt từ tách chiết DNA từ vi khuẩn thu đƣợc, kết cho thấy sử dụng đệm glycine-tris pH 8,3 theo khuyến cáo nhà cung cấp hạt từ (Gencrip) cho khả tách chiết DNA tốt so với NaOH 100 mM Chính thí nghiệm tiếp theo, tiến hành so sánh khả tách chiết DNA từ canh trƣờng tăng sinh mẫu xúc xích hun khói theo phƣơng pháp: sử dụng Triton X100 1,2 % với điều kiện đƣợc tối ƣu (gia nhiệt 95oC phút, siêu âm phút) sử dụng đệm glycine-Tris 100 mM pH 8,3 với điều kiện tƣơng tự (gia nhiệt 95oC phút, siêu âm phút) Kiểm tra hiệu suất tách chiết phản ứng real-time PCR Kết chu kỳ ngƣỡng phản ứng realtime PCR đƣợc thể Hình 3-17 Kết cho thấy đệm glycine-tris cho hiệu tách chiết tốt Triton X 100 Từ kết phƣơng pháp tách chiết đƣợc lựa chọn nghiên cứu sử dụng đệm glycine-tris 100 mM, pH 8,3 với điều kiện gia nhiệt 95oC phút, siêu âm phút 106 Nhiễm chủ động CFU/ 25 g, ml sản phẩm (song song làm mẫu đối chứng không nhiễm), tăng sinh 10, 12, 14 giờ, lấy mẫu cho tách chiết thu DNA cho phản ứng LAMP phát sản phẩm LAMP theo hai cách điện di phản ứng màu với HNB Đồng thời phân tích phát mẫu tăng sinh phản ứng PCR với cặp mồi hlyA Kết thể Hình 3-23 Hình 3-24 Kết cho thấy mẫu xúc xích tất thí nghiệm cho kết dƣơng tính với phản ứng LAMP Tuy nhiên mẫu xúc xích thực phản ứng PCR, thời điểm 10 với mật độ nhiễm ban đầu CFU (đƣờng chạy số 4), cho kết gần nhƣ âm tính Ở mật độ nhiễm CFU (đƣờng chạy số 7) mặc kết dƣơng tính nhiên kết mờ nhạt, không rõ ràng Trên mẫu mayonair mẫu sữa, thời điểm lấy mẫu 12 14 cho kết dƣơng tính rõ ràng phản ứng LAMP, phân tích mẫu phản ứng PCR, mẫu mayonair cho kết dƣơng tính thời điểm lấy mẫu 12 14 giờ, nhiên thời điểm 12 giờ, băng sản phẩm mờ nhạt, mẫu sữa thời điểm lấy mẫu 12 14 cho kết âm tính với phản ứng PCR (kết điện di sản phẩm PCR đƣợc trình bầy phụ lục) Phản ứng LAMP mẫu khác sử dụng nghiên cứu có độ nhạy cao so với phản ứng PCR mẫu Kết tƣơng đồng với kết nhiều nghiên cứu trƣớc ngƣỡng phát phản ứng LAMP thấp phản ứng PCR [183]; [195]; [192] Đặc biệt với mẫu sữa phản ứng LAMP thí nghiệm có độ nhạy gấp 100 lần so với phản ứng PCR Có thể mẫu sữa, có vi sinh vật sinh trƣởng có thủy phân protein mẫu, làm lộ đầu kị nƣớc micelle casein, làm cho protein vốn hòa tan dễ loại bỏ mẫu sữa trở thành dạng protein kết tủa sinh khối không hòa tan Trong nghiên cứu mục tiêu nghiên cứu rút ngắn thời gian phân tích, phƣơng pháp tách chiết sử dụng phƣơng pháp đơn giản, sử dụng ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối nƣớc, hòa tan sinh khối vào đệm glycine pH 8,3, gia nhiệt 95 oC phút, siêu âm phút Với phƣơng pháp đơn giản không loại bỏ đƣợc hoàn toàn tạp chất mẫu sữa dẫn đến phản ứng PCR bị ức chế Trong trƣờng hợp sử dụng phản ứng PCR cho phân tích, cần tăng thêm thời gian tăng sinh, sau pha loãng dung dịch DNA để giảm bớt nồng độ chất ức chế thay đổi phƣơng pháp xử lý mẫu canh trƣờng tách chiết thu DNA Với mẫu thịt, đƣợc đồng hóa, nhiên kích thƣớc phần tử mẫu to, độ lắng phần tử lớn nên lấy mẫu, dễ dàng lấy đƣợc phần canh trƣờng không chứa mẫu Điều làm cho việc sử dụng quy trình tách chiết đơn giản nghiên cứu không ảnh hƣởng nhiều đến độ nhạy phƣơng pháp PCR, kết phản ứng LAMP PCR mẫu thịt gần tƣơng đồng (chênh gần 10 lần) Qua thí nghiệm chọn thời gian tăng sinh cho mẫu thịt ≥ 10 giờ, cho mẫu sữa mayonair ≥ 12 109 mồi FIP BIP; 0,33 µM mồi F3 B3; 200 µM HNB Thể tích 12 µl, số lƣợng 10 ống eppendorf 0,5 ml - Dung dịch B có thành phần nhƣ sau: Bst 120 U (1 ống x 15 µl) - Dung dịch C: Nƣớc (ultrapure, DNAse, RNAse free) (1 ống x 50 µl) Dung dịch D: Kiểm chứng dƣơng tính: 20 µl dung dịch DNA L monocytogenes với nồng độ 1000 sao/µl Điều kiện bảo quản sinh phẩm Bộ sinh phẩm đƣợc thiết kế gồm phần riêng biệt phần môi trƣờng tăng sinh (LAMPL’MONO – M) đƣợc bảo quản oC, phần loại hóa chất cho tách chiết phản ứng LAMP (LAMP-L’MONO – D) đƣợc bảo quản điều kiện - 20 oC Theo hƣớng dẫn sử dụng bảo quản hóa chất thể chƣa trộn lẫn thành hỗn hợp hoá chất cho phản ứng LAMP tách chiết DNA hoàn toàn bền nhiệt độ - 20 oC Theo nghiên cứu Oriel cộng sự, hóa chất sử dụng cho phản ứng LAMP bền điều kiện nhiệt độ trời (25oC ,37oC) khoảng thời gian tháng [186] Một số vật tƣ, hóa chất thiết bị cần cho phát không bao gồm kít đƣợc trình bày cụ thể Phụ lục X 3.2.6.2 Sản xuất thử nghiệm sinh phẩm LAMP-L’MONO Bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO đƣợc sản xuất thử nghiệm với quy trình sản xuất nhƣ Hình 3-23 Thuyết minh qui trình: Mix LAMP đƣợc pha với nồng độ chất nhƣ sau: 33,33 mM Tris-HCl; 16,66 mM KCl; 13,33 mM MgSO4; 0,16% Triton X-100; 1.66 mM dNTP, M betain, 2,66 µM mồi FIP BIP; 0,33 µM mồi F3 B3, 0,2 mM HNB Phối trộn vortex, spindown phân phối vào ống eppendorf dung tích 0,5 ml ống chứa 12 µl hỗn hợp mix (ống A) Đệm chiết đƣợc phân phối vào ống eppendorf dung tích 1.5ml ống 1.5 ml đệm glycine pH 8.3 (ống số 1) DNA L monocytogenes đƣợc phân phối vào ống eppendorf dung tích 0.5 ml ống 20 µl DNA với mật độ khoảng 1000 sao/µl (ống D) H2O (ultrapure, DNAse, RNAse free) đƣợc phân phối vào ống eppendorf dung tích 0,5 µl ống 50 µl (ống C) 115 30 Phát Phát 14 Phát Phát 18 Phát Phát 22 Phát Phát 24 Phát Phát 25 Phát Phát 27 Phát Phát 28 Phát Phát Phát Phát Phát Phát Phát Phát 29 Phát Phát Phát Phát 26 Phát Phát Âm tính Âm tính 50 100 250 Phân tích kết cho thấy Độ xác tƣơng đối: AC = ((PA+NA)*100)/(PA+NA+PD) = (27+2)*100/(27+2+1)= 96,66 % Độ nhạy tƣơng đối: SE= PA *100/(PA+PD) = 27 *100/(27+1) = 96,43 % Độ đặc hiệu tƣơng đối: SP = NA*100/(ND+NA) = 2*100/(0+2) = 100 % Tỷ lệ dƣơng tính giả PN = ND * 100/(PA+NA+PD) = % Kết cho thấy độ xác độ nhạy tƣơng đối phƣơng pháp LAMP nghiên cứu tƣơng đƣơng phƣơng pháp LAMP nghiên cứu nhóm tác giả Nguyễn thị Anh Đào [3] sản phẩm thịt sữa với độ xác lần lƣợt 95 % 98,33 % độ nhạy lần lƣợt 93,33 % 96,67 % Nghiên cứu Wang [194] gen hlyA cho độ nhậy tƣơng đối 96,7 % Tuy nhiên độ đặc hiệu tƣơng đối phƣơng pháp LAMP nghiên cứu đạt giá trị tuyệt đối 30 mẫu thử (100%), phƣơng pháp LAMP tác giả Nguyễn thị Anh Đào độ đặc hiệu đạt 96,67 % mẫu thịt 100 % mẫu sữa Điều thêm lần khẳng định mồi LAMP đƣợc thiết kế gen inlJ cho độ đặc hiệu cao Đây ƣu điểm trội phƣơng pháp LAMP so với phƣơng pháp LAMP trƣớc áp dụng L monocytogenes 118 STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tên mẫu Xúc xích gà hun khói NSX: 05/11/2014 HSD: 05/12/2014 Xúc xích Đức xông khói NSX: 28/10/2014 HSD: 27/11/2014 Xúc xích phô mai NSX: 01/11/2014 HSD: 13/12/2014 Xúc xích Klobase- mini NSX: 06/11/2014 HSD: 06/12/2014 Jambon Da bao NSX: 01/11/2014 HSD: 13/12/2014 Jăm bong xông khói NSX: 19/11/2014 HSD: 07/12/2014 Jăm hấp NSX: 19/11/2014 HSD: 19/12/2014 Thăn lợn hun khói NSX: 16/11/2014 HSD: 26/12/2014 Xúc xích Đức 3D NSX: 10/11/2014 HSD: 08/12/2014 Ba rọi xông khói NSX: 10/11/2014 HSD: 20/12/2014 Ba rọi hun khói NSX: 21/11/2014 HSD: 31/12/2014 Xúc xích tỏi NSX: 19/11/2014 HSD: 31/12/2014 Xúc xich hotdog NSX: 15/11/2014 HSD: 25/12/2014 Kết xét nghiệm Âm tính Âm tính Âm tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Âm tính Âm tính Âm tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính 120 STT 23 24 25 26 27 28 29 30 Tên mẫu Xúc xích CP NSX: 24/11/2014 HSD: 17/01/2014 Xúc xích nƣớng Klobasa NSX: 10/11/2014 HSD: 10/12/2014 Xúc xích Đức xông khói NSX: 22/11/2014 HSD: 02/01/2014 Xúc xích cocktail NSX: 20/11/2014 HSD: 01/01/2015 Xúc xích tỏi NSX: 17/11/2014 HSD 27/12/2014 Jambon vai xông khói NSX: 07/11/2014 HSD: 17/12/2014 Xúc xích Klobasa – mini NSX: 09/11/2014 HSD: 19/12/2014 Xúc xích Francfort bò NSX: 14/11/2014 HSD: 26/12/2014 Kết xét nghiệm Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Dƣơng tính Dƣơng tính Dƣơng tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Ghi chú: (1) Quy trình xét nghiệm sinh phẩm phát nhanh L monocytogenes trƣờng ĐH Bách Khoa cung cấp (2) Thử nghiệm đối chứng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống TCVN 7700-1:2007 (ISO 11290-1:1996) (3) Quy trình xét nghiệm sinh phẩm xét nghiệm PCR phát L monocytogenes trƣờng ĐH Bách Khoa cung cấp Kết cho thấy 30 mẫu thực phẩm lấy thị trƣờng có 10 mẫu cho kết dƣơng tính phƣơng pháp Phƣơng pháp sử dụng sinh phẩm LAMP-L’MONO có độ tƣơng đồng cao với hai phƣơng pháp tham chiếu PCR, TCVN 7700-1:2007 So sánh kết với kết kiểm định cho thấy độ xác độ nhạy tƣơng đối phƣơng pháp LAMP nghiên cứu thực mẫu thực phẩm lấy thị trƣờng cao so với mẫu nhiễm chủ động (lần lƣợt 100 %, 100 %, 96,66 % 96,43 %) Trƣờng hợp có sai khác kết phƣơng pháp LAMP phƣơng pháp tham chiếu loạt mẫu kiểm định mẫu có mật độ nhiễm lý thuyết CFU/ 25 g Mặc dù Việt Nam chƣa có nghiên cứu khảo sát mật độ nhiễm L monocytogenes mẫu thực phẩm thị trƣờng Tuy nhiên theo khuyến cáo FDA [84], 121 nhiệt độ -0,4 đến oC thời gian hệ L monocytogenes ngày, nhiệt độ 6-10 o C, thời gian hệ ngày Hiện sản phẩm thịt hun khói xúc xích hun khói ăn thị trƣờng Việt Nam có khuyến cáo bảo quản - oC, thời gian bảo quản khoảng 40 ngày Với điều kiện bảo quản này, sản phẩm ban đầu nhiễm tế bào sau 35 ngày, số lƣợng tế bào L monocytogenes sản phẩm đạt 32 tế bào Nếu điều kiện bảo quản không đạt - oC nhƣ khuyến cáo số nhiễm tăng lên nhanh chóng Chính điều làm cho mẫu thực phẩm nhiễm thƣờng có mật độ cao Có công bố cho thấy có mẫu thịt nhiễm đến 5.8 × 103 CFU/g sản phẩm [92] Đây lý mà lấy mẫu thị trƣờng kết phân tích cho độ xác cao so với mẫu nhiễm chủ động phòng thí nghiệm với mật độ thấp 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Phùng Thị Thủy, Phan Hƣơng Trà, Đỗ Thị Thu Hƣơng, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa (1012) Khảo sát nhiễm tạp L monocytogenes số thực phẩm ăn liền Hà Nội Tạp chí y học thực hành, 842: 209-212 Phùng Thị Thủy, Lê Thị Thu Hiền, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa (2013) Nghiên cứu ảnh hưởng số tác nhân vật lý hóa học đến khả tách chiết DNA L monocytogenes Tạp chí khoa học công nghệ, 6A (51) 137-144 Phùng Thị Thủy, Tô Kim Anh, Phạm Tiến Dũng, Lê Quang Hòa (2015) Nghiên cứu phát triển phản ứng LAMP phát nhanh L monocytogenes Tạp chí Công nghệ sinh học, 2A (13): 665-672 Phung Thi Thuy, To Kim Anh, Le Quang Hoa (2015) Optimiztion of an enrichment broth for rapod detection of Listeria monocytogenes by molercular techniques Tạp chí khoa học công nghệ, 4B (53) 191-199 125 [...]... nhiễm cao nhất là xúc xich và thịt hun khói c t lát 2 Đặc điểm dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập được cho thấy: 48 chủng L monocytogenes phân lập được chia thành 2 lineage, lineage I có 40 chủng và lineage II có 8 chủng Các chủng thuộc lineage I có nguy cơ gây dịch bệnh cao hơn lineage II Các chủng phân lập được chia thành 9 CC trong đó có 19 chủng thuộc ECIV và 1 chủng thuộc ECI có. .. phẩm ……………………………………………………… 64 2.3.17 Ứng dụng thử nghiệm bộ sinh phẩm ……………………………………………64 3 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Phân lập và nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập từ một số thực phẩm Việt Nam 66 3.1.1 Phân lập L monocytogenes từ các mẫu thực phẩm 66 3.1.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes phân lập 709 3.1.2.1 Giải trình tự các... thiết kế và chế tạo thành công bộ sinh phẩm LAMP-L’MONO phát hiện nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm Bộ sinh phẩm được kiểm định cho kết quả có độ 23 tương đồng cao với các phương pháp truyền thống theo ISO 11290-1: 1996 và TCVN 7700-1:2007 Kiến nghị: Do đây mới chỉ là các nghiên cứu bước đầu về dịch tễ học phân tử các chủng L monocytogenes tại Việt Nam nên số lượng chủng phân lập được chưa... các chủng phân lập từ người và từ các vụ dịch bệnh listeriosis cũng như các chủng phân lập từ môi trường nhà máy hoặc nguy n liệu sản xuất thực phẩm Cần có các nghiên cứu tiếp theo bổ sung các mảng còn thiếu trên để có thể có một bức tranh hoàn thiện về tình hình dịch tễ các chủng L monocytogenes đang lưu hành tại Việt Nam và các phán đoán về các mối liên quan giữa môi trường sản xuất, sản phẩm thực phẩm. .. tăng sinh dựa trên giá trị chu kỳ ngư ng (Ct) của phản ứng real-time PCR, kết quả được thể hiện trên Bảng 3-4 sau: Bảng 3-4 nh hư ng của loại môi trường cơ bản đến sự t ng sinh của L monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại môi trƣ ng cơ bản TSBYE TSBYE có không Kháng có sinh kháng sinh BLEB có kháng sinh BLEB không có kháng sinh Half fraser có kháng sinh UVM không có kháng sinh. .. Vai trò của internalin J (inlJ) trong quá trình gây bệnh của L monocytogenes …20 1.1.3 Tình hình nhiễm tạp trong thực phẩm và gây bệnh của L monocytogenes 23 1.1.4 Quy định kiểm soát L monocytogenes 24 1.2 Dịch tễ học phân tử của L monocytogenes 25 1.2.1 Đặc điểm dịch tễ các dòng giống (lineage) L monocytogenes 25 1.2.2 Đặc điểm dịch tễ các dòng phức hợp (clones complex) L monocytogenes. .. từ chủng phân lập từ vụ dịch tại Pháp năm 1993 Đa số các chủng còn lại, trình tự gen giống các chủng phân lập từ thực phẩm và gần giống các trình tự phân lập từ người hoặc gây ra các vụ dịch nhỏ trên thế giới 3.2 Xây dựng quy trình phân tích nhanh Listeria monocytogenes trong thực phẩm dựa trên kỹ thuật LAMP 3.2.1 Xây dựng phản ứng LAMP 3.2.1.1 Thiết kế mồi LAMP khuếch đại gen inlJ 6 Trong nghiên cứu. .. và 10 mg l) trong 12 giờ, được kết quả như Bảng 3-5 Bảng 3-5 nh hư ng của hai loại môi trường cơ bản LE và HF đến sự sự t ng sinh của L monocytogenes trong canh trường t ng sinh mẫu thực phẩm Loại trƣ ng Ct môi BLEB có kháng sinh 31,57 ± 0,98 Half fraser có kháng sinh 33,29 ± 0,68 Qua thí nghiệm này, môi trường BLEB được chọn là môi trường cơ bản cho tăng sinh L monocytogenes 3.2.2.2 nh hư ng của một. .. mẫu thực phẩm lấy trên thị trường có 10 mẫu cho kết quả dương tính cả 3 phương pháp Phương pháp sử dụng bộ sinh phẩm có độ tương đồng 100% với hai phương pháp tham chiếu là PCR và TCVN 7700-1:2007 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án đã thu đƣợc những kết quả chính sau: 1 Đã phân lập được 59 chủng L monocytogenes từ 543 mẫu thực phẩm Việt Nam với tỷ lệ nhiễm chung là 10,87 % Trong đó có 2 loại thực phẩm có. .. joining) với độ lặp lại (bootstrap) 1000 Xây dựng được cây phân loại như Hình 3-3 Hình 3-3 Cây phân loại các nh m chủng L monocytogenes đã phân lập được từ thực phẩm Chữ đ : T n các nh m và ký hiệu các chủng, dự đoán kiểu serotype của các chủng L monocytogenes phân lập được từ thực phẩm Việt Nam Chữ đen: Các chủng L monocytogenes đã từng gây ra các vụ bùng phát dịch bệnh tr n thế gi i đã công b trình tự 7