nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện hiv bằng dot blot với các protein gp120, gp41, p24 tái tổ hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 1 MỤC LỤC CHƢƠNG I TỔ NG QUAN Mở đầ u 1.1 Tnh hnh nhim HIV/AIDS trên thế giớ i 1.1.1 Lch s qu trnh pht hin HIV/AIDS. 1.1.2 Tnh hnh nhim HIV/AIDS trên thế giớ i. 1.2 Tnh hnh nhim HIV/AIDS và nghiên cƣ́ u HIV ở Vit Nam. 1.3 Đc đim của HIV 1.3.1 Giớ i thiệ u chung. 1.3.2 Đc đim hnh thi cấu trc HIV 1.4 Phân loạ i HIV. 1.4.1 HIV-1 1.4.2 HIV-2 1.5 Đc đim sinh vật hc của HIV. 1.6 Nguồ n truyề n nhiễ m và đố i tƣợ ng cả m thụ HIV. 1.7 Cc phƣơng thc lây truyn của HIV 1.8 Sƣ̣ xâm nhậ p tế bà o và nhân lên củ a HIV. 1.9 Đá p ƣ́ ng miễ n dị ch củ a cơ thể khi nhiễ m HIV/AIDS. 1.9.1 Nhƣ̃ ng thay đổ i miễ n dị ch khi nhiễ m HIV. 1.9.2 Suy giả m miễ n dị ch do nhiễ m HIV. 1.9.3 Diễ n biế n huyế t thanh ngƣờ i nhiễ m HIV/AIDS. 1.10 Cc k thuật pht hin HIV trong cơ th. 1.10.1 Pht hin trc tiếp s c mt của HIV. 1.10.2 Pht hin khng nguyên của HIV. 1.10.3 Cc k thuật sinh hc phân t trong xt nghim HIV. 1.10.4 Pht hin gin tiếp s c mt của HIV. 1.10.5 Cc b sinh phm chn đon HIV. 1.10.6 Nghiên cƣ́ u cá c protein tá i tổ hợ p để tạ o kit chẩ n đoá n. 1.11 Điề u trị HIV/AIDS CHƢƠNG II ĐỐ I TƢỢ NG, VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U 2.1 Đối tƣợng, vậ t liệ u. 2.1.1 Đối tƣợng. 2.1.2 Cc sinh phm 2.1.3 Ha chất vật liệ u 2.1.4 Dung dịch và môi trƣờ ng 3 5 5 7 8 10 10 10 15 15 18 18 19 19 20 23 23 24 26 28 28 29 30 31 34 35 37 40 40 40 40 40 40 Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 2 2.1.5 Thiế t bị và má y mó c 2.2 Phƣơng phá p nghiên cƣ́ u 2.2.1 Phƣơng phá p điệ n di trên gel và polyacrylamide. 2.2.2 Phƣơng phá p biể u hiệ n protein tá i tổ hợ p trong E. coli chủ ng BL21. 2.2.3 Tinh chế protein dung hợ p bằ ng cộ t Probond Nikel Resin. 2.2.4 Phƣơng phá p Western blot 2.2.5 Định lƣợ ng protein bằ ng phƣơng phá p Bradford 2.2.6 Nuôi cấ y biể u hiệ n và thu nhậ n protein tá i tổ hợ p gp120 2.2.7 Nuôi cấ y biể u hiệ n và thu nhậ n protein tá i tổ hợ p gp41 2.2.8 Nuôi cấ y biể u hiệ n và thu nhậ n protein tá i tổ hợ p p24. 2.2.9 Phƣơng phá p chế tạ o bộ kit dot blot chẩ n đoá n HIV CHƢƠNG III KẾ T QUẢ ĐẠ T ĐƢỢ C 3.1 Biể u hiệ n protein tá i tổ hợ p gp120. 3.2 Tinh chế protein tá i tổ hợ p. 3.3 Nghiên cƣ́ u khả năng phả n ƣ́ ng gp120 ti t hợp vi khng th khng HIV trong huyế t thanh bệ nh nhân HIV bằ ng western blot. 3.4 Kế t quả biể u hiệ n, tinh sạ ch gp41 của HIV-1 phân type CRF01_AE. 3.4.1 Tố i ƣu hó a điề u kiệ n biể u hiệ n và xá c định trạ ng thá i gp41 ti t hợp. 3.4.2 Tinh sạ ch gp41 ti t hợp 3.5 Kiể m tra khả năng phá t hiệ n khá ng thể khá ng HIV trong huyế t thanh bệ nh nhân bằ ng western blot. 3.6 Biể u hiệ n và tinh sạ ch protein p24 3.7 Pht hin khng th trong huyết thanh bệ nh nhân. 3.8 Kế t quả nghiên cƣ́ u chế tạ o bộ kit dot blot chẩ n đoá n HIV. KẾ T LUẬ N KIẾ N NGHỊ PHỤ LỤC 44 45 45 46 47 50 50 53 53 54 55 57 57 58 59 61 61 62 65 66 66 66 68 75 77 TI LIU THAM KHO 87 Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 3 MỞ ĐẦU Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đƣơng đầu vi đại dch HIV/AIDS nguy him, có tốc đ lây truyn cao, chƣa c vacxin phòng bnh và chƣa c thuốc điu tr đc hiu. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cƣp đi hàng triu sinh mạng trên thế gii mà còn là him ha tc đng nghiêm trng đến mi khía cạnh của đời sống xã hi làm ảnh hƣởng ti kinh tế, văn ho, xã hi, nòi giống của mỗi quốc gia. Theo báo cáo của T chc phòng chống AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và T chc Y tế thế gii (WHO), đến năm 2008 trên thế gii có 33,4 triu ngƣời đang sống chung vi HIV, mỗi năm c 2,7 triu ngƣời nhim mi và 2 triu ngƣời t vong do AIDS. Tại Vit Nam, từ khi ca nhim đầu tiên đƣợc thông bo vào năm 1990 ở thành phố Hồ Chí Minh, số lƣợng ngƣời nhim HIV đang ngày càng tăng lên. Tính đên 31/3/2009, toàn quốc c 144.483 ngƣời nhim HIV, 30.996 ngƣời đã chuyn sang giai đoạn AIDS còn sống, 42.447 ngƣời đã t vong vì AIDS . Có hai type HIV gây bnh ở ngƣời là HIV-1 và HIV-2. Tuy nhiên, HIV-2 chỉ lƣu hành ở châu Phi, còn HIV-1 th lƣu hành rng rãi và gây bnh chủ yếu ở tất cả các châu lục. Da vào s biến đi v gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3 nhóm M, N và O. Các nhóm này có th đƣợc chia ra thành các phân type, mỗi phân type lại có phân vùng đa lý khác nhau. Ngoài các phân type, các th tái t hợp giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hin ngày càng nhiu và làm cho vic nghiên cu v HIV-1 ngày càng trở nên phc tạp và kh khăn [41]. Hiu đƣợc s lƣu hành của cc phân type HIV cũng nhƣ cc th tái t hợp của chúng ở mỗi vùng đa lý khác nhau không chỉ c ý ngha quyết đnh cho vic nghiên Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 4 cu và trin khai vắc xin phòng chống HIV mà còn có giá tr trong sản xuất kit chn đon thích hợp cho từng vùng. Các công trình nghiên cu v HIV có s phân bit ƣu tiên theo đa lý các nƣc giàu nghèo. Phân type C xuất hin chủ yếu tại châu Phi, châu Á và phân type CRF01_AE lƣu hành chủ yếu tại cc nƣc khu vc Đông Nam Á, tuy nhiên hầu hết các nghiên cu v HIV hin nay đu tập trung vào phân type B, v phân type này lƣu hành chủ yếu ở cc nƣc phát trin. Nghiên cu đ biết rõ hơn v đc tính di truyn và kháng nguyên của các phân typ HIV lƣu hành chủ yếu ở Vit Nam từ đ chế tạo các b kit chn đon huyết thanh hc c đ nhạy và đ đc hiu cao trên cơ sở các kháng nguyên tái t hợp GP120, GP41 và P24 biu hin từ cc phân typ HIV lƣu hành ở Vit nam là mục tiêu của đ tài “Nghiên cu chế tạo b sinh phm phát hin HIV bằng dot blot vi các protein GP120, Gp41 và P24 tái t hợp” Đ tài đƣợc đt ra vi các mục tiêu cụ th sau: - Tạo ra đƣợc các kháng nguyên GP120, GP41, P24 c đ tinh sạch, đ đc hiu đảm bảo cho chế tạo kit chn đon. - Xây dng đƣợc quy trình công ngh sản xuất b kit chn đon HIV bằng dot blot,đ đc hiu cao có th s dụng cho chn đon HIV. Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 5 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1. Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS Quá trình din biến HIV/AIDS trên thế gii chia 3 giai đoạn [21]. - Thời kỳ “yên lng” 1970-1981. HIV đã bắt đầu xuất hin âm thầm từ những năm 70 của thế kỷ XX. Ngƣời ta đã tm thấy kháng th (KT) kháng HIV trong các mẫu mu đƣợc bảo quản ở Zaire (1959) và ở M (1970). - Thời kỳ phát hin virus 1981-1985. Ở thời kỳ này, các nhà khoa hc đã phân lập đƣợc virus, xc đnh đƣợc phƣơng thc truyn bnh và phát trin các k thuật phát hin virus. + Năm 1981, Trung tâm kim soát và phòng ngừa bnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã xc đnh đƣợc những bnh nhân mắc hi chng suy giảm min dch mắc phải (AIDS) đầu tiên trên thế gii da trên s phát hin và mô tả bnh của bác s Michạel Gottlieb v 5 thanh niên đồng tính luyến ái b viêm phi nng do Pneumocystis carinii ở Los Angeles và 226 nam thanh niên đồng tính luyến ái mắc ung thƣ da Sarcoma Kaposi. Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 6 Điu đc bit là ở những bnh nhân này đu có s suy giảm nng n h thống min dch, v cả số lƣợng và chc năng của tế bào min dch, quan trng nhất là s giảm tế bào TCD4. + Năm 1982, nhiu nơi đã công bố căn bnh tƣơng t nhƣ trên ở các bnh nhân phải truyn máu nhiu lần, ở cc đối tƣợng nghin chích ma tuý, ở những ngƣời mẹ và đa con do h đẻ ra. Cuối 1982, da trên những trƣờng hợp AIDS đầu tiên đƣợc thông bo, CDC đã đƣa ra tiêu chun đầu tiên v các triu chng lâm sàng chn đon bnh AIDS khi chƣa c phƣơng php xt nghim căn nguyên. + Năm 1985, Hi ngh danh pháp quốc tế đã thống nhất gi tên các virus LAV (Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III), ARV (AIDS Related Virus) là virus gây suy giảm min dch ở ngƣời (Human Immunodefiency Virus- HIV). + Năm1984-1985, đã xc đnh k thuật phát hin KT kháng HTLV III và chun hoá b sinh phm phát hin KT kháng HIV bằng k thuật min dch hấp phụ enzym ELISA đ sàng lc máu và phát hin lâm sàng - Thời kỳ 1985- nay: Đây là thời kỳ toàn thế gii chống AIDS. + Năm 1987, th nghim lâm sàng đầu tiên vi AZT (Azidothymidine) nhƣ mt thuốc chống Retrovirus. + Năm 1989, đƣa ra cc hƣng dẫn điu tr bằng AZT cho những ngƣời nhim HIV và bnh nhân AIDS trên cơ sở số lƣợng tế bào TCD4 của ngƣời bnh. Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 7 + Năm 1993, CDC đƣa ra tiêu chun đ xc đnh bnh AIDS. Luậ n văn cao họ cK12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễ n Quang Anh 8 1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới Đại dch HIV/AIDS tuy xuất hin chƣa lâu, mi bắt đầu vào những năm 70-80 của thế kỷ XX nhƣng đã nhanh chng lan tràn trên toàn cầu, tấn công mi đối tƣợng không phân bit la tui, ngh nghip, đa v xã hi nhƣ phụ nữ, trẻ em, thanh niên, ngƣời có tui, ngƣời đồng tính luyến i, ngƣời nghin chích ma tuý. Dch liên tục phát trin v cả không gian và thời gian trở thành đại dch nguy him. Đại dch này gồm nhiu vụ dch xảy ra ở từng nƣc, từng lục đa, c phƣơng thc lây truyn, biu hin lâm sàng đc trƣng riêng phụ thuc vào nguồn gốc virus, đối tƣợng nhim, điu kin kinh tế xã hi và tập quán từng nƣc. Ban đầu xuất hin, dch chủ yếu xảy ra tại cc nƣc công nghip phát trin ở Bắc M, Úc, và Tây Âu, tại các thành phố ln, ở những ngƣời đồng tính luyến i và ngƣời nghin chích ma tuý. Từ đ, dch lan tràn khắp cc nƣc, gây tác hại to ln tại châu Phi, vùng Caribe vi số lƣợng ngƣời nhim HIV rất cao. Đến nay, khu vc Nam phi vẫn là vùng có số lƣợng bnh nhân cao nhất trên thế gii và riêng tại khu vc Sahara đã c ti 25,8 triu ngƣời nhim HIV, chiếm 64% tng số ngƣời nhim HIV trên thế gii. Ở Châu Á, dch HIV/AIDS đến mun bắt đầu từ cuối những năm 80 của thế kỷ XX nhƣng pht trin rất nhanh vi phƣơng thc lây truyn đa dạng phản nh tính đa dạng v xã hi, kinh tế và văn ho.Theo d đon của WHO, đại dch HIV/AIDS sẽ có xu thế dch chuyn v Châu Á mà đim nóng là Thái lan, Ấn Đ, Campuchia và Indonesia.Vì vậy cần phải c cc chƣơng trnh khống chế và d phòng HIV/AIDS kp thời, mạnh mẽ. Mt tình trạng đng bo đng khi 70% ngƣời dân Ontania trên đảo Bomeo, Indonesia kết quả xét nghim HIV dƣơng tính. [...]... miễn dịch Đa số trƣờng hợp HIV phát triển chậm, tế bào bị nhiễm tiêu huỷ rất chậm Số ít trƣờng hợp HIV phát triển nhanh, tế bào bị nhiễm tiêu hủy nhiều, nồng độ RNA -HIV tăng và số lƣợng tế bào TCD4 giảm nhiều và nhanh, các biểu hiện lâm sàng (nhiễm trùng cơ hội) xuất hiện sớm Vì vậy, những cơ thể ở trạng thái này có thể phát hiện đƣợc HIV bằng các kỹ thuật phát hiện KT đặc hiệu... học phát hiện kháng thể kháng HIV trên cơ sở các kháng nguyên của HIV, hiện tại chúng ta vẫn phải nhập ngoại Để xây dựng đƣợc panel chuẩn cho tất cả các kit nhập ngoại thì không phải là điều dễ dàng Theo chúng tôi các Hãng trên thế giới không cho biết các kit của họ đƣợc chế tạo từ phân typ nào, do đó đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu khi phát hiện kháng thể kháng các chủng HIV lƣu... sẽ tổng hợp nên một protein lớn là p55 Khi virus trƣởng thành, protein này sẽ đƣợc cắt ra tạo nên các protein con là: MA(p17), CA (p24) , NC(p9) và p6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyên Quang Anh ̃ http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 Luân văn cao hocK12 ̣ ̣ Protein lõi p24 đƣợc mã hoá bởi nhóm gen gag là 1 KN đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn đoán nhiễm HIV vì P24 là protein có... văn cao hocK12 ̣ ̣ - HIV ở trạng thái provirus kéo dài trong nhiều tháng, nhiều năm: cDNA của virus tích hợp vào DNA tế bào chủ Khi virus tồn tại ở trạng thái này, cơ thể chƣa có KT kháng HIV trong huyết thanh nên không thể phát hiện HIV bằng các phản ứng huyết thanh học mà chỉ có thể nhận biết HIV bằng cách phân lập virus hoặc bằng kỹ thuật PCR Vì vậy, ngƣời nhiễm HIV ở trạng thái này... HÌNH NHIỄM HIV/ AIDS VÀ NGHIÊN CỨU HIV Ở VIỆT NAM Ở Việt Nam, dịch HIV/ AIDS đến muộn hơn các quốc gia khác nhƣng đang trở thành một trong những nguyên nhân chính gây tử vong cho cộng đồng Kể từ trƣờng hợp nhiễm HIV đầu tiên đƣợc phát hiện tháng 12/1990, đến tháng 12/1992 mới chỉ có thêm 11 trƣờng hợp bị nhiễm HIV nhƣng đến tháng 06/1999, toàn quốc đã có 13.623 trƣờng hợp nhiễm HIV, 2.532... xuất hiện trở lại của KN p24 và có thể thấy sự xuất hiện của KN gp41, KT kháng gp41, KT kháng gp120 và KT kháng p18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nguyên Quang Anh ̃ http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 Luân văn cao hocK12 ̣ ̣ Hình 1.6 Sự biến động của các thông số sinh học trên bệnh nhân nhiễm HIV 1.10 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN HIV TRONG CƠ THỂ Phát hiện HIV là một việc rất quan... sử dụng trong nghiên cứu, xác định chủng virus đƣợc phân lập, đánh giá tính kháng lại thuốc chống Retrovirus của HIV, chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh và ở những bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bất thƣờng Độ nhạy của xét nghiệm chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh khi mới sinh khoảng 43% và khi trẻ trên 3 tháng có thể đạt 90-95% [18] * Phát hiện virus bằng kính hiển vi điện tử kết hợp với phƣơng pháp... trị: Phát hiện đƣợc vị trí khƣ trú của HIV nhƣng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại đắt tiền 1.10.2 Phát hiện KN của HIV KN HIV, đặc biệt KN vỏ nhân p24 có trong huyết thanh, huyết tƣơng, dịch não tuỷ có thể đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp ELISA tóm bắt kháng nguyên (Capture ELISA) hoặc bằng kỹ thuật RIA Nguyên lý chung của các kỹ thuật này là dùng KT đa dòng (polyclonal antibody) kháng HIV. .. phƣơng pháp thay thế cho WB ELISA đƣợc ứng dụng để phát hiện các KT IgG anti -HIV, IgA anti -HIV hoặc IgM anti -HIV bằng 3 kỹ thuật sau: - Kỹ thuật ELISA gián tiếp KT kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với KN HIV đã đƣợc cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa) Phức hợp KN-KT đƣợc nhận biết bởi một cộng hợp là KT kháng Ig ngƣời có gắn enzyme và sẽ cho phản... Luân văn cao hocK12 ̣ ̣ + gp41 với HIV- 1 hoặc gp36 với HIV- 2: là gp xuyên màng gắn với gp120 hoặc gp125 với HIV- 2 giúp cho HIV xâm nhập đƣợc vào tế bào đích b Lớp vỏ trong (vỏ capsid) Vỏ này gồm 2 lớp [21]: + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein TLPT 17 kDa (p17 với HIV- 1) hoặc 18 kDa (p18 với HIV- 2) + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi protein TLPT 24 kDa (p24) bao bọc lấy lõi của virus, . VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP. NGUYỄN QUANG ANH NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC . phân typ HIV lƣu hành ở Vit nam là mục tiêu của đ tài Nghiên cu chế tạo b sinh phm phát hin HIV bằng dot blot vi các protein GP120, Gp41 và P24 tái t hợp Đ tài đƣợc đt ra vi các mục