nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β-thalassemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI …… ***…… LÊ THẾ KHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khóa 2009 - 2013 Hà Nội - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI …… ***…… LÊ THẾ KHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA Khóa 2009 - 2013 Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Huy Thịnh Hà Nội - 2013 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tại trung tâm gen protein trường đại học Y Hà Nội, em đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng tận tình của các thầy, các cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, với tất cả tấm lòng trân trọng, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Huy Thịnh, người thầy đã hết lòng dạy bảo, tận tình hướng dẫn em những bước đầu tiên trên con đường học tập và nghiên cứu khoa học. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Tạ Thành Văn, PGS. TS. Nguyễn Thị Hà, TS.Trần Vân Khánh, những người thầy người cô đã giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập, tạo mọi thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo Đại Học Trường Đại Học Y Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em thực hiện khóa luận này. Em xin cảm ơn Ths. Hồ Cẩm Tú cùng các anh chị cán bộ, anh chị Nghiên cứu sinh tại Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em khi thực hiện và hoàn thành khóa luận. Xin cảm ơn các bạn đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng, con thực sự biết ơn bố mẹ, mọi người thân yêu trong gia đình đã luôn tạo mọi điều kiện về tinh thần và vật chất để con vượt qua khó khăn trong học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Y khoa Trường Đại học Y Hà Nội. Hà Nội,20 ngày 6 tháng năm 2013 Lê Thế Khương Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc *** LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: Phòng Đào tạo Đại học – Trường Đại học Y Hà Nội Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, tất cả các số liệu trong khóa luận này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Hà nội, ngày 20 tháng 06 năm 2013 Người viết khóa luận Lê Thế Khương DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin) NST Nhiễm sắc thể Cd Codon Kb Kilo base bp Base pair dNTP deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate PCR Polymerase Chain Reaction EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid BN Bệnh nhân ĐB Đột biến BT Bình thường Hb Hemoglobin HC Hồng cầu MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Huyết sắc tố trung bình hồng cầu MCHC Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu Nu Nucleotid WHO Tổ chức y tế thế giới MỤC LỤC     ! "#$%& ! '($)!* +#$,-$ ./01$23 454&!6 67849!& !: ;.!<&: :=$>!?$@58 A52A$B8 A5C D/$E+!>?F3' C-$G8%& ! 'HIJKL?B@5+M5>45!-$G8%)*G=!)I&!E5; '7N@57O; ''!N!>PQ5>Q$REGS+>$T?$!5U: 'VWF 5!X!9D '67N@5J!$?Y!S!5$!>$R4Z"OUD ';J5G=!)I&!E&32X!!S G![$R4>\>$4F ?R4F  OH.UD ':7N@5H?RG]7OC HIJKL?B)55!^$@?2A@5+M5>45$_)4=2A)!3?>#&  !9!! C `L?B)!+!?FEa$JC '`L?B5!N!>PQ5b `L?BOH.7Ob 6`L?BH?RG]OH.7O'c '' defg77h7eij' 'J!0152A&G_ ' ''70/5G=G5!^$@?' ''kM5$Ml>5!E&#' '''?F>PKL?B' ''?F>PG=!)I&!Em'D ''6!+!k>^55>4'C '';!N!>PQc ' `noeij' `ET?N=$$!Ek' '`!* >$p015 q!2A$?_rT?F>P '?_r7O)/ q!6 ''`ET?N$?_rT?F>P ?RG]7OD `ET?N]=$)#)I&!E>^&8C 6s5KE)I&!E>^&86c 66 g"t6 6`ET?N=$$!Ek6 6'`ET?N$?_r q!2AT?F>P6' >45T?=>P$?_r q!2AT?F>P)uK!* >$p015 q!^Jl)($!?2X! v549!)I&!E=$NG_ K!* >)I&!E)01$K!* >w)($!?&x5 G0/5G=G5!N!>PQ5l)8FAR^?$?_2A5>45$?_)4=&8)I &!E !=$)!3?K!$yGN@5)01$J!0?r2X!v549!$(G q! 6' `!Q$!GN@5 ?RG]7O2X!$=$&8&!E>0X$)I&!EPNG_ )! +!KET?Nz )01$$rK{$0X$G|1G2X!K{$0X$$y)I&!ESPCUv)r$r *=G+M5>^&86' 6`ET?N7O>^&86' `n"t6C `en}6b TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG N5HIJK!*?)I&!E58Fcl~ !2A$=$&!E*&6 N5`ET?N)4q5)I2A)Iw9$$y$=$ •?k?K!=$$!Ev =? 549!2!$y&8' N5'`ET?N&86c DANH MỤC HÌNH PH€P$p?>•$G8% 454&!‚Cƒ; P'.!s51G54&!„$=$5!!)49G=>!*K=$?$yG€!2A! S5?qm !2U; PB?T?NN]?p+0v$?Y!… !‚cƒC P6/$E+!>?F3>^!, a$*0†5S\?‡!K!4>5ˆ !U P'#>{ IJ)I&!E58F& !>^5': P`ET?N=$k' P'PN)!+!ks5J P`ET?NK!* >$p015 q!7;l7;‰l76l76‰l7D6 P6`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!E+6ˆ6'SU; P;`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!E+DSU; P:`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!E'C  : PD`ET?N5!N!>PQ52X!)I&!Ee.e  : PC`ET?N)!+!NG_  ?RG]OH.7OD Pb`ET?NK!* >$p015k&x5 q!I!$?_b PcPNNG_ 7Ob P`ET?N]=$)#)I&!E)q51GF+#1G6c B]Šm`ET?N^>‹Š]=$)#$=$ •?&8)3?&#)I&!E+#1G%6c P6?=>PG!$!55?qm?>$4 6: ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là tên một loại bệnh thiếu máu do di truyền. Nguyên nhân do giảm hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi globin trong phân tử hemoglobin. Thalassemia là một thuật ngữ tiếng Hy Lạp ghép từ 2 từ thalass (biển) và haima (máu), do bệnh lần đầu tiên được phát hiện và phổ biến ở vùng Địa Trung Hải. Tùy theo sự thiếu hụt khả năng tổng hợp chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β) hoặc chuỗi delta (δ) mà tên gọi của bệnh là α-thalassemia, β- thalassemia hoặc δ-thalassemia [1]. β-thalassemia là một nhóm hội chứng thiếu máu đặc trưng bởi sự giảm hoặc mất khả năng tổng hợp chuỗi β globin, điều này gây nên sự thiếu hụt hemoglobin trong tế bào hồng cầu, giảm sản xuất hồng cầu và gây thiếu máu. β-thalassemia được phân thành 3 thể nặng, trung gian và nhẹ. Ngoài ra bệnh cũng liên quan tới sự bất thường của hemoglobin như HbE, HbC, HbS. Hàng năm tỷ lệ mắc của trẻ sơ sinh ước tính khoảng 1 trong 100.000 trẻ trên toàn thế giới và 1 trong 10.000 trẻ ở châu Âu [2]. Trong các nước khu vực Đông Nam Á có tỷ lệ mắc thay đổi từ 3 đến 10%. Ở việt nam theo nghiên cứu của Nguyễn Công Khanh năm 1993, β-thalassemia là nguyên nhân hàng đầu gây thiếu máu ở trẻ em. Tỷ lệ người mang gen gây bệnh phân bố rộng khắp cả nước và khác nhau theo vùng miền, dân tộc. Đặc biệt, tỷ lệ này khá cao ở các dân tộc ít người như Mông(25%), Catu (14%), Tày (11%), Pako (8,33%) [1]. Hiện nay, có khoảng hơn 200 đột biến trên đoạn gen tổng hợp chuỗi β globin đã được xác định. Theo một nghiên cứu trên quần thể người Việt Nam của M.L.Saovarros Svasti và Trần Minh Hiếu năm 2002 cho thấy các đột biến chính gây bệnh β-thalassemia là Cd17(AAG-TAG), Cd41/42(-TCTT), Cd71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), -28(A-G), IVS2-654(C>T) và Cd26(GAG>AAG) [3]. 1 [...]... giúp cho sự chẩn đoán đột biến gen đang được nghiên cứu và đạt được một số thành tựu nhất định Tuy nhiên sử dụng các kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến gen β-thalassemia mới chỉ đang nghiên cứu chứ chưa được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh Từ những vấn đề nêu trên chúng ta cần tiến hành đề tài Nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh βthalassemia” với... kỹ thuật Multiplex -PCR sàng lọc và xác định một số đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Bệnh β-thalassemia 1.1.1 Lịch sử bệnh thalassemia β-thalassemia được phát hiện từ khá sớm 1925 bởi Lee và Cooley Ca bệnh đầu tiên có ngồn gốc từ Hy Lạp và Italy, đã đặt tên là bệnh thiếu máu Cooley Tới năm 1936, Wippe và Bradford phát hiện ra có nhiều bệnh nhân thiếu máu tại vùng Địa... (thefullwiki.org/Thalassemia) 1.1.8 Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia Các trường hợp β-thalassemia có nguyên nhân do đột biến điểm trên gen HBB Các đột biến này gây ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp β globin, làm mất hoặc giảm khả năng tổng hợp Hiện nay có trên 200 loại đột biến gen HBB gây bệnh β-thalassemia được xác định trên thế giới [15], trong đó phổ biến nhất là 5 loại đột biến: codon41/42(-TTCT), codon17(A>T),... bị bệnh β-thalassemia trên lâm sàng và đang trong quá trình điều trị Bệnh phẩm là 3 ml máu tĩnh mạch được chống đông bằng EDTA Bệnh phẩm được lấy trước khi truyền máu 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu là sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS- PCR vào quá trình phát hiện 5 đột biến gen gây bệnh β-thalassemia là: Cd 71/72 T>A, -28 A>G, Cd 17 AAG>TAG, Cd 41/42 –TCTT, IVSI-I G>T Địa điểm nghiên. .. hợp β-globin β thalassemia có tần số và khả năng mắc bệnh là giống nhau ở cả 2 giới nam và nữ Dưới đây là ví dụ minh họa cho cơ chế di truyền trên NST thường với cả bố và mẹ mang gen dị hợp tử với một gen đột biến gây nên Nguy cơ trong một lần sinh như sau: 50% số con là người lành mang gen bệnh 25% số con là hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh 25% số con mắc bệnh β thalassemia thể nặng Hình 1.4... đương nhau Theo một nghiên cứu trên quần thể người Việt Nam của M.L.Saovarros Svasti và Trần Minh Hiếu năm 2002 cho thấy các đột biến chính gây bệnh βthalassemia là: Cd17(AAG-TAG), Cd41/42(-TCTT), Cd71/72(+A), IVS11(G>T), IVS1-5(G>C), -28(A>G), IVS2-654(C>T) và Cd26(GAG>AAG)[3] 21 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và bệnh phẩm Đối tượng nghiên cứu là 5 bệnh nhân tại bệnh viện Bạch... phát hiện một số đột biến thường gặp tại Việt Nam với các mồi ngược đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ 26 xung với đột biến Các đột biến là: Cd 71/72 T>A, -28 A>G, Cd 17 AAG>TAG, Cd 41/42 –TTCT, IVSI-I G>T Vị trí đột biến và trình tự các mồi: P1 5’ 555 P1.1 P1.2 28 (A>G) P1.3 P1 4 Exon 1 P1.5 Exon 2 Exon 3’ Exon 3 Exon Cd17 (AAG-TAG) IVSI-1 (G>T) Cd 41/42 (-TTCT) Cd 71/72 (T>A) Hình 2.1 Vị trí một số đột. .. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thanh Liêm khi khảo sát nhóm dân tộc Mường tại Kim Bôi Hòa 4 Bình thấy phát hiên đột biến tần số 10,67% Ngoài ra nghiên cứu phát hiện tỷ lệ người mang bệnh HbE khoảng 11,65% Theo Nguyễn Công Khanh, tần suất HbE xuất hiện khá cao ở nhiều dân tộc ít người ở miền Trung và Nam: Êđê 41%, Khơme 36,8%, Stieng 55,9% [6] Người mang bệnh HbE có biểu hiện lâm sàng giống với bệnh β-thalassemia. .. phối hợp β-thalassemia với α-thalassemia, hay HbE /β-thalassemia với α-thalassemia Trong một nghiên cứu ở Thái Lan có khoảng 13% trường hợp có sự tồn tại của cả hai loại đột biến gen α và β, trong đó đột biến xóa đoạn α 3.7 là phổ biến nhất Tùy thuộc vào loại đột biến và tỷ lệ giữa hai chuỗi globin được tổng hợp mà đưa đến các mức độ nặng nhẹ khác nhau Trong trường hợp này, thấy giảm nồng độ HbF và gia... chuỗi globin gây ra bệnh β0thalassemia ví dụ Codon17 (AAG>TAG) tạo thành bộ mã kết thúc Các đột biến ở đoạn đầu hay đoạn cuối đoạn gen làm rối loạn quá trình tổng hợp chuỗi β globin gây ra bệnh β+ thalassemia Các đột biến vùng intron làm chậm quá trình phiên mã mARN gây β + thalassemia Kiểu đột biến này được xếp vào nhóm β + thalassemia nhưng có triệu chứng giống với β0thalassemia 1.2 Một số kỹ thuật . Nghiên cứu và xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gen gây bệnh β- thalassemia” với mục tiêu: Áp dụng kỹ thuật Multiplex -PCR sàng lọc và xác định một số đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia. 2 CHƯƠNG. 2013 Hà Nội - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI …… ***…… LÊ THẾ KHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA KHÓA LUẬN TỐT. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI …… ***…… LÊ THẾ KHƯƠNG NGHIÊN CỨU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN GÂY BỆNH β-THALASSEMIA KHÓA LUẬN TỐT