Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR vào kiểm tra mồi với từng mẫu chứng. Dưới đây là các hình ảnh điện di kết quả sản phẩm PCR. Đây là giai đoạn cần thiết để kiểm tra chất lượng mồi có dặc hiệu với từng loại đột biến hay không. Dưới đây là hình ảnh minh họa sản phẩm kiểm tra chất lượng mồi.
Hình 3.3 Kết quả kiểm tra chất lượng mồi P1.5,P1.5’,P1.4,P1.4’,P7.
Trong đó
Mẫu (1) là mẫu DNA bệnh nhân β-thalassemia đột biến đồng hợp tử Cd71/72 (+A)
Mẫu (2), (4), (6) là mẫu DNA người bình thường.
Mẫu (3) là mẫu DNA bệnh nhân β-thalassemia đột biến đồng hợp tử Cd 41/42 (-TCTT)
Nhận xét: Sản phẩm PCR sử dụng mồi đột biến và bình thường lên tốt, đúng kích thước và không có vạch phụ đáp ứng yêu cầu để làm kỹ thuật multiplex ARMS-PCR. Xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 62°C.
1Kb Mk250 (1) (2) (3) (4) (5) (6) ĐB BT ĐB BT ĐB BT 750 500 250 bp Cd 71/72 Cd41/42 nội chuẩn (+A) (-TCTT)
Kết quả giải trình tự gen
Đột biến Cd41/42 (-TCTT)
Hình 3.4. Kết quả giải trình tự gen với đột biến Cd 41/42(-TCTT)
Nhận xét: Vị trí đột biến trên gen HBB gây ra thay đổi khung dịch mã, tạo bộ ba kết thúc TGA. Thay vì tạo ra 146 acid amin cơ thể chị tạo ra 59 acid amin, chuỗi polipeptid tạo ra không bền vững và bị phá hủy ngay trong tế bào.
Đột biến Cd 17 (AT)
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự gen với đột biến Cd 17(AT)
Nhận xét: Đột biến ở codon 17 (AT) chuyển bộ ba mã hóa acid amin Lysin (AAG) thành bộ ba kết thúc (TAG), gây ra sự kết thúc sớm tổng hợp chuỗi β-globin. Chuỗi hemoglobin không được tổng hợp.
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự gen với đột biến -28 AG
Nhận xét: đột biến tại vị trí -28 (AG) ảnh hưởng tới giai đoạn gắn riboxom trong quá trình phiên mã dẫn đến giảm khả năng tổng hợp chuỗi mRNA, từ đó giảm tổng hợp chuỗi β-globin.
Đột biến IVSI-1 G>T (g.70687 G>T)
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen với đột biến IVSI-1 GT
Nhận xét: đột biến tại vị trí IVSI-1 (GT) ảnh hưởng tới giai đoạn cắt, nối exon (splicing) làm giảm khả năng tổng hợp chuỗi mRNA, từ đó dẫn tới việc giảm tổng hợp chuỗi β-globin.