Phương pháp nghiên cứu là sử dụng kỹ thuật Multiplex ARMS- PCR vào quá trình phát hiện 5 đột biến gen gây bệnh β-thalassemia là: Cd 71/72 T>A, -28 A>G, Cd 17 AAG>TAG, Cd 41/42 –TCTT, IVSI-I G>T.
Địa điểm nghiên cứu tại Trung tâm gen Protein trường Đại học Y Hà Nội. Thời gian nghiên cứu từ tháng 11 năm 2012 tới tháng 5 năm 2013 Vật liệu nghiên cứu.
Quy trình nghiên cứu:
•Tách triết DNA.
•Chạy Multiplex ARMS- PCR.
•Chạy single ARMS-PCR.
•Kiểm tra giải trình tự gen.
2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị
2.2.1.1. Thiết bị
•Tủ lạnh : ARCTIKO -80 ºC và SANYO.
•Dụng cụ thủy tinh: Ống nghiệm pha hóa chất, cốc thủy tinh, ống đong, bình nón, cốc thủy tinh.
•Pipet định mức và đầu côn các loại 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl, 2.5µl
•Ống Eppendorf
•Găng tay, giấy thấm vô trùng
•Tủ sấy, tủ ấm
•Khay đổ gel
•Cân điện tử AB 204.
•Lò vi sóng (Saiko)
•Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức): Centrifuge 5424R và WeALTEC.
•Máy Votex Genie 2.
•Máy rung lắc nhiệt: Thermomixer 5437 và Thermomixer comfort cho ống 1,5ml và Mixmate cho ống 2ml.
•Máy điện di:
•Máy soi gel và chụp ảnh tự động: EC3 Imaging system
•Máy đọc huỳnh quang
•Máy đo OD: Nanodrop 1000
•Máy PCR: Eppendorf vapo.protect
2.2.1.2. Hóa chất tách DNA
Các dung dịch đệm phosphate (PBS) pH:7,4.
Dung dịch phá vỡ bạch cầu RBC.
Dung dịch Lysis buffer HD.
Proteinase K (10mg/mL)
Phenol Cholorofrom Isoamyl (25:24:1)
Cholorofrom Isoamyl (24:1)
Dung dịch hòa tan DNA: đệm TE (Tris - EDTA)
2.2.1.3. Hóa chất cho PCR:
Thành phần của PCR Master Mix gồm:
10 X Buffer
GOLTAQ chứa: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2
Primers: mồi xuôi, mồi ngược.
2.2.1.4. Hóa chất chạy điện di:
Dung dịch đệm TBE (Tris Borate EDTA) 1X gồm: Tris base, boric acid và EDTA (pH 8.0).
Agarose 1,5%.
DNA thang chuẩn (marker :250bp).
2.2.1.5. Hóa chất cho giải trình tự:
Ethanol 100%, ethanol 70%.
Hi - Di™ Formamide (bảo quản lạnh -20oC)
Big dye.
Buffer.
2.2.2 Quy trình kỹ thuật
2.2.2.1. Thu mẫu
Bệnh nhân được tiến hành lấy 3ml máu tĩnh mạch (lúc đói vào buổi sáng là tốt nhất) chống đông bằng EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần). Bệnh nhân lấy máu trước khi truyền máu.
Yêu cầu:
•Quy trình phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối.
•Máu phải đảm bảo không được đông dây, không vỡ hồng cầu.
•Bảo quản ở 4 ºC - 8 ºC trong tối đa 4h (nếu lâu hơn phải tách huyết thanh).
2.2.2.2.Tách chiết DNA
DNA được tách chiết từ máu ngoại vi theo phương pháp Phenol/ Chloroform Các bước gồm: Loại bỏ hồng cầu và phá vỡ màng tế bào → Phá vỡ màng nhân → Loại protein →Tủa DNA → Rửa tủa → Hòa tan DNA.
Quy trình cụ thể:
Bước 1 : Loại bỏ hồng cầu và phá vỡ màng tế bào
•Cho vào ống eppendorf 1.5 ml: 0.5ml dung dịch phá vỡ hồng cầu (Lysis buffer) + 0.5ml máu toàn phần chống đông EDTA
•Votex mạnh.
•Ly tâm 4000v/phút x 5 phút/4ºC
•Loại dịch nổi, thu cặn.
Lặp lại quy trình này 2 lần cho tới khi tủa (nhân và xác tế bào) thấy cặn trắng ở đáy ống.
Bước 2: Phá vỡ màng nhân
•Ống eppendorf 1.5ml chứa cặn + 0.5ml dung dịch PBS (dung dịch hỗ trợ phá màng tế bào bạch cầu và cố định nhân)
•Votex mạnh.
•Ly tâm 4000v/phút x 5 phút/4ºC
•Loại dịch nổi, thu cặn
•Cặn + 0.6ml dung dịch Lysis buffer 5 µl proteinase K.
•Sau đó đem ủ ở 56ºC/2h-3h kèm theo lắc nhẹ để phân hủy protein thu được dung dịch đồng nhất.
Bước 3: Tủa DNA
•Thêm dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl
là dung dịch tủa protein.
•Trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
•Hỗn hợp phân thành 3 lớp: lớp trên cùng có chứa DNA, lớp giữa
•là cặn tế bào và protein , lớp dưới cùng là dịch chiết.
•Thu lớp dịch trên cùng.
•Thêm dung dịch Chloroform: Isoamyl
•Dung dịch + 0.5ml Chloroform: Isoamyl (24:1).
•Trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC
•Hỗn hợp phân thành 2 lớp: thu lớp dịch trên cùng.
•Lặp lại bước này một lần nữa thu dung dịch
•Tủa DNA:
•Trộn 1V dung dịch + 2.5V Ethanol 100%
•Lắc đều, ủ -20°C/2 giờ để kết tủa DNA.
•Ly tâm 15000v/phút x 10 phút/4ºC thu tủa
•Tủa rửa bằng 1mL Ethanol 70% , trộn đều và ly tâm 15000v/phút x 20 phút/4ºC thu được tủa DNA.
•Tủa DNA để khô tự nhiên (56 ºC), sau đó hòa tan bằng đệm TE hoặc nước cất 2 lần.
•DNA tách chiết được sẽ được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng đo mật độ quang trên máy Nano Drop ở bước sóng 260nm và 280nm.
•Pha DNA thành nồng độ 100 ng/ µl
Sản phẩm đạt yêu cầu khi tỷ số đo OD A260/A280 = 1,8÷2,0.
Chú ý: Sản phẩm DNA tách chiết được bảo quản ở 4°C trong thời gian ngắn hoặc lưu giữ ở -20°C trong thời gian dài.
2.2.2.3. Thiết kế mồi:
Mồi được thiết kế theo ARMS-PCR nhằm phát hiện một số đột biến thường gặp tại Việt Nam với các mồi ngược đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ
xung với đột biến. Các đột biến là: Cd 71/72 T>A, -28 A>G, Cd 17 AAG>TAG, Cd 41/42 –TTCT, IVSI-I G>T.
Vị trí đột biến và trình tự các mồi:
Hình 2.1 Vị trí một số đột biến gây bệnh β-thalassemia trên gen HBB
Trong đó P1 là vị trí bắt cặp mồi xuôi chung.
P1.1, P1.2, P1.3, P1.4, P1.5 là vị trí bắt cặp các mồi ngược.
Bảng 2.1 trình tự mồi trong phương pháp multiplex PCR
Mồi Đột biến Trình tự mồi Sản phẩm
(bp) P1 Mồi chung 5’ TGAAGTCCAACTCCTAAGCCAGTG 3’
P1.1 -28(A>G) Đột biến 5’ TAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGAGTC 3’ 172
P1.1’ Bình thường 5’ TAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGAGTT 3’
P1.2 Cd 17 Đột biến 5’ CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTA 3’ 303
P1.2’ Bình thường 5’ CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTT 3
P1.3 IVSI-1 Đột biến 5’GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT 3’ 346
P1.3’ Bình thường
P1.4 Cd41/42 Đột biến 5’TTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACGAAA 3’ 506
P1.4’ Bình thường 5’TTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACGAAT 3’
P1.5 Cd 71/72 Đột biến 5’GGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCAGTT 3’ 596
P1.5’ Bình thường 5’GGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCAGTA 3’ Mồi nội chuẩn và phát hiện đột biến HbE
P7 Mồi xuôi Mồi ngược
5’ CAACTTGCTCAAGCATACACTC 3’ 494
P7.1 5’ AATAATAGGCATAGTGACAAGTGC 3’
P8 Mồi xuôi Đột biến 5’ ACCTCACCCTGTGGAGCCAC 3’ 266
P8’ Bình thường 5’ ACCTCACCCTGTGGAGCCAT 3’ Cd 41/42 (-TTCT)
Exon 1 Exon Exon 3 28 (A>G) Cd17 (AAG-TAG) IVSI-1 (G>T) Cd 71/72 (T>A) P1 P1.1 P1.2 P1.3. P1. 4 P1.5 555 5’ 3’ Exon 2 Exon 3
P8.1 Mồi ngược 5’TAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCGTT 3’
Trong đó:
Nhóm các mồi đột biến P1.1, P1.2, P1.3, P1.4, P1.5 và nhóm các mồi bình thường P1.1’, P1.2’, P1.3’, P1.4’, P1.5’ có chung mồi xuôi P1.
Cặp mồi nội chuẩn P7, P7.1 được sử dụng để kiểm tra chất lượng DNA và có vị trí gắn mồi tại vùng promoter của gen.
Cặp mồi P8, P8.1 sử dụng để xác định đột biến HbE và được kiểm tra cho bệnh nhân có kết quả điện di huyết sắc tố có HbE.
Mồi P8 và P8’ có chung cặp mồi ngược P8.1.
Chú ý khi thiết kế mồi ARMS :
Chọn đúng vị trí khi thiết kế mồi ngược
Kích thước mồi từ 16-30bp. Độ dài này là đủ dài để đặc trưng đầy đủ cho đoạn bắt cặp và đủ ngắn để cho mồi gắn một cách dễ dàng vào đoạn gen.
Tránh lặp lại trình tự các nucleotid hoặc những đoạn nucleotid giống nhaukhieens các cặp mồi bắt cặp nhầm với DNA khuôn.
Trình tự các nucleotid tại đầu 3’ không được bổ xung cho nhau hoặc các mồi khác để hình thành phức hợp mồi.
Lượng nucleotid G +C trong mỗi cặp mồi là 40-60%. Liên kết G-C bền vững hơn so với liên kết A-T.
Tránh có ≥3 G hoặc C ở đầu 3’. Điều này dẫn đến bắt cặp nhầm ở những vùng DNA khuôn giàu GC .
2.2.3. Quy trình phát hiện đột biến: Bước 1 Phát hiện đột biến
Phát hiện đột biến β-thalassemia bằng kỹ thuật multiplex PCR dùng trong thể tích 30μl bao gồm gotaq green 2X (thành phần có d NTP, MgCl2, PCR buffer và DNA polymerase), nhóm mồi đã thiết kế tại Bảng 2.1 với mồi xuôi chung và DNA 200ng/μl. Phản ứng có chu trình nhiệt như sau:
940C : 5 phút 940C : 45 giây 620C : 45 giây x 30 chu kỳ 720C : 1 phút 720C : 5 phút 150C
Sản phẩm PCR được kiểm tra kích thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose, sau đó so sánh với Bảng 2.1 để xác định đột biến cần tìm.
Bước2 Xác định đồng hợp hay dị hợp tử
Mix PCR : sử dụng mồi ngược là mồi bình thường, các nucleotid bắt cặp theo cơ chế bổ xung
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất 2 lần 3 2 Go Taq 5 3 DNA 1 4 Mồi xuôi 0,5 5 Mồi ngược 0,5 Tổng thể tích 10
Chu trình nhiệt của phản ứng giống với chu trình nhiệt của phản ứng multiplex-PCR