Sản phẩm PCR được kiểm tra độ nguyên vẹn, độ tinh sạch và độ đặc hiệu bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 1% nhuộm Ethidium bromide và soi bằng tia tử ngoại. DNA có độ nguyên vẹn cao khi các băng DNA trên bản gel tập trung, rõ nét. Độ tinh sạch được đánh giá bởi số băng trên đường điện di. DNA có độ tinh sạch cao thì trên hình ảnh điện di chỉ có một băng duy nhất. So sánh vị trí băng DNA trên mẫu bệnh nhân với Marker để đánh giá độ đặc hiệu.
Trong quá trình nghiên cứu chưa phát hiện được đột biến Cd 71/72 và Cd 17 do cỡ mẫu nhỏ. Các đột biến này tạo bộ ba mã kết thúc làm ảnh hưởng tới
kích thước của chuỗi globin tạo ra. Các chuỗi globin này không bền vững và bị phá hủy ngay trong tế bào.
Trong quá trình thực hiện phẩn ứng multiplex PCR các điều kiện của phản ứng đã được tối ưu hóa để xác định đột biến β-thalassemia. Các kích thước sản phẩm PCR là rõ ràng và đặc hiệu với từng loại đột biến.
Với kết quả xác định được 4 bệnh nhân đột biến với nhóm 5 cặp mồi đột biến cho thấy tỷ lệ mắc nhóm các đột biến này là khá cao và có thể sử dụng trong quá trình sàng lọc phát hiện đột biến β-thalassemia. Kỹ thuật này đáp ứng được các điều kiện xác định nhóm các đột biến có hiệu quả kinh tế và có độ chính xác cao. Với bệnh nhân còn lại có thể xác định đột biến bằng phương pháp ARMS-PCR hoặc giải trình tự gen để xác định đột biến.
Trong đó β-thalassemia được chia làm nhóm các đột biến sau:
Đột biến điểm tại cùng promoter do thay thế nucleotide tại vị trí hộp TATA hoặc CCAAT dẫn đến làm giảm tổng hợp chuỗi β-globin, chỉ còn 10% so với bình thường. Ở Việt nam và các nước Đông Nam Á, đột biến điểm tại vị trí -28 A G chiếm một tỷ lệ đáng kể.
Trước khi ARN polymerase II bắt đầu phiên mã một gene, các yếu tố phiên mã ( transcription factor. TF) có bản chất protein như TFIID gắn vào trình từ TATA. Tiếp theo là sự gắn các yếu tố phiên mã TFIIB và tuần tự sau
nữa là TFIIE, TFIIH và TFIIF gắn trực tiếp vào ARN polymerase II. Khi những phản ứng gắn gốc phosphate vào ARN polymerase II được xúc tác bởi TFIIH thì ARN polymerase II trở nên hoạt động và bắt đầu phiên mã. Hoạt động của vùng khởi đầu chịu ảnh hưởng bới sự tương tác của yếu tố kích thích phiên mã với trình tự ADN (enhancer), khi yếu tố kích thích phiên mã gắn với trình tự ADN (enhancer) ở vùng khởi đầu sẽ làm tăng hiệu quả phiên mã của gene. Một gene riêng biệt có thể được kiểm soát hoạt động phiên mã bằng sự tương tác của những protein đặc hiệu với vị trí gắn tương ứng ở vùng khởi đầu.
Các đột biến vô nghĩa do thay thế một nucleotide ở trình tự của exon dấn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc UAA, UAG, UGA. Ở Việt Nam, thường gặp nhất đột biến codon 17 của exon 1: lysine chuyển thành thymine. Như vậy, codon 17 là 5’AAG 3’(bình thường mã hóa acid amin lysine) bị chuyển thành TAG, được phiên mã thành UAG ở mRNA là bộ ba kết thúc. Việc dịch mã kết thúc sớm hơn bình thường là tạo ra sản phẩm β-globin không bền, bị phá hủy ngay trong tế bào.
Đột biến khung dịch mã xảy ra ở các exon do thêm vào hoặc mất đi một vài nucleotide hoặc một đoạn nucleotide, dẫn đến sự thay thế khung đọc mã di truyền làm thay đổi sản phẩm β-globin. Ở nước ta đột biến mất 4 nucleotide (-TCTT) tại vị trí codon 41/42 chiếm tỉ lệ cao nhất ( 35-45%) trong tất cả các đột biến gây bệnh β-thalassemia. Bất thường thêm nucleotide ở codon 95 hoặc tại codon 71/72 cũng được phát hiện.
Đột biến tại những đoạn tín hiệu cắt nối khá phổ biến.Quá trình cắt các intron và nối các exon để hoàn thiện phân tử mRNA đòi hỏi các trình tự đặc hiệu ở hai đầu của các intron: Vị trí cho nối GT ( donor site) ở đầu 5’ và vị trí nhận nối AG( acceptor site) ở đầu 3’. Trong đột biến ở hai vị trí này sẽ gây
cản trở nối các exon và không tạo mRNA, kết quả là không tạo được chuỗi β và thể bệnh β0-thalassemia. Ở miền Nam nước ta, đột biến tại nucleotide thứ nhất của intron 1: G-> T chiếm khoảng 4-6%. Các đột biến tại vị trí 5,6 của intron dẫn đến giảm khả năng nối RNA chính xác nhưng còn tong hợp được β-globin và gây thể bệnh β+-thalassemia.
Hình 4.1 Quá trình splicing. Nguồn: Nature.com
Quá trình loại bỏ các intron và nối các exon ( quá trình splicing ) đã được phiên mã trong ARN tiền than lại với nhau nhờ xúc tác của các thể nối
(spliceosome) hay còn được gọi là quá trình tạo ARN thuần thục. Thể nối được tạo thành từ một nhóm U1, U2, U4, U5, U6 snRNP và những thành phần khác. Thể nối cắt vị trí nối 5’ rồi nối với nucleotide A gần vị trí nối 3’ để hình thành một cái thòng lọng, rồi phức hợp các “ thòng lọng intron” cùng thể nối bị giáng cấp trong nhân.
Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: bất thường tại vị trí gắn đuôi sẽ làm giảm tổng hợp chuối β và gâyβ+- thalassemia. Ở Việt Nam, đột biến trình tự gắn đuôi AATAAA thành AACAAA được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gene.
Nghiên cứu này của nhóm nghiên cứu tại trung tâm gen – protein trường đại học Y Hà Nội, đã xây dựng được quy trình phát hiện một số đột biến gây bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật multiplex PCR, nghiên cứu của tôi nhằm phát hiện 5 dạng đột biến với các cặp mồi đặc hiệu. Do điều kiện có hạn tôi chỉ có thể nghiên cứu được trên 5 bệnh nhân. Phương pháp sinh học phân tử phát hiện các dạng và thể đột biến rất nhanh và chính xác. Nghiên cứu của chúng tôi với cỡ mẫu quá nhỏ nên không có ý nghĩa thống kê và nghiên cứu này đang tiếp tục để xác định được tỉ lệ các dạng đột biến β-thalassemia thường gặp ở Việt Nam.
KẾT LUẬN
Đề tài tốt nghiệp “nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện một số đột biến gây bệnh β-thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex PCR” đã đáp ứng được mục tiêu đã đề ra:
Xây dựng và áp dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR sàng lọc và xác định một số đột biến phổ biến gây bệnh β-thalassemia.
KIẾN NGHỊ
Do đột biến β-thalassemia mang tính đặc trưng theo từng vùng , từng nhóm dân tộc nên khi áp dụng vào trong cộng đồng chúng ta có thể thay đổi thêm hoặc bớt một số nhóm mồi đột biến. Ví dụ tại miền nam, các đột biến IVSI-1(G>T) và -28(A>G) không xuất hiện do đó với các bệnh nhân từ miền nam ta có thể thay đổi thành các phần phản ứng PCR.
Với tần suất cao và biểu hiện nặng nề của thể nặng, β-thalassemia là bệnh cần được phát hiện sớm và cần có biện pháp sàng lọc trước sinh nhằm nâng cao chất lượng dân số, giảm bớt gánh nặng bệnh tật về xã hội và kinh tế. Kỹ thuật multiplex ARMS-PCR giúp tiết kiệm rất nhiều về thời gian và nguyên liệu. Đây là tiền đề để ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử vào vấ đề sàng lọc, tầm soát bệnh β-thalassemia trong cộng đồng.
Cần kiểm tra sàng lọc trước sinh với các gia đình có phả hệ có biểu hiện thiếu máu.
1. Bùi Văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh 1999. Nhận xét bước đầu cơ sở di truyền phân tử và mối quan hệ kiểu gen với mức độ thiếu máu và thể tích hồng cầu trong bệnh HbE/β-thalassemia. Tạp chí nhi khoa 8.
2. Vichinsky EP: Thay đổi mô hình của bệnh thiếu máu trên toàn thế giới. Ann NY Acad Khoa học năm 2005, 1054: 18-24
3. Svasti S. Hieu TM. Munkongdee T. Winichagoon P. Van be T. Van Binh T. Fucharone S. Molecular analysis of beta thalassemia in South Viet Nam .2002
4. Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Thu Hà (2010) Cập nhật chuẩn đoán và điều trị thalassemia. Nhà xuất bản y học:203-212
5. Nguyễn Công Khanh(2008) “Bệnh hemoglobin”, “Huyết học lâm sàng y khoa”, nhà xuất bản y học: 127-146
6. Nguyễn Công Khanh 1993 Tần xuất bệnh hemoglobin ở việt nam. Y học việt nam tập 174 số 8 11-16.
7. Trịnh Văn Bảo và cộng sự, “Di truyền y học”, Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.
8. Tạ Thành Văn, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Lê Minh Khôi, Nguyễn Thị Băng Sương (2011), “Bệnh học phân tử”, Nhà xuất bản Y học, tr. 67-80.
9. Hà Thị Anh, Bùi Thị Mai An, Trần Văn Bình, Nguyễn Hà Thanh (2009), “Huyết học – truyền máu”, Nhà xuất bản Y học 2009.
10. Thalassemia International Federation: [http://www.thalassemia.org.cy] webcite .Guidelines for the clinical management of thalassemia . 2nd edition.2008.
MG: Ung thư biểu mô tế bào gan trong các hội chứng bệnh thiếu máu. Br J Haematol năm 2004, 124:. 114-117
12. Borgna-Pignatti C, Cappellini MD, De Stefano P, Del Vecchio GC, Forni GL, Gamberini MR, Ghilardi R, Origa R, Piga A, Romeo MA, Triệu H, Cnaan A: Tỷ lệ sống và biến chứng trong bệnh thiếu máu. . Ann NY Acad Khoa học năm 2005, 1054: 40-47
13. Galanello R, Piras S, Barella S, Leoni GB, Cipollina MD, Perseu L, Cao A: Sỏi mật và hội chứng Gilbert trong đồng hợp tử beta- thalassemia.Br J Haematol năm 2001, 115: 926-928
14. Taher AT, Otrock ZK, Uthman tôi, Cappellini MD: Thalassemia và tăng đông máu.Máu Rev 2008, 22: 283-292.
15. Mr. Huisman phát THJ, Carver MFH, Baysal E: Một Đề cương của đột biến Thalassemia. Các hồng cầu hình liềm Thiếu máu Foundation, Augusta, GA 1997.
16. Tạ Thành Văn, (2010), “PCR và một số kỹ thuật Y sinh học phân tử”, Nhà xuất bản Y học.
17. Chamberlain, J.S., R.A. Gibbs, J.E. Ranier, P.N. Nguyen and C.T. Caskey. 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16:11141- 11156.
18. Anonymous. 1992. Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction. A multicenter study. JAMA 267:2609-2615.
chromosome in idiopathic sterile men, diagnostic for deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis. Andrologia 26:97-106.
20. Shuber, A.P., J. Skoletsky, R. Stern and B.L. Handelin. 1993. Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis. Hum. Mol. Genet. 2:153-158.
21. Mutirangura, A., F. Greenberg, M.G. Butler, S. Malcolm, R.D. Nicholls, A. Chakravarti and D.H. Ledbetter. 1993. Multiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical region (15q11-q13): molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy. Hum. Mol.Genet. 2:143-151.
22. Mansfield, E.S., J.M. Robertson, R.V. Lebo, M.Y. Lucero, P.E. Mayrand, E. Rappaport, T. Parrella, M. Sartore, S. Surrey and P. Fortina. 1993. Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategies. Am. J. Med. Genet. 48:200-208.
23. Crisan, D.1994. Molecular diagnostic testing for determination of myeloid lineage in acute leukemias. Ann. Clin. Lab. Sci. 24:355-363.
24. O.Henegarui, N.A. Heerema, S.R. Dlouhy, G.H. Vance và P.H. Vogt.Tạp chí BioTechniques 23: 504-511 (tháng 9/1997)