2.2.5.1.Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự - Thành phần của 1 phản ứng: STT Thành phần Thể tích (µl) 1. DNA đã PCR 0,5 2. Buffer 1.5 3. Big Dye 1 4. Primer 0.5 5. Nước cất 2 lần 6.5 Tổng thể tích 10
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 960C : 1 phút 960C : 10 giây 500C : 5 giây x 25 chu kỳ 600C : 4 phút 150C Bảo quản ở 40C Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự:
Sản phẩm PCR giải trình tự được tinh sạch bằng phương pháp tủa Ethanol: - Thêm vào ống hỗn hợp phản ứng:
+ 60 µl Ethanol lạnh 100%. + 5μl EDTA.
- Lắc nhẹ đểtrong buồng tối 15 phút. - Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút /4°C. - Hút bỏ dung dịch giữ lại tủa DNA ở đáy ống.
- Thêm 200 µl Ethanol 70%. Trộn đều rồi để nhiệt độ phòng. - Ly tâm 15000 vòng/phút x 10 phút /4°C.
- Bỏ dịch nổi. Để khô hoàn toàn.
- Thêm 20 µl Hi-Di. Trộn đều (votex nhẹ) - Để ở 95oC trong 2 phút.
- Làm lạnh trong 5 phút, votex rồi chuyển sang giải trình tự bằng máy ABI 3100.
2.2.5.2. Giải trình tự trực tiếp
Các đột biến trên toàn bộ gen HBB được phát hiện bằng giải trình tự trực tiếp trên máy ABI-3100 (Applied Biosystem) tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein Trường Đại học Y Hà Nội, và được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. Các kết quả trình tự gen HBB của mẫu đối chứng và mẫu bệnh nhân sẽ được so sánh với trình tự chuẩn của gen HBB trên Gene Bank (GenBank Accession number NG_0000073 đối với DNA).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU