NGHIÊN cứu CHẾ tạo PANEL CHUẨN để ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SINH PHẨM CHẨN đoán VIÊM GAN c

BỘ Y TÕ Comment [NT1]: Comment [NT2R1]: Comment [T3]: B¸o cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Tờn ti : Nghiên cứu chế tạo panel chuẩn để đánh giá chất lợng sinh phẩm chẩn đoán viêm gan C ================== Chủ nhiệm đề tài : TS Nguyễn Thị Kim Hơng Cơ quan chủ trì đề tài : Trung tâm Kiểm định Quốc gia Sinh phẩm Y học Cấp quản lý đề tài: Thời gian thực : Bộ Y tế từ tháng 8/2003 đến tháng 8/2005 Tổng kinh phí thực đề tài : 250 triệu đồng Trong ®ã kinh phÝ SNKH : 250 triÖu ®ång 6244 22/12/2006 Năm 2005 CC CH VIT TT ADN Axớt desoxyribonucleic ARN Axít ribonucleic aa Acid amin Anti-HCV Antibody against Hepatitis C virus: Kháng thể kháng vi rút viêm gan C ELISA Enzyme-linked Immunsorbent assay: Thử nghiệm miễn dịch gắn men E1 Envelope glycoprotein: Glycoprotein vá E2 Envelope glycoprotein: Glycoprotein vá HCV Hepatitis C virus: Vi rút viêm gan C IgM Immuno globulin M NS1 Non-structure protein 1: Protein không cấu trúc NS2 Non-structure protein 2: Protein không cấu trúc NS3 Non-structure protein 3: Protein không cấu trúc NS4 Non-structure protein 4: Protein không cấu trúc NS5 Non-structure protein 5: Protein không cấu trúc PCR Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi Polymerase RIBA Recombinant immunoblot assay: Th nghim dch thm tái tổ hợp UTR 5’ Untranslated Region: Vùng không phiên mã 5’ 3’ UTR 3’ Untranslated Region: Vùng không phiên mã 3’ S/CO Signal per cut- off: Tỷ số giá trị OD mẫu giá trị ngưỡng OD Optical density: Mật độ quang TCYTTG Tổ chức y tế giới MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 NHỮNG HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT VIÊM GAN C (HCV) 1.1.1 Lịch sử phát HCV 1.1.2 Đặc điểm vi rút học cấu trúc gen vi rút viêm gan C 1.1.3 Các genotype HCV 1.1.4 Tình hình nhiễm HCV 1.2 CHẨN ĐOÁN NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN C 1.2.1 Thử nghiệm phát anti-HCV 1.2.2 Thử nghiệm phát ARN vi rút 1.2.3 Thử nghiệm phát kháng nguyên lõi vi rút 10 1.3 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ PANEL CHUẨN 1.3.1 Định nghĩa 10 1.3.2 Các loại panel 10 1.3.3 H−íng dÉn chung cđa TCYTTG vỊ viÖc thiÕt lËp panel anti-HCV 12 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 2.1.1 Địa điểm 14 2.1.2 14 Thời gian 2.2 VẬT LIỆU 2.2.1 Mẫu huyết người 14 2.2.2 Bộ sinh phẩm chẩn đoán 14 2.2.3 Panel chuẩn Quèc tÕ 14 2.2.4 Nguyên vật liệu trang thiết bị cần dùng cho kỹ thuật 14 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Thu thập mẫu máu 15 2.3.2 Thử nghiệm sàng lọc HBsAg kỹ thuật ELISA 15 2.3.3 Thử nghiệm sàng lọc anti-HIV kỹ thuật ELISA 16 2.3.4 Thử nghiệm sàng lọc anti-HCV kỹ thuật ELISA 17 2.3.5 Xác định ARN HCV kỹ thuật PCR 18 2.3.6 Xác định genotype phân týp HCV cách xác định trình tự vùng NS5b Core-E1 2.3.7 19 Hiệu chỉnh hàm lượng anti-HCV cđa c¸c mẫu huyết để chế tạo panel 2.3.8 19 Thẩm định panel ………………………………………………… 19 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ TẠO PANEL………………………… 20 3.2 KẾT QUẢ CHẾ TẠO PANEL HCV CHUẨN 3.2.1 Kết lựa chọn mẫu huyết panel 22 3.2.2 Kết qu hiu chnh hàm lợng anti-HCV 28 3.2.3 Thiết lập panel chuẩn………………………………………………… 32 3.2.4 Thẩm định panel chuẩn PCE/02.2005………………………………… 35 3.2.5 Hoµn thiƯn chÊt lợng panel thành phẩm 37 Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 QUI TRÌNH CHẾ TẠO PANEL 41 4.2 CHẾ TẠo PANEL CHUẨN anti-HCV………… …………………… 4.2.1.Lựa chọn mẫu huyết 42 4.2.2 Phân bố genotype HCV việc lựa chọn genotype phân týp để chế tạo panel 44 4.2.3 Hiệu chỉnh hàm lượng anti-HCV panel chuẩn………………… 45 4.2.4 Panel thành phẩm 46 4.2.5 Chất lượng panel chuẩn 48 4.3 HIỆU QUẢ THỰC TIỄN 48 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi rút viêm gan C thuộc họ Flaviviridiae, nguyên nhân quan trọng gây nên bệnh viêm gan vi rút Đường lây truyền vi rút viêm gan C chủ yếu qua truyền máu, quan hệ tình dục lây truyền từ mẹ sang Cũng vi rút viêm gan B, người bị nhiễm vi rút viêm gan C tùy theo mức độ bị viêm gan cấp tính mạn tính dẫn dến thương tổn gan xơ gan, ung thư gan tiên phát Hiện nay, phương pháp chẩn đốn phịng thí nghiệm trường hợp nhiễm vi rút viêm gan C chủ yếu dựa vào việc phát kháng thể đặc hiệu (anti- HCV) lưu hành máu Từ năm 1990, nhờ việc sàng lọc anti- HCV người hiến máu số nước phát triển, làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan C Theo thông báo Tổ chức Y tế giới hàng năm có khoảng 3-4 triệu người nhiễm mới, đưa số bị nhiễm vi rút viêm gan C lên khoảng 170 triệu người, chiếm tỷ lệ 3% dân số giới Việt Nam nước có tỷ lệ nhiễm vi rút viêm gan C cao Hiện nay, giới có nhiều loại sinh phẩm chẩn đốn anti-HCV, chđ u lµ kÝt ELISA vµ kít chẩn đoán nhanh hÃng nh Abbott, Organon, Biorad, Span, Standard, Ortho, J, Mitra &Co Ltd TÊt kớt trớc xuất xởng phải đợc phòng kiểm định nc s ti đánh giá chất lợng cách sử dụng panel chuẩn sở D nhiờn quỏ trình vận chuyển bảo quản ảnh hởng đến chất lợng sinh phẩm, vỡ th bảo đảm chất lợng cho sinh phẩm nhập khẩu, quan kiểm định nớc nhập cần phải tiến hành đánh giá li chất lợng tr−íc cho phép phân phối sư dơng -1- Ở Việt nam, Bộ Y tế giao trách nhiệm cho Trung tâm Kiểm định Quốc gia Sinh phẩm Y học Tuy nhiên, việc mua panel chuẩn quốc tế gặp nhiều khó khăn, sản phẩm có giá thành cao, phải mua ngoại tệ, hãng lại không bán với số lượng ít, nên khơng thể chủ động cơng tác kiểm định Đó lý mà lâu việc đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán Trung tâm Kiểm định Quốc gia Sinh phẩm Y học dừng mức so sánh độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm hãng với Vì độ xác kết bị hạn chế Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo panel chuẩn ®Ĩ đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán viêm gan C” nhằm mục tiêu sau: Xây dựng quy trình chế tạo panel chuẩn anti-HCV Chế tạo panel chuẩn để đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán viêm gan C b»ng kü thuËt ELISA -2- Chương TỔNG QUAN 1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT VIÊM GAN C (HCV) 1.1.1 Lịch sử phát HCV Viêm gan vi rút bệnh nhiễm trùng nguy hiểm, phổ biến giới bị nhiễm phối hợp vài loại vi rút viêm gan ví dụ như: vi rút viêm gan A, B, C, D E, gây nên tổn thương chủ yếu gan, dẫn đến xơ gan ung thư gan tiên phát Năm 1975, lần người ta nhận thấy, 80-90 % c¸c trường hợp có viêm gan liên quan đến truyn mỏu sản phẩm máu, nhng nguyờn nhân khơng phải vi rút viêm gan A hay viêm gan B Vì bệnh gọi viêm gan không A, không B tác nhân gây cho vi rút viêm gan khơng A, khơng B Năm 1989, nhóm nhà khoa học Chiron (California, Mỹ) hợp tác với nhóm nhà khoa học CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh hoa Kỳ) sử dụng kỹ thuật PCR phát xác định chuỗi ARN vi rút gây bệnh viêm gan không A, không B họ đặt tên cho vi rút viêm gan C (HCV) 1.1.2 Đặc điểm vi rút học cấu trúc gen vi rút viêm gan C HCV thuộc giống Hepacivirus họ Flaviviridae, có hình cầu, đường kính 50 -60 nm, vi rút có cấu trúc ARN sợi dương Bộ gen vi rút viêm gan C chứa khoảng 9033 nucleotit với khung đọc mở (ORF) lớn, mã hóa cho chuỗi polyprotein tiền thân khoảng 3011 axit amin (aa) Polyprotein gắn enzyme signalase tế bào vật chủ enzyme proteases vi rút tạo thành 10 protein vi rút theo trình tự định NH2-Core E1-E2p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5aNS5b-COOH Vùng khơng mã hóa nằm đầu 5’ đầu 3’ sợi ARN Vùng khơng mã hóa đầu 5’ đóng vai trị then chốt q trình phiên mã, cịn vùng khơng mã hóa đầu 3’ có khoảng 200-235 nucleotit vùng đặc -3- Comment [C4]: Comment [C5]: hiệu týp có tính ổn định cao Do cấu trúc HCV ARN nên gen dễ bị biến đổi Hình 1.1 : Cấu trúc gen HCV Tùy theo vai trò protein mã hóa mà gen HCV tạo vùng cấu trúc vùng khơng cấu trúc (H×nh 1.1) Vùng cấu trúc bao gồm: vùng lõi, E1 E2, m· hoá cho protein lõi, protein vỏ E E tơng ứng Vùng không cấu trúc gen HCV mà hoá cho protein không cấu trúc NS2, NS3, NS4 NS5 Các protein không cấu trúc có chức khác trình tái t¹o h¹t virut Phân tích trật tự gen ARN HCV, người ta phát chuỗi nucleotit E1 E2 không ổn định, dễ thay đổi Nguyên nhân vi rút thoát khỏi kiểm soát đáp ứng miễn dịch vật chủ nhờ có khác protein vỏ Hai vùng biến đổi cao chuỗi aa ngắn protein E2 gọi vùng siêu biến (HVR1) vùng siêu biến (HVR2) Một vài nghiên cứu gợi ý HVR1 có khả trung hoà kháng thể kháng HCV Tuy nhiên, vùng hay biến đổi, khó khăn để chế tạo loại vacxin có khả phịng chống HCV -4- 1.1.3 Các genotype HCV Bộ gen HCV có vùng ổn định gọi vùng bảo thủ cao vùng thay đổi mạnh gọi vùng siêu biến đổi (HVR1) nằm đầu 5’ E2/NS1 Những đột biến vùng siêu biến đổi khiến HCV có cấu trúc gen không ổn định phân chia thành nhiều genotype phân týp khác Trong sợi ARN HCV có khoảng 68-91,8% nucleotit xếp theo trình tự chung cho tất genotype Việc xác định genotype vi rút dựa vào khác biệt trình tự nucleotit vùng thay đổi tồn sợi ARN vùng giới hạn khác oligonucleotit mồi trình khuếch đại PCR (polymerase chain reaction) Nếu khác biệt lớn 20%, chúng xếp thành genotype khác Ngược lại, khác biệt 20% chúng cho genotype khác phân týp Dựa tính khơng đồng gen, người ta chia HCV thành 11 genotype (ký hiệu từ -11), với nhiều phân týp (ký hiệu a,b,c ) với khoảng 100 chủng khác phân bố khác gen Các nghiên cứu nước xác định phân bố genotype HCV nhiều vùng dân cư nhóm có nguy cao Genotype có mặt tồn cầu phân typ 1a 1b hay gặp chiếm tới 60%, chủ yếu tập trung Bắc Âu, Bắc Mỹ, Nam Đơng Âu , Nhật Bản; Genotype genotype và có khu vực bắc M ỹ, tây Âu phân bố khác nước; Genotype có Trung Đơng, Ai Cập, châu Phi; Genotype Nam Phi; Riêng genotype -11 có Châu Á 1.1.4 Tình hình nhiễm HCV 1.1.4.1 Tình hình nhiễm HCV giới Theo số liệu Tổ chức Y tế giới, tồn cầu có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV chiếm tỷ lệ khoảng 3% dân số giới HCV có mặt hầu hết châu lục Tỷ lệ nhiễm HCV cộng đồng dao động khoảng 0,3-6% Nhìn chung tỷ lệ nhiễm HCV Châu Âu thấp Châu Á Châu -5- KẾT LUẬN Từ kết thu chúng tơi có số kết luận sau: Xây dựng qui trình sản xuất panel HCV chuẩn Qui trình chế tạo panel chuÈn anti-HCV gồm bước sau: - Thu thập mẫu huyết anti- HCV (-) (+) - Sàng lọc HBsAg anti-HIV - Khẳng định anti-HCV (-) (+) - Xác định genotype cña mẫu huyết anti-HCV (+) PCR (+) - Hiu chnh hàm lợng anti-HCV theo panel chuẩn quốc tế - Lọc vơ trùng, đóng 0,25ml/ống - Bảo quản nhiệt độ ≤-350C ChÕ tạo đợc 70 panel chuẩn anti-HCV để đánh giá chất lợng sinh phẩm chẩn đoán anti-HCV kỹ thuật ELISA: Mỗi b panel chuẩn anti-HCV bao gm: + 25 tube huyt dng tớnh vi cỏc hàm lợng anti-HCV khác có chứa phân týp 1a, 1b, 3b, 6a, 7ab, 8b 9a + 25 tube huyết âm tính với anti-HCV Chất lượng b panel sn phm đà đợc thẩm định tng ng với panel chuẩn quốc tế - 50 - KIẾN NGHỊ Tiếp tục theo dõi độ ổn định panel thành phẩm cách đánh giá với panel chuẩn quốc tế thời điểm 12, 24, 36, 48 60 tháng Được công nhận Panel chuẩn quốc gia để thay cho panel chuẩn quốc tế sau có số liệu chứng minh đầy đủ Comment [T6]: - 51 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt ỗ Tuấn t v cs (2005), Ch to b sinh phẩm miễn dịch gắn men hệ phát anti-HCV Đề tài nghiên cứu khoa học cấp NguyÔn Kim Hương cộng (2004) : Nghiên cứu sản xuất panel mẫu để đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đốn HBsAg nhập từ nước ngồi, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Hoàng Đăng Mịch (2001), Tình hình nhiễm vi rút viêm gan C (HCV) số nhóm đối tượng Hải Phòng số lượng tế bào lympho B, T người có anti-HCV (+), Luận án tiến sỹ Y học Trương Xuân Liên (1994), Tình hình nhiễm vi rút viêm gan C TP Hồ Chí Minh, Luận án Phó Tiến Sỹ khoa học Y dược, Hà Nội Trương Xuân Liên (2005), So sánh kỹ thuật định týp thứ týp vi rút viêm gan C, Tạp chí Y học dự phịng Tập XV, số 1(72) tr 79-81 Lê Hoàng Long cs (2004) Lựa chọn tối ưu để định genotype phân týp vi rút viêm gan C Việt Nam Hội nghị khoa học công nghệ sinh học Hội y học dự phòng TP HCM Nguyễn Quốc Triệu, Phan Lê Tuấn, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Thị Hằng, Đỗ Đình Hồng (1999) Tình hình nhiễm vi rút viêm gan B, C nhân viên Y tế số bệnh viện Hà Nội, Tạp chí y học Dự phịng Nguyễn Thu Vân (2002), Dịch tễ học dự phòng bệnh viêm gan virut từ A-E, Nhà xuất Y häc, Hµ Néi Tiếng Anh Abdel-Hamid M., EL-Daly M., EL-Kafrawwy S., Mikhail N., Strickland G.t., Fix A.D (2002), Comparison of second and thirdgeneration enzyme immunoassays for detecting antibodies to hepatitis C virus, J Clin Microbiol.,40(5), pp.1656-1659 10 Barrera J., Prancis., Ercilla G., Nelles M., Achord D., Darner J., LeeSR (1995), Improved detection of anti- HCV in post- tranfusion - 52 - hepatitis by third-generation ELISA, Vox sang, 68, pp.15-18 11 CDC (1998), Recommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV related chronic disease MMWR;47(No,RR-19), pp.1-33 12 Centers for Disease Control and Prevention (1999) Hepatitis C virus and disease Lancet; 25, pp 23-25 13 Chang J.C., Ruedinger B., Cong M., Lambert S., Lopareva E., Purdy M., Holloway B.P., jue D.L., OfenlochB., Fields H.A., Khudyakov Y.E (1999) Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus J.Med Virol., 59, pp.437-450 14 Courouce A.M., Bouchardeau F., Girrault A., Le Marrec N (1994), Significance of NS3 and NS5 antigen in screening for HCV antibody Lancet, 343, pp.853-854 15 Feucht H.H., Zollner B., (1998) Hepatitis C virus infection, Eur 16 17 18 19 20 21 Journal Epidemiol,42, pp20-21 Kotika H., Okamoto H., Tsuda F., Pham Song, Nakata S., Chosa T., Iizuka H., Mishiro S., Miyakawa Y., Mayumi M (1994) Hepatitis C virus variants from Vietnam are classifiable into the seventh, eighth and nineth major genetic groups Proc Natl, Acad Sci., 91, pp.1102211026 Lee SR et al (2001) Efficacy of a hepatitis C virus core antigen enzyme-linked immunosorbent assay for the identification of 'windowphase' blood donations Vox Sanguinis, 80, pp.19-23 Nubling CM et al (2002) Sensitivity of HCV core antigen and HCV ARN detection in the early infection phase Transfusion, 42, pp.10371045 Sauce KS et al (2003) Determining hepatitis C virus genotype by analysing the sequence of NS5b region Journal of clinical virology, pp.276-85 W H Gerlich and G Caspari (1996), Hepatitis viruses and the safety of the blood donations, Journal of Viral hepatitis, Vol.6(1), pp 6-15 WHO (2001) Hepatitis C Assays: Operational Characteritics (phase I) - 53 - 22 23 24 25 26 Report 2, WHO/BTC/BTS/01.5 pp35 WHO (2001) Hepatitis C Assays: Operational Characteritics (phase I) Report 01/2001, WHO/BTC/BTS/01.5 pp35 World Health Organization (1999) Global surveillance and control of hepatitis C Report of a WHO Consultation organized in Collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium Journal of Viral Hepatology, 6, pp.35-47 World Health Organization (1999) Hepatitis C - global prevalence (update) Weekly Epidemiological Record, 74:425-427 World Health Organization (1997) Hepatitis C – global prevalence Weekly Epidemiological Record, 72, pp.341-344 World Health Organization Hepatitis C, 1997, http://www.who.int/inf-fs/en/fact164.html, World Health Organization, http://www.who.int/inf-fs/en/fact164.html - 54 - Phụ lục QUY TRÌNH THỰC HIỆN Sinh phẩm chẩn đốn HBsAg Monolisa Ag HBs Plus (Hãng Biorad) - Chuẩn bị dụng cụ rửa R2 Chuẩn bị dung dịch cộng hợp (R6+R7) Lấy số giếng cần thiết khỏi túi bảo quản Nhỏ mẫu vào giếng theo trật tự sau: - Giếng A1, B1, C1 D1; 100µl chứng âm (R3) - Giếng E1: 100µl chứng dương(R4) Giếng F1, G1… :100µl mẫu cần xét nghiệm Nhỏ 50mcl dung dịch cộng hợp vào giếng Dán giấy phủ phiến ủ nhiệt độ 400C vòng 120 phút Sau bỏ giấy dán, rửa máy rửa tự động: tối thiểu lần với 370 µl dung dịch rửa Chuẩn bị dung dịch chất (R8, R9) Nhỏ 100µl vào giếng, ủ nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng 30 phút Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (R10) vào giếng Đo đậm độ quang học (OD) bước sóng 450/620nm vịng 30 phút kể từ nhỏ dung dịch dừng phản ứng - Cách tính - OD(A1) + OD(B1) + OD(C1) + OD(D1) Cách tính giá trị ngưỡng (Cutt off Value- CO)= ODtbR3+0.040 ODtb R3= Phụ lục QUY TRÌNH THỰC HIỆN Sinh phẩm chẩn đoán Genscreen anti-HIV 1/2 (Hãng Biorad) - Chuẩn bị dụng cụ rửa Lấy số giếng cần thiết khỏi túi bảo quản - Dán giấy phủ phiến ủ nhiệt độ 370C±1 vịng 30±5 phút - Sau bỏ giấy dán, rửa máy rửa tự động: tối thiểu lần với 370 Nhỏ mẫu vào giếng theo trật tự sau: Nhỏ 25µl dung mơi vào giếng Giếng A1: 75 µl huyết chứng âm (R3) B1, C1 D1: 100µl chứng ngưỡng (R4) Giếng E1: 75µl chứng dương (R5) Giếng F1, G1… :100µl mẫu cần xét nghiệm Trộn cách hút lên xuống lần với pipette 75µl mcl dung dịch rửa - Nhỏ 100µl dung dịch cộng hợp vào mối giếng - Dán giấy phủ phiến ủ nhiệt độ phòng, 18-300C 30±5 phút - Sau bỏ giấy dán, rửa máy rửa tự động: tối thiểu lần với dung dịch rửa loại bỏ phần dung dịch thừa cách úp giấy thấm - Chuẩn bị dụng dịch chất (R8,R9) Nhỏ thật nhanh 80µl dung dịch chất vào giếng, ủ nhiệt độ phòng tránh ánh sáng 30±5 phút khơng dùng giấy phủ phiến - Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (R10) vào giếng - Đo đậm độ quang học (OD) bước sóng 450/620nm vòng 30 phút kể từ nhỏ dung dịch dừng phản ứng Cách tính OD trung bình huyết chứng ngưỡng (ODtbR4) - ODtb R4= - OD(A1) + OD(B1) + OD(C1) + OD(D1) Cách tính giá trị ngưỡng (Cut off Value- CO)= ODtbR4+0.040 Kết có giá trị khi: Tất OD huyết chứng âm phải nhỏ 70% giá trị ngưỡng ( ODR3