4.2.1 Lựa chọn mẫu huyết thanh
Để đỏnh giỏ chất lượng bộ sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV mỗi nhà sản xuất đó tự nghiờn cứu, chế tạo panel cho mỡnh. Tuy nhiờn TCYTTG chỉ cụng nhận panel của hóng Boston Biomedical Inc là panel chuẩn quốc tế, và cho phộp cỏc nhà sản xuất khỏc lấy đú làm tiờu chuẩn để đỏnh giỏ chất lượng trực tiếp sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV hoặc dựng làm chuẩn để chế tạo panel chuẩn cơ sở hoặc quốc gia. Panel của hóng BBI số lượng mẫu huyết thanh và huyết tương được thu thập từ 1990-1998 từ những ngưũi tỡnh nguyện trờn toàn nước Mỹ. Trong 25 tube của bộ panel cú 2 tube anti-HCV (-) và 23 tube anti- HCV (+). 25 tube này được khẳng định trờn nhiều bộ sinh phẩm là Ortho HCV 3.0 EIA, Abbott AxSYM 3.0, Abbott HCV EIA 3.0, Abbott Imx 3.0, Abbott PRISM 3.0 và Monolisa Plus là những sinh phẩm chẩn đoỏn anti- HCV đó được Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) cấp giấy chứng nhận. Ngoài ra, cỏc mẫu huyết thanh này đều được sàng lọc HBsAg và anti-HIV.
Đối với panel của TCYTTG (WWHV301), cỏc mẫu huyết thanh được thu thập từ cỏc chõu lục. Tất cả cỏc mẫu huyết thanh này được sàng lọc anti-
HCV bằng 2 thử nghiệm ELISA là Monolisa anti-HCV Plus của hóng Biorad và thử nghiệm Ortho HCV 3.0 ELISA của hóng Ortho, ngoài ra cũn được sàng lọc HBsAg và anti-HIV. Theo quy trỡnh sản xuất panel của TCYTTG, kết quả của 2 thử nghiệm ELISA dự là dương tớnh hoặc một dương tớnh hoặc một õm tớnh đều phải được khẳng định bằng thử nghiệm RIBA. Sau đú được khẳng định lại bằng thử nghiệm PCR để định genotype và xỏc định phõn týp
Ở nghiờn cứu này với 100 mẫu huyết thanh dự tuyển thu thập từ Viện huyết học và truyền mỏu Trung ương, Viện quõn Y 175, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cú 50 mẫu õm tớnh với anti-HCV và 50 mẫu dương tớnh với anti- HCV. Cỏc mẫu huyết thanh dự tuyển đựoc sàng lọc HBsAg và anti-HIV. Kết quả trong 50 mẫu huyết thanh anti-HCV(-) đều khụng chứa HBsAg và anti- HIV, cũn 50 mẫu huyết thanh anti-HCV (+) được sàng lọc cũng khụng cú anti-HIV và nhưng 2 mẫu cú HBsAg. Sau đú tất cả cỏc mẫu huyết thanh đều được khẳng định anti-HCV bằng 2 thử nghiệm là Monolisa anti-HCV Plus của hóng Biorad và Ortho HCV 3.0 ELISA của hóng Ortho Diagnostic, đõy là 2 bộ sinh phẩm đó được Hội đồng tiờu chuẩn quốc tế phõn loại là 2 thử nghiệm chuẩn (Reference test). Chỳng tụi khụng lựa chọn những mẫu huyết thanh mà chỉ cho một kết quả dương tớnh. Chỳng tụi cũng khụng dựng thử nghiệm RIBA bởi vỡ cỏc huyết thanh này đều được khẳng định bằng kỹ thuật PCR là một thử nghiệm rất chớnh xỏc. Vỡ vậy qui trỡnh thu thập mẫu của chỳng tụi vẫn đạt được những tiờu chuẩn mà TCYTTG đề ra trong việc khẳng định mẫu huyết thanh dựng để chế tạo bộ panel. Trong 50 mẫu huyết thanh anti-HCV(+) được khẳng định thỡ cú 49 mẫu cú kết quả anti-HCV(+) và 1 mẫu anti-HCV (-) (bảng 3.3 và bảng 3.4). Khi khẳng định bằng PCR thỡ cú 41 mẫu PCR (+) và 8 mẫu PCR(-) (bảng 3.5).
Kết quả trờn đó khẳng định được qui trỡnh của chỳng tụi là đơn giản hơn qui trỡnh sản xuất của TCYTTG (khụng cần dựng thử nghiệm RIBA).
4.2.2. Phõn bố cỏc genotype của vi rỳt viờm gan C và việc lựa chọn cỏc genotype và phõn týp để chế tạo panel chuẩn.
Theo như phần tổng quan đó trỡnh bày, dựa trên tính không đồng nhất của bộ gen vi rỳt viờm gan C cú 11 genotype được ký hiệu từ 1-11, cỏc phân týp được ký hiệu là a,b,c... với khoảng 100 chủng khác nhau. Genotype 1 và 3 phân bố trên toàn cầu trong đú phõn týp 1a và 1b rất hay gặp, chiếm khoảng 60% số nhiễm trên toàn cầu.
Một nghiờn cứu khỏc cho thấy cỏc phõn týp được phõn bố theo vựng: Phõn týp 1a chủ yếu ở Bắc Mỹ và Australia. Phõn týp 1b chủ yếu ở Chõu Âu và Chõu Á; Phõn týp 2a ở Nhật Bản và Trung Quốc; Phõn týp 2b ở Mỹ và Bắc Âu; Phõn týp 2c ở Tõy và Nam Âu; Phõn týp 3a ở Australia và Nam Á; Phõn týp 4a ở Ai Cập; Phõn týp 4c ở Trung Phi; Phõn týp 5a ở Nam phi; Phõn týp 6a ở Ma Cau, Hồng Kụng; Phõn týp 7a, 7b ở Thỏi Lan; Phõn týp 10a và 11a ở Indonesia. Cũn phõn týp 6a, 8a,8b và 9a cú ở Việt Nam. Sự phõn bố của cỏc genotype của vi rỳt viờm gan C cũn khỏc nhau ở cỏc quốc gia và theo từng thời gian.
Theo tài liệu của BBI bộ panel của hóng bao gồm cỏc týp và phõn týp 1a, 1b, 2b và 3. Điều đú cũng phự hợp với sự phõn bố của cỏc genotype và phõn týp ở Bắc Mỹ. Cũn cỏc panel của TCYTTG gồm cỏc genotype từ 1-4 bao gồm 7 phõn týp là: 1a, 1b, 2a, 2c, 3a, 3b, 4c, 4d, 4h, cũn thiếu cỏc genotype 5 và 6 do thu thập mẫu huyết thanh chủ yếu từ cỏc nước Chõu Phi và Nam Mỹ. Vỡ vậy trong thời gian tới TCYTTG cũng sẽ bổ sung thờm cỏc genotype và phõn týp trờn vào panel.
Theo kết quả của chỳng tụi ở bảng 3.7 chỉ ra cỏc huyết thanh chế tạo bộ panel cú 6 genotype là 1, 3, 6, 7, 8 và 9 trong đú genotype 1 chiếm 65,8% gồm 2 phõn týp là 1a và 1b, genotype 6 chiếm 22% chỉ cú một phõn týp là 6a, cũn cỏc phõn týp 7ab, 8b, 9a chỉ chiếm số lượng ớt. Tất cả 7 phõn týp này đều
được đưa vào bộ panel để bảo đảm tớnh đại diện của cỏc phõn týp đang lưu hành tại Việt Nam.
Theo tỏc giả Trương Xuõn Liờn khi tiến hành xỏc định phõn týp bằng kỹ thuật phõn tớch trỡnh tự nucleotit trờn vựng gen lừi và NS5b của 25 mẫu khụng xỏc định được genotype hoặc cú genotype 6 kết quả cho thấy: gồm 11 phõn týp 6a, 1phõn týp 1a, 3 phõn týp 1b; 1 phõn týp 2a; 7 phõn týp 7b và 1 phõn týp 8b
Như vậy kết quả định genotype và phõn týp của chỳng tụi là phự hợp với kết quả nghiờn cứu của Trương Xuõn Liờn. Tuy nhiờn trong nghiờn cứu của chỳng tụi cũn xỏc định được phõn týp 9a và 7ab cũn nghiờn cứu của Trương Xuõn Liờn thấy cú týp 4 nhưng tỷ lệ rất nhỏ. Giải thớch sự khỏc nhau như vậy là do số lượng mẫu lấy cũn chưa đại diện hết cho cỏc vựng dõn cư, địa lý. Số lượng đối tượng được lấy mỏu chưa đủ lớn để mang tớnh đại diện. Kết quả nghiờn cứu đó cho thấy việc xỏc định genotype bằng kỹ thuật phõn tớch trỡnh tự nucleotit của vựng gen lừi và NS5b cho phộp xỏc định chủng vi rỳt lưu hành tại Việt Nam. Kết quả này cũng phự hợp với kết quả của một số nghiờn cứu trờn thế giới.
Chế tạo được panel chuẩn đa dạng về genotype và phõn týp lưu hành ở Việt Nam cú giỏ trị rất lớn trong việc đỏnh giỏ chất lượng của bộ sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV.
4.2.3 Hiệu chỉnh hàm lượng anti-HCV của cỏc mẫu huyết thanh để chế tạo panel chuẩn
Theo hướng dẫn của TCYTTG việc hiệu chỉnh hàm lượng anti-HCV được thực hiện bằng huyết thanh khụng chứa khỏng thể anti-HCV. Cỏc huyết thanh tham gia vào panel chuẩn được hiệu chỉnh 1 cỏch độc lập.
TCYTTG cú quy định nếu giỏ trị S/CO của thử nghiệm nằm trong khoảng 1- 2,5 mẫu huyết thanh được coi là dương tớnh yếu với anti-HCV, giỏ
trị S/CO từ 2,6- 4,5 là dương tớnh vừa, giỏ trị S/CO>4,5 là dương tớnh mạnh. Đối với cỏc panel độ nhạy yờu cầu phải cú hàm lượng anti-HCV khỏc nhau, giao động từ thấp đến cao. Phõn tớch thành phần của cỏc mẫu huyết thanh trong panel chuẩn quốc tế chỳng tụi thấy trong số 23 mẫu cú anti-HCV (+) thỡ chỉ cú 1 mẫu cho kết quả dương tớnh yếu, 3-4 mẫu cú phản ứng dương tớnh vừa và 18-19 mẫu cho dương tớnh mạnh, do vậy trong panel nghiờn cứu chỳng tụi cũng đảm bảo hàm lượng anti-HCV cú trong cỏc huyết thanh phải tương đương như vậy. Kết hợp với việc lựa chọn 7 phõn typ tham gia vào panel chuẩn, chỳng tụi đó lựa chọn hàm lượng anti-HCV cho cỏc phõn typ như sau: cả 7 phõn typ này đều cú hàm lượng anti-HCV thấp, cú S/CO nằm trong khoảng từ 1,0 đến 2,5. 18 mẫu huyết thanh cũn lại được phõn đều cho 3 phõn typ cú tỷ lệ lưu hành cao trong cộng đồng người Việt nam là phõn typ 1a, 1b và 6a, mỗi phõn typ gồm 6 huyết thanh và cú hàm lượng anti-HCV từ mức trung bỡnh đến cao. Kết quả xỏc định hàm lượng cuối cựng của cỏc mẫu huyết thanh trong panel chế tạo được thể hiện ở bảng 3.9. Kết quả cho thấy hàm lượng anti-HCV cú trong cỏc mẫu huyết thanh của panel nằm trong khoảng giao động giống như của panel chuẩn quốc tế.
Để chứng minh qui trỡnh chế tạo panel là hoàn thiện, bộ panel nghiờn cứu của chỳng tụi đó được thẩm định tại Bộ mụn Vi Sinh vật- Học Viện quõn Y, nơi cú đủ điều kiện đỏnh giỏ chất lượng cỏc sinh phẩm phẩm chẩn đoỏn. Kết quả là bộ panel đạt chất lượng, trong 25 ống huyết thanh nghiờn cứu cú tỷ lệ S/CO nằmg trong khoảng 1,82 đến 7,64 tương đương với panel chuẩn (bảng 3.16).
4.2.4. Bộ panel thành phẩm
Chỳng tụi đó sản xuất được 70 bộ panel, mỗi bộ gồm 50 tube trong đú cú 25 tube dựng để đỏnh giỏ độ nhạy và 25 tube dựng để đỏnh giỏ độ đặc hiệu. Trong phạm vi của đề tài chỉ sản xuất panel để đỏnh giỏ chất lượng cỏc sinh
phẩm chẩn đoỏn anti-HCV. Panel độ nhạy của hóng BBI cú 25 tube trong đú 23 tube anti-HCV (+) và 2 tube anti-HCV (-). Cũn panel độ đặc hiệu chỉ cú 11 tube anti-HCV(-). Panel của nghiờn cứu này gồm 25 tube huyết thanh anti- HCV (-) dựng để đỏnh giỏ độ đặc hiệu và 25 tube huyết thanh anti-HCV (+) dựng để đỏnh giỏ độ nhạy.
Số lượng cỏc tube huyết thanh cú trong panel độ nhạy và panel độ đặc hiệu của chỳng tụi nhiều hơn so với panel của hóng BBI, vỡ thế việc sử dụng để đỏnh giỏ chất lượng cỏc sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV thuận lợi hơn.
Căn cứ vào khuyến cỏo sử dụng panel chuẩn quốc tế là sau khi mua về nờn phõn chia cỏc mẫu huyết thanh thành cỏc lượng nhỏ trỏnh tan-đụng băng nhiều lần do cú sự ảnh hưởng đến hàm lượng anti-HCV trong mỗi mẫu huyết thanh, đồng thời căn cứ vào thể tớch lấy mẫu của cỏc bộ sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV khỏc nhau (tuỳ Hóng sản xuất mà lượng mẫu thử nghiệm khỏc nhau, từ 10 mcl đến 50 mcl) nờn chỳng tụi đúng ống với thể tớch 0,25 ml/tube cho mỗi mẫu huyết thanh. Thể tớch này cú thể sử dụng từ 2 đến 3 lần đỏnh giỏ chất lượng (làm kộp), như vậy hạn chế được số lần tan-đụng băng, hiệu quả kinh tế hợp lý hơn vỡ nếu đúng ống chỉ dựng 1 lần thử nghiệm thỡ rất tốn kộm (tube đựng huyết thanh là tube chuyờn biệt, chịu đựng lạnh õm sõu, vụ trựng, cú nắp xoắn an toàn giỏ khoảng 6000đ/1 tube)
Cho đến nay chưa cú tài liệu nào đề cập tới quỏ trỡnh nghiờn cứu ảnh hưởng của sự tan đụng băng đến chất lượng của bộ sinh phẩm, nhưng kết quả của chỳng tụi nghiờn cứu ở bảng 3.13 cho thấy rằng việc tan đụng băng nhiều lần cú ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng panel. Chỳng tụi cũng đưa ra khuyến cỏo cỏc panel chỉ được phộp tan băng tối đa 3 lần và phự hợp với thể tớch đúng ống.
4.2.5. Chất lượng của panel thành phẩm
Panel thành phẩm được thẩm định tại Học viện quõn y, khoa Vi sinh vật, là nơi cú uy tớn khoa học. Kết quả trỡnh bày ở bảng 3.12 khẳng định chất lượng của panel chế tạo: Panel chế tạo có chứa 25 mẫu huyết thanh anti-HCV (-) và 25 mẫu huyết thanh anti-HCV (+) với hàm l−ợng anti-HCV t−ơng đ−ơng với panel chuẩn quốc tế thông qua giá trị S/CO.
Ngoài ra việc sử dụng panel chế tạo đồng thời với panel chuẩn quốc tế PHV 205 trong việc đỏnh giỏ 2 bộ sinh phẩm mới nhập vào thị trường Việt nam õin phộp đăng ký lưu hành) cho kết quả giống nhau về độ nhạy và độ đặc hiệu (đều đạt 100%) đó bước đầu khẳng định được chất lượng của panel chuẩn anti-HCV chế tạo đ−ợc.
Kết quả này cho phộp kết luận: panel chế tạo cú thể dựng để đỏnh giỏ chất lượng của bộ sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV nhập hoặc sản xuất tại Việt Nam.
4.3. HIỆU QUẢ THỰC TIỄN
Việc hoàn thành đề tài nghiờn cứu này cú những đúng gúp sau:
1. Xõy dựng được qui trỡnh sản xuất panel HCV đó khẳng định rằng Việt Nam cú đủ khả năng sản xuất được panel HCV chuẩn với chất lượng tương đương với tiờu chuẩn quốc tế, đồng thời tạo đà cho việc nghiờn cứu phỏt triển và sản xuất cỏc loại panel khỏc.
Quy trỡnh cú tớnh khả thi : Cú thể sản xuất panel HCV bất cứ khi nào do cỏc nguyờn vật liệu để sản xuất panel này đều sẵn cú trong nước.
2. Chủ động trong cụng tỏc kiểm định sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV. Panel chuẩn chế tạo đa dạng về genotype và phõn týp lưu hành ở Việt Nam cú giỏ trị rất lớn trong việc đỏnh giỏ chất lượng của bộ sinh phẩm chẩn đoỏn anti- HCV.
3. Hiệu quả về mặt xó hội: hiện nay việc sàng lọc anti-HCV là bắt buộc trong sàng lọc mỏu do vậy rất cần sinh phẩm chẩn đoỏn bảo đảm chất lượng.
Trong tương lai bộ panel chế tạo của chỳng tụi hy vọng sẽ được sử dụng rộng rói để đỏnh giỏ đỳng chất lượng cỏc sinh phẩm, gúp phần giảm tỷ lệ việc lõy truyền HCV.
4. Hiệu quả về kinh tế: chỳng tụi tớnh toỏn sơ lược giỏ thành một bộ panel chế tạo đúng ống 0,25ml khoảng 3,5 triệu đồng/bộ (gồm panel độ nhạy và độ đặc hiệu). Trong khi kinh phớ mua bộ panel độ nhạy của hóng BBI là 31 triệu đồng, panel độ đặc hiệu là 11 triệu đồng. Như vậy việc chế tạo được panel chuẩn đó giảm được giỏ thành trong kiểm định sinh phẩm chẩn đoỏn anti- HCV.
Việc sản xuất panel chuẩn trờn cú thể sử dụng trong vũng 4-5 năm với mức độ mỗi năm kiểm định khoảng 15 bộ sinh phẩm chẩn đoỏn anti-HCV. 5. Đề tài này đã góp phần đào tạo đ−ợc 01 thạc sỹ Y học khoá 2003-2005 với kết quả xuất sắc.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được chỳng tụi cú một số kết luận sau:
1. Xõy dựng được qui trỡnh sản xuất panel HCV chuẩn
Qui trỡnh chế tạo bộ panel chuẩn anti-HCV gồm cỏc bước chớnh sau: - Thu thập mẫu huyết thanh anti- HCV (-) và (+).
- Sàng lọc HBsAg và anti-HIV - Khẳng định anti-HCV (-) và (+)
- Xỏc định genotype của cỏc mẫu huyết thanh anti-HCV (+) và PCR (+).
- Hiệu chỉnh hàm l−ợng anti-HCV theo panel chuẩn quốc tế - Lọc vụ trựng, đúng 0,25ml/ống
- Bảo quản ở nhiệt độ ≤-350C.
2. Chế tạo đ−ợc 70 bộ panel chuẩn anti-HCV để đánh giá chất l−ợng bộ sinh phẩm chẩn đoán anti-HCV bằng kỹ thuật ELISA:
Mỗi bộ panel chuẩn anti-HCV bao gồm:
+ 25 tube huyết thanh dương tớnh với cỏc hàm l−ợng anti-HCV khỏc nhau cú chứa 7 phõn týp là 1a, 1b, 3b, 6a, 7ab, 8b và 9a.
+ 25 tube huyết thanh õm tớnh với anti-HCV.
3. Chất lượng của bộ panel sản phẩm đã đ−ợc thẩm định tương đương với bộ panel chuẩn quốc tế
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục theo dừi độ ổn định của panel thành phẩm bằng cỏch đỏnh giỏ với panel chuẩn quốc tế ở cỏc thời điểm 12, 24, 36, 48 và 60 thỏng.
2. Được cụng nhận là Panel chuẩn quốc gia để thay thế cho panel chuẩn quốc tế sau khi cú số liệu chứng minh đầy đủ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Đỗ Tuấn Đạt và cs (2005), Chế tạo bộ sinh phẩm miễn dịch gắn men thế
hệ 3 phỏt hiện anti-HCV. Đề tài nghiờn cứu khoa học cấp bộ.
2. Nguyễn Kim Hương và cộng sự (2004) : Nghiờn cứu sản xuất panel mẫu
để đỏnh giỏ chất lượng bộ sinh phẩm chẩn đoỏn HBsAg nhập từ nước