Nghiên cứu chế tạo bộ kít phát hiện nhanh nọc rắn hổ mang naja atra bằng kỹ thuật sắc ký miễn dịch (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN NGỌC TUẤN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KÍT PHÁT HIỆN NHANH NỌC RẮN HỔ MANG NAJA ATRA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Dị ứng miễn dịch Mã số: 62 72 01 09 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - NĂM 2017 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đặng Dũng TS Trịnh Thanh Hùng Phản biện 1: GS TS Nguyễn Thị Dụ Bệnh viện Bạch Mai Phản biện 2: GS TS Phạm Văn Thức Trường Đại học Y Dược Hải Phòng Phản biện 3: PGS TS Trịnh Xuân Kiếm Bệnh viện Bạch Mai Luận án bảo vệ trước Hội đồng luận án cấp trường vào hồi: ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Học viện Quân y tháng năm ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu thống kê Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai năm 2015, số bệnh nhân nhập viện bị rắn hổ cắn chiếm 7,12% tổng số trường hợp ngộ độc nói chung, có 29% chẩn đoán xác định rắn hổ mang cắn [3] Một loài rắn hổ mang thường gặp hay gây tai nạn rắn cắn Miền bắc rắn hổ mang Naja atra, hay gọi rắn hổ mang bành Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn dẫn tới nhiễm độc nọc rắn, không điều trị kịp thời dẫn đến tử vong để lại di chứng nặng nề [4] Theo Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn Huyết kháng nọc rắn [124] Thế nhưng, điều kiện tiên cho sử dụng Huyết kháng nọc rắn phải xác định loài rắn độc gây tai nạn rắn cắn Tuy nhiên nay, nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc gây tai nạn rắn cắn để lựa chọn Huyết kháng nọc rắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, thường bị hạn chế Bên cạnh kỹ thuật ELISA nhiều tác giả nước giới lựa chọn để phát triển xét nghiệm phát nọc rắn [5], [29], [86], [107] Ở Đài loan, Hung D.Z cộng áp dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch để phát triển xét nghiệm nhanh phát nọc rắn hổ mang có thành công định [59] Từ sở lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu chế tạo kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra kỹ thuật sắc ký miễn dịch” nhằm hai mục tiêu: Chế tạo kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo nguyên lý sắc ký miễn dịch Đánh giá khả phát nọc rắn Naja atra xét nghiệm thực nghiệm lâm sàng Tóm tắt đóng góp luận án: Trong nghiên cứu này, lần Việt nam phát triển thành công kít phát nhanh nọc rắn hổ mang kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch Bộ kít có khả phát nọc rắn chuẩn pha dung dịch đệm ng/ml, huyết nước tiểu 10 ng/ml Có thể thấy, độ nhạy kít tương đương với phương pháp xét nghiệm khác Bộ kít phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh chàm quạp Tuy nhiên, kít có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất nồng độ 20 ng/ml Kết thử nghiệm mẫu bệnh phẩm lâm sàng thu thập từ bệnh nhân chẩn đoán rắn hổ mang cắn: tỷ lệ xét nghiệm dương tính mẫu huyết 69,9%; dịch vết cắn 89,2% nước tiểu 60% Sử dụng kít giúp bác sỹ chẩn đoán nhanh rắn hổ mang cắn, từ sớm đưa định dùng huyết kháng nọc rắn đặc hiệu, phương pháp điều trị hiệu bệnh nhân bị rắn độc cắn thời điểm Bố cục luận án: Luận án gồm 110 trang, bao gồm: - Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu: trang - Tổng quan: 30 trang - Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 24 trang - Kết quả: 28 trang - Bàn luận: 24 trang - Kết luận kiến nghị: trang Luận án có 16 bảng, 11 biểu đồ, sơ đồ, 31 hình vẽ, 125 tài liệu tham khảo (cụ thể 18 tài liệu Tiếng Việt, 107 tài liệu Tiếng Anh) CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tai nạn rắn cắn chẩn đoán rắn độc cắn Việt nam 1.1.1 Tai nạn rắn cắn Việt nam Cho đến nay, chưa có số liệu thống kê xác số ca nhiễm độc tử vong rắn cắn Mặc dù vây, nhiều cách tiếp cận khác nhau, chuyên gia ước tính năm nước ta có đến 30.000 trường hợp bị rắn cắn, thủ phạm chủ yếu hai họ rắn hổ (Elapidae) họ rắn lục (Viperidae) gây [12], [13], [17], [71] Tại Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch mai, năm 2015, tính số trường hợp bị rắn hổ cắn 216 trường hợp (chiếm 7,12% so với tổng số bệnh nhân ngộ độc nói chung), có 29% chẩn đoán xác định rắn hổ mang cắn [3] 1.1.2 Chẩn đoán rắn độc cắn Việt Nam Cho đến nay, nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc gây tai nạn rắn cắn chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng nhận biết loài rắn [4], [13] Chẩn đoán lâm sàng thường dựa vào: • Mô tả bệnh nhân người tình bị cắn đặc điểm rắn gây tai nạn họ nhìn thấy bắt mang theo đến bệnh viện; • Dấu vết móc độc để lại vết thương rắn cắn; • Biểu nhiễm độc chỗ quanh vết cắn chảy máu, đau buốt, phù nề, hoại tử; • Biểu nhiễm độc toàn thân nhiễm độc thần kinh hay rối loạn đông cầm máu Tuy nhiên, chẩn đoán dựa vào lâm sàng có số hạn chế rắn cắn tai nạn thường gây hoảng loạn cho bệnh nhân dẫn đến mô tả sai lệch rắn gây tai nạn Rất trường hợp bệnh nhân mang theo rắn gây tai nạn lúc bắt rắn Hơn nữa, nghiên cứu đặc điểm nhiễm độc loài rắn độc gây tai nạn chưa có nhiều Một nhược điểm khác phải dựa biểu mức độ nhiễm độc bệnh nhân, biểu có nọc rắn gây hại cho thể bệnh nhân cách rõ ràng, tức giai đoạn muộn bệnh 1.2 Rắn hổ mang Naja atra 1.2.1 Đặc điểm sinh học nọc độc Rắn hổ mang Naja atra hay gọi Taiwan cobra, Chinese cobra, loài thuộc họ Elapidae [4], [13], [65], [116] Rắn hổ mang N.atra mô tả lần bác sỹ, nhà động vật học người Đan mạch Theodore Edward Cantor vào năm 1842 [105] Nọc rắn có độc tính cao, thành phần neurotoxin, cardiotoxin, haematoxin Phospholipase A2… [1], [2], [16], [28], [117] Giá trị LD50 chuột 0,62 mg/kg tiêm da [78] 1.2.2 Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn Ở Việt nam, nghiên cứu Nguyễn Kim Sơn (2008), có đến 163/384 bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn nhập viện xác định rắn hổ mang N.atra (chiếm 42%) [13] Khi bị rắn hổ mang cắn dấu vết độc, đau đớn thường xảy vòng 10 phút vị trí vết cắn Các triệu chứng đau, đỏ da, sưng nề, chảy máu chí có bọng nước dần nặng lên Các vết thương tổ chức chỗ tương đối rõ ràng, nguyên nhân tác dụng cardiotoxin phospholipase A2 [97], [122] Theo Nguyễn Kim Sơn, dấu hiệu phù nề + hoại tử sớm gặp 100% trường hợp [13] Hội chứng nhiễm độc thần kinh tác dụng độc tố thần kinh có nọc rắn hổ mang gây liệt dây thần kinh sọ não, liệt hô hấp [13], [28], [122] 1.3 Một số kỹ thuật miễn dịch phát nọc rắn kháng thể kháng nọc rắn Do thành phần nọc rắn độc đa phần độc tố có chất protein [1], [2], [14], [16] Trong đa số có tính kháng nguyên cao [42], [49] nên xét nghiệm phát nọc rắn độc thường dùng xét nghiệm miễn dịch [95] Dưới số kỹ thuật miễn dịch ứng dụng phát nọc rắn:  Điện di miễn dịch  Ngưng kết hồng cầu  Ngưng kết miễn dịch  Miễn dịch phóng xạ  Miễn dịch huỳnh quang  Miễn dịch quang  Miễn dịch gắn enzym (ELISA)  Kít phát nhanh: dựa nguyên lý ELISA, sắc ký miễn dịch 1.4 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 1.4.1 Lịch sử hình thành phát triển Các nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch nghiên cứu khẳng định vào năm 1980 năm cuối thập kỷ [123] Trong 20 năm gần đây, với việc sử dụng hệ KT, đặc biệt ứng dụng công nghệ KT đơn dòng cải tiến nguyên liệu thành phần có việc sử dụng hạt nano kim loại thay hạt latex làm thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng-Au) , kỹ thuật sắc ký miễn dịch ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực 1.4.2 Nguyên lý hoạt động 1.4.3 Chế tạo tối ưu que thử - Thiết kế định dạng que thử: phụ thuộc vào mục đích phát kháng nguyên hay kháng thể, nguyên vật liệu sẵn có chất lượng nguyên vật liệu Que thử theo định dạng theo chế sandwich cạnh tranh [92], [123] - Lựa chọn vật liệu: + Chỉ thị màu (nhãn): có nhiều loại hạt nano hạt nano vàng, nano bạc, hạt từ, latex, phân tử huỳnh quang, enzym… sử dụng để làm thị màu nguyên lý sắc ký miễn dịch [19], [36], [70], [85], [113] + Màng: lựa chọn màng màng mao dẫn loại màng khác Các thông số lựa chọn bao gồm: kích thước lỗ, chất, độ dày, khả thấm, gắn không đặc hiệu, độ bền… [18], [84], [123] - Xử lý màng: việc lựa chọn hệ đệm thích hợp để xử lý màng tùy thuộc vào mục đích phát triển que thử Mỗi hệ đệm thích hợp cho mẫu bệnh phẩm khác [18], [84] - Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp: cần có bước tối ưu pH dung dịch đệm, nồng độ kháng thể thích hợp [8], [18], [84], [123] - Tối ưu hóa nồng độ kháng thể que thử: trường hợp cụ thể cần tối ưu nồng độ kháng thể để phản ứng xảy tốt lại tiết kiệm nguồn nguyên liệu [18], [123] 1.5 Kháng thể kháng nọc rắn Kháng thể kháng nọc rắn (KTKNR) có máu động vật miễn dịch ngựa, thỏ trứng gia cầm… tinh chế qua nhiều công đoạn [5], [10], [29], [39], [40] Các KTKNR dễ dàng gắn vào phân tử khác enzyme, chất đánh dấu biotin, chất huỳnh quang, hạt nano… mà hoạt tính không bị thay đổi sau gắn đồng thời giữ sau thời gian dài bảo quản Do đặc điểm KTKNR ứng dụng nhiều chế tạo kít chẩn đoán điều trị bệnh nhân rắn cắn [5], [29], [39], [60], [74], [120] CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1.1 Nghiên cứu chế tạo tách chiết kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra Thỏ đực 12 cân nặng từ 2-2,5 kg chia làm lô; gà mái chuẩn bị đẻ trứng 12 cân nặng từ 1,5-2 kg chia làm lô; chuột nhắt trắng 56 cân nặng 20 ± 02 g/con tất khỏe mạnh Huyết ngựa trước sau gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra Đài loan cung cấp theo Đề tài Nghị định thư Việt nam Đài loan 2.1.1.2 Nghiên cứu đánh giá hiệu phát nọc rắn hổ mang Naja atra lâm sàng Mẫu bệnh phẩm thu thập sau bệnh nhân nhập viện sau điều trị HTKNR đặc hiệu Thời gian thu thập: từ tháng đến tháng 12 năm 2014 Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai Trong số mẫu bệnh phẩm thu thập được, tiến hành lựa chọn mẫu bệnh phẩm bệnh nhân chẩn đoán rắn hổ mang cắn 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu - Nọc tổng số rắn hổ mang N.atra; Nọc tổng số loài rắn độc khác (Hổ đất, Lục xanh, Chàm quạp Hổ chúa) - Tá chất Freund hoàn chỉnh Freund không hoàn chỉnh; kháng thể kháng IgG thỏ, kháng thể kháng IgY gà kháng thể kháng IgG ngựa gắn enzyme peroxidase; chất OPD hãng Sigma, Thermo - Các loại màng sử dụng kít: Màng hút mẫu (Sample pad); Màng chứa kháng thể cộng hợp (Conjugate pad); Màng mao dẫn (Nitrocellulose membrance); Màng hút (Absorbent pad) hãng Ahlstrom, Whatman - Bộ kít ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y nghiên cứu chế tạo - Các hoá chất vật tư tiêu hao khác dùng cho gây miễn dịch, phản ứng ELISA tối ưu hóa xét nghiệm nhanh - Hệ thống sắc ký, điện di, đo mật độ quang, hệ thống đo quang phổ khả kiến hệ thống sản xuất que thử nhanh 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thu thập kiểm định chất lượng nọc rắn 2.2.2 Chuẩn bị kháng nguyên gây miễn dịch 2.2.3 Phát kháng thể kháng nọc rắn huyết 2.2.4 Tách chiết tinh kháng thể 2.2.5 Kiểm tra độ đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên nọc rắn 2.2.6 Hấp phụ miễn dịch 2.2.7 Thử nghiệm lựa chọn cặp kháng thể 2.2.8 Tối ưu hóa phản ứng cộng hợp 2.2.9 Tối ưu hóa xét nghiệm nhanh 2.2.10 Xác định thông số kỹ thuật xét nghiệm 2.2.11 Thử nghiệm kít phát nhanh nọc rắn mẫu bệnh phẩm - Để kiểm tra giới hạn phát kít lâm sàng tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên định lượng nọc rắn huyết 35 bệnh nhân lúc nhập viện sau điều trị HTKNR Bộ kít ELISA định lượng 11 3.1.4 Phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn với kháng nguyên nọc rắn loài khác - Có phản ứng chéo kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn với nọc rắn loài khác Mức độc phản ứng chéo kháng thể kháng nọc rắn với nọc rắn loài rắn họ cao so với loài rắn khác họ 3.2 Kết tách chiết tinh kháng thể IgG IgY từ huyết trứng gà 3.2.1 Sắc ký đồ tinh kháng thể - Sắc ký đồ tinh kháng thể IgG thỏ IgG ngựa: có đỉnh protein, đỉnh protein không bám vào cột, đỉnh IgG có huyết thỏ ngựa Sắc ký đồ tinh kháng thể IgY: có đỉnh protein, đỉnh protein không bám vào cột, đỉnh IgY có trứng gà 3.2.2 Kết điện di kháng thể IgG IgY sau tách chiết tinh - Kết điện di cho thấy, kháng thể sau tách chiết tinh có độ tinh cao 3.2.3 Hoạt tính kháng thể IgG IgY sau tách chiết tinh 0,8 KT ngựa 0,7 KT thỏ KT gà OD 450 nm 0,6 KT ngựa thường 0,5 KT thỏ thường 0,4 KT gà thường 0,3 0,2 0,1 16 32 64 128 256 512 Blank Độ pha loãng KT x 1000 Biểu đồ 3.6 Hoạt tính kháng thể sau tinh 12 - Sau tinh hoạt tính kháng thể có hoạt tính mạnh với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra 3.3 Phản ứng đặc hiệu phản ứng chéo kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra, hổ đất hổ chúa 3.3.1 Kiểm tra phản ứng đặc hiệu phản ứng chéo kháng thể kỹ thuật Western blot kDa M N atra N k O h (100 mg) 188 98 kDa M N atra N k O h (100 mg) 62 N atra N k O h (100 mg) 49 49 38 38 28 M 62 62 49 38 kDa 188 98 188 98 28 28 17 17 17 14 14 14 6 3 (M: thang protein chuẩn, 1: kháng thể IgG thỏ, 2: kháng thể IgG ngựa, 3: kháng thể IgY gà) Hình 3.3 Kiểm tra phản ứng đặc hiệu phản ứng chéo kháng thể kỹ thuật Western blot - Kháng thể IgG thỏ phản ứng mạnh với kháng nguyên < kDa, kháng thể IgY gà phản ứng mạnh với kháng nguyên > 188 kDa < kDa Trong đó, kháng thể IgG ngựa phản ứng với hầu hết kháng nguyên nọc rắn Có phản ứng chéo kháng thể với nọc rắn hổ đất hổ chúa 3.3.2 Hoạt tính phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Naja atra sau hấp phụ miễn dịch - Sau hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ đất, hoạt tính kháng thể bị giảm mạnh Trong đó, sau hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ chúa, hoạt tính kháng thể cao 13 - Hầu hết kháng thể đặc hiệu với nọc rắn hổ mang N.atra bị hấp phụ nọc rắn hổ đất Trong đó, sau hấp phụ với nọc rắn hổ chúa, kháng thể lại phản ứng mạnh với kháng nguyên đặc biệt kháng nguyên < kD, > 188 kDa, 14 49 – 62 kDa 3.4 Kết lựa chọn cặp kháng thể 3.4.1 Kết lựa chọn cặp kháng thể phương pháp ELISA - Kết thử nghiệm ELISA cho thấy, sau hấp phụ với nọc rắn hổ chúa, cặp kháng thể IgG thỏ – IgG ngựa có khả phát hầu hết nồng độ nọc rắn hổ mang N.atra thử nghiệm, có ngưỡng phát ng/ml Cặp kháng thể IgG ngựa – IgG thỏ cặp kháng thể IgY gà – IgG ngựa có ngưỡng phát ng/ml 3.4.2 Kết lựa chọn cặp kháng thể phương pháp nhúng trực tiếp - Kết thử nghiệm phương pháp nhúng trực tiếp cho thấy, sử dụng kháng thể IgG từ thỏ gắn hạt nano vàng kháng thể IgG từ ngựa nhỏ lên vạch test cho tín hiệu dương tính rõ 3.5 Kết cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 3.5.1 Tối ưu hóa nồng độ kháng thể pH dung dịch hạt nano vàng - Khi thay đổi nồng độ kháng thể sử dụng cộng hợp từ 0,5 đến 4µg/250µl hạt nano vàng, nồng độ kháng thể tối ưu 1,5 – 2µg (6 – 8µg cho ml hạt nano vàng) - Ở pH = phản ứng cộng hợp kháng thể hạt nano vàng ổn định nhất, pH thấp – hạt vàng có xu hướng vón vào tạo 14 thành nhiều hạt có kích thước lớn (dung dịch có màu xanh tím) Khi cho BSA vào dung dịch cộng hợp, phức hợp có độ ổn định cao 3.5.2 Kết cộng hợp hoạt tính kháng thể sau cộng hợp với hạt nano vàng - Biểu đồ phổ hấp phụ cho thấy, dung dịch vàng độc lập có đỉnh hấp phụ bước sóng 540nm Cũng bước sóng này, phức hợp kháng thể hạt nano vàng có đỉnh hấp phụ thấp hơn rộng so với dung dịch vàng độc lập - Kết dot-blot cho thấy, kháng thể sau cộng hợp với hạt nano vàng hoạt tính kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra 3.6 Kết tối ưu xét nghiệm phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra 3.6.1 Hệ đệm - Màng xử lý đệm tris cho thời gian giải phóng nhanh nhất, màng xử lý đệm tetraborat với PVP cho thời gian giải phóng chậm (1: đệm tris, 2: đệm phosphate; 3: đệm tetraborat với PVP) Hình 3.10 Kết thử nghiệm lựa chọn hệ đệm - Cả hệ đệm cho kết dương tính Tuy nhiên, hệ đệm cho kết tốt nhất, tín hiệu màu sắc vạch phát rõ so với hai trường hợp lại 15 3.6.2 Nồng độ kháng thể vạch phát Hình 3.11 Lựa chọn nồng độ kháng thể vạch phát - Ở nồng độ kháng thể 1,5 mg/ml tín hiệu màu sắc vạch phát rõ so với nồng độ mg/ml Khi tăng nồng độ kháng thể lên mg/ml, tín hiệu màu sắc thay đổi rõ rệt 3.6.3 Nồng độ kháng thể vạch chứng Hình 3.12 Lựa chọn nồng độ kháng thể vạch chứng - Ở nồng độ kháng thể 1mg/ml tín hiệu màu sắc vạch chứng rõ so với nồng độ 0,5 mg/ml Khi tăng nồng độ kháng thể lên 1,5 mg/ml, tín hiệu màu sắc thay đổi rõ rệt 3.6.4 Nồng độ kháng thể cộng hợp Hình 3.13 Lựa chọn nồng độ kháng thể cộng hợp vàng tối ưu - Tín hiệu màu sắc hai vạch (chứng, phát hiện) tỷ lệ thuận với nồng độ kháng thể cộng hợp quy thử Ở độ pha loãng lần dung 16 dịch cộng hợp (tương đương OD =10) tín hiệu màu sắc hai vạch rõ nhất, độ pha loãng 20 lần tín hiệu màu sắc mờ nhạt khó quan sát 3.7 Kết xác định thông số kỹ thuật xét nghiệm phát nhanh 3.7.1 Giới hạn phát Hình 3.14 Thử nghiệm khả phát nọc rắn nồng độ khác kít xét nghiệm - Với mẫu nọc rắn chuẩn pha dung dịch đệm kít xét nghiệm có giới hạn phát ng/ml - Bộ xét nghiệm tượng dương tính giả Có mẫu âm tính giả (nồng độ ng/ml pha huyết nước tiểu) 3.7.2 Phản ứng chéo - Bộ xét nghiệm có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất nồng độ 20 ng/ml, phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh chàm quạp nồng độ thử nghiệm 3.8 Đánh giá khả phát nọc rắn hổ mang kít lâm sàng 3.8.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu - Có đến 50% số bệnh nhân có thời gian nhập viện từ đến 13,75 giờ, số nhập viện sau bị rắn cắn trung bình 9.8 Nhập viện muộn 120 (5 ngày) - Trong số 113 bệnh nhân lựa chọn lấy mẫu nghiên cứu, có 40 bệnh nhân chẩn đoán rắn hổ mang N.atra cắn, bệnh nhân 17 chẩn đoán rắn hổ mang N.kaouthia cắn Còn lại 68 bệnh nhân chẩn đoán rắn hổ mang cắn không rõ loài 3.8.2 Kết định lượng phát nọc rắn hổ mang lâm sàng - Kết định lượng nọc rắn huyết 35 bệnh nhân lúc nhập viện cho thấy nồng độ nọc rắn có dải nồng độ từ 2,81 – 159,12 ng/ml; 50% số trường hợp có nồng độ nọc rắn nằm khoảng từ 8,21 – 58,28 ng/ml - Tỷ lệ xét nghiệm dương tính mẫu huyết 69,3%; dịch vết cắn 89,2% nước tiểu 60% Trong đó, tỷ lệ xét nghiệm dương tính mẫu huyết thanh, dịch vết cắn nước tiểu đầu 67,85%; 95,83% 53,33% - Khi so sánh với kết xét nghiệm kít với kết xét nghiệm VDK Đài loan mẫu bệnh phẩm huyết thanh, hai xét nghiệm cho kết với độ phù hợp (KAPPA = 0,78) - Khi so sánh với kết xét nghiệm kít với kết xét nghiệm VDK Đài loan mẫu bệnh phẩm dịch vết cắn, hai xét nghiệm cho kết với độ phù hợp cao (KAPPA = 0,84) - Khi so sánh với kết xét nghiệm kít với kết xét nghiệm VDK Đài loan mẫu bệnh phẩm huyết thanh, hai xét nghiệm cho kết với độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,41) - Số trường hợp dương tính có định sử dụng HTKNR 75/79 (94,93%), số trường hợp âm tính có định HTKNR 15/34 (44,12%) Kết xét nghiệm kít với định sử dụng HTKNR có độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,56) - Khi so sánh với kết xét nghiệm ELISA 70 mẫu huyết trước sau điều trị, kít có khả phát nọc rắn hổ mang tốt với độ phù hợp (KAPPA = 0,71) 18 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra từ thỏ gà Kết lựa chọn liều kháng nguyên, cách thức gây miễn dịch cho thấy lô thỏ gà gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn liều khác tạo kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn với hiệu giá cao Kết nghiên cứu cho thấy, có tượng phản ứng chéo huyết kháng nọc rắn với nọc loài rắn thường gặp khác Cụ thể phản ứng chéo kháng thể với nọc rắn hổ đất hổ chúa mạnh so với nọc rắn chàm quạp lục xanh Kết phù hợp với nghiên cứu Đỗ Khắc Đại (2013) Lê Văn Đông (2003) [5], [42] Để tinh kháng thể IgG IgY kháng nọc rắn, sử dụng phối hợp nhiều kỹ thuật tinh như: kỹ thuật tủa, kỹ thuật sắc ký lọc gel, kỹ thuật sắc ký lực, kỹ thuật sắc ký miễn dịch [5], [6], [20], [22], [61] Kiểm tra độ tinh điện di, kết cho thấy, với phương pháp tách chiết tinh kháng thể (IgG, IgY) mà áp dụng có hiệu suất tốt, thu kháng thể có độ tinh hoạt tính cao với kháng nguyên nọc rắn Với hoạt tính vậy, kháng thể đủ điều kiện để thử nghiệm chế tạo kít 4.2 Lựa chọn nguồn kháng thể cho tối ưu kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra Kết western blot cho thấy, độ đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn hổ mang N.atra có khác kháng thể, khác khác biệt loài khả tạo đáp ứng miễn dịch Kết phù hợp với nghiên cứu Brunda cộng 19 (2006) [29] Sự khác biệt có ý nghĩa quan trọng giúp lựa chọn cặp kháng thể để chế tạo kít phát nhanh nọc rắn, kít dựa chế sandwich Khi tiến hành hấp phụ miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ đất, có nhiều thành phần giống nọc độc nên hầu hết kháng thể bị hấp phụ, kiểm tra hoạt tính kháng thể kiểm tra ELISA thấp Trong đó, hấp phụ với kháng nguyên nọc rắn hổ chúa, hoạt tính kháng thể với nọc rắn hổ mang N.atra cao Dựa vào kết thấy, để chế tạo que thử nhanh phát nọc rắn hổ mang N.atra có độ nhạy cao, nên hấp phụ miễn dịch nọc rắn hổ chúa Sau hấp phụ với nọc rắn hổ chúa, thử nghiệm ELISA trực tiếp que thử cho thấy, phản ứng cho tín hiệu tốt ghép cặp hai kháng thể từ thỏ ngựa 4.3 Tối ưu hóa kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra Công đoạn tối ưu hóa kít phát nhanh dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch lựa chọn nguyên vật liệu Việc lựa chọn tùy thuộc vào tính sẵn có, mục đích xét nghiệm Đối với màng hút mẫu, với yêu cầu chứa lượng mẫu thử từ 80 – 90 µl tốc độ dẫn mẫu chậm nên lựa chọn màng Ahlstrom prefilter 142 Đối với màng chứa kháng thể cộng hợp, đưa yêu cầu lựa chọn loại màng chứa thể tích kháng thể cộng hợp tối đa từ – µl/cm2 Chúng thấy màng Ahlstrom 6613 đáp ứng yêu cầu Cuối lựa chọn màng mao dẫn, để tạo thuận lợi cho dòng chảy chất lỏng màng cần có kích thước lỗ > µm, lựa chọn màng Whatman AE98 Trong công đoạn quy trình tối ưu que thử nhanh, gắn kháng thể với hạt nano vàng quan trọng Việc tối ưu hóa nồng độ kháng thể cộng hợp hạt nano vàng giúp cho lượng kháng thể dư 20 dung dịch mức tối thiểu Ngoài ra, pH dung dịch hạt nano vàng định đến phản ứng cộng hợp Ở thí nghiệm này, lựa chọn gắn pH = kết hợp với ủ lắc cho kết gắn tốt Kết cộng hợp kiểm tra máy đo quang phổ khả kiến, phức hợp kháng thể - hạt nano vàng có độ hấp phụ thấp so với hạt vàng độc lập nhiên đỉnh hấp phụ lại thay đổi, điều đồng nghĩa với việc kháng thể gắn lên bề mặt hạt nano vàng hạt nano vàng không bị kết tập với Cuối cùng, để kiểm tra hoạt tính kháng thể sau cộng hợp với hạt nano vàng, sử dụng kỹ thuật dot-blot, kết thử nghiệm cho thấy sau liên kết với hạt nano vàng kháng thể có hoạt tính với nọc rắn hổ mang N.atra, điều khẳng định phức hợp kháng thể hạt nano vàng sử dụng để tối ưu công đoạn Ở công đoạn tiếp theo, sau lựa chọn màng chứa kháng thể cộng hợp, để màng giải phóng gần hoàn toàn lượng kháng thể chứa cách từ từ màng cần ngâm vào dung dịch đệm phù hợp Qua thử nghiệm lựa chọn hệ đệm tetraborat với PVP cho thời gian giải phóng kháng thể cộng hợp 115 giây, hệ đệm cho tín hiệu màu sắc rõ hai vạch (T C) Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu [8], [18], [59] Để lựa chọn nồng độ kháng thể, áp dụng nguyên tắc “sử dụng hàm lượng tối thiểu kháng thể để tạo kít có tính tối ưu” Kết tối ưu cho thấy, kháng thể vạch phát nồng độ kháng thể thấp cho tín hiệu tốt 1,5 mg/ml Đối với kháng thể vạch chứng nồng độ kháng thể thấp cho tín hiệu tốt 1mg/ml Với dung dịch cộng hợp, điều chỉnh OD = 10, OD thấp cho tín hiệu màu sắc tốt không xảy phản ứng không đặc hiệu 21 4.4 Thử nghiệm kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra in vitro Đối với thông số kỹ thuật kít sau tối ưu, thử nghiệm cho thấy kít có giới hạn phát ng/ml (pha đệm), mẫu nọc rắn pha huyết nước tiểu kít có giới hạn phát 10 ng/ml Bộ kít có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất nồng độ 20 ng/ml Phản ứng chéo xảy có giống thành phần nọc độc hai loài, giống thực tế lâm sàng chứng minh, bệnh nhân bị rắn hổ mang N.atra rắn hổ đất N.kaouthia cắn có triệu chứng tương tự [4], [13] Nghiên cứu chất độc có nọc rắn hai loài cho nhận xét tương tự [1], [2], [14], [17] 4.5 Đánh giá khả phát nọc rắn hổ mang lâm sàng Trong số bệnh nhân lựa chọn lấy mẫu, có đến 50% số bệnh nhân có thời gian nhập viện từ đến 13,75 giờ, số nhập viện sau bị rắn cắn trung bình 9,8 Trong 45 trường hợp bắt rắn, có đến 40 bệnh nhân mang rắn hổ mang N.atra (chiếm 89%) có bệnh nhân mang rắn hổ mang N.kaouthia Với tỷ lệ 89%, rắn hổ mang N.atra thủ phạm gây phần lớn vết cắn Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu số liệu thống kê trước [3], [13], [14] Cũng số bệnh nhân này, có nhiều bệnh nhân nhập viện 24 đầu, điều có nghĩa mẫu xét nghiệm thu thập sớm, có ý nghĩa thử nghiệm xét nghiệm, phù hợp với khuyến cáo tác giả Hung D.Z tỷ lệ xét nghiệm dương tính với nọc rắn cao 24 đầu [59] Kết định lượng cho thấy nồng độ nọc rắn có dải nồng độ từ 2,81 – 159,12 ng/ml Với dải nồng độ trên, mẫu bệnh phẩm phù hợp để đánh giá khả phát nọc rắn kít phát nhanh Khi sử dụng kít phát nhanh nọc rắn mẫu bệnh phẩm lâm sàng, kít cho kết xét nghiệm dương tính 22 mẫu huyết 69,9%, dịch vết cắn 89,2% nước tiểu 60% Trong đó, tỷ lệ xét nghiệm dương tính đặc biệt cao đầu Đối với dịch vết cắn, tỷ lệ dương tính cao điều dễ hiểu nồng độ nọc độc cao máu, nhiều trường hợp vết cắn không sâu vết xước nhẹ đa số bệnh nhân thường garô trước đến viện Theo Đỗ Khắc Đại (2013), chẩn đoán xác định loài rắn lâm sàng hầu hết tiêu chuẩn vàng Do xác định độ nhạy độ đặc hiệu kít xét nghiệm [5] Sử dụng hệ số KAPPA để đánh giá độ phù hợp chẩn đoán phương pháp chẩn đoán, với định sử dụng HTKNR phương pháp khoa học để đánh giá hiệu phát nọc rắn kít chế tạo So sánh kết thử nghiệm mẫu bệnh phẩm với kết xét nghiệm sử dụng kít VDK Đài loan cho thấy kít có độ phù hợp cao thử với dịch vết cắn (KAPPA = 0,84) Khi thử với huyết nước tiểu, kết có độ phù hợp vừa với hệ số KAPPA 0,78 0,41 Kết so sánh có khác biệt cặp kháng thể sử dụng khác nhau, có hay không việc sử dụng phương pháp hấp phụ miễn dịch thời điểm thử nghiệm hai xét nghiệm Với trường hợp có định sử dụng HTKNR, nhận thấy kết xét nghiệm dương tính chiếm 94,93% (75/79 trường hợp), số trường hợp âm tính có định sử dụng HTKNR 15/34 (44,12%) Giải thích cho trường hợp có định sử dụng HTKNR kết xét nghiệm âm tính trường hợp nhập viện muộn nên nồng độ nọc rắn huyết giảm xuống mức thấp khó phát Độ phù hợp so với kết xét nghiệm ELISA chưa cao chủ yếu xét nghiệm ELISA mà sử dụng xét nghiệm định lượng có giới hạn phát 0,1ng/ml 23 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu thu phân tích nêu Đề tài rút kết luận sau: Đã chế tạo kít xét nghiệm phát nhanh nọc rắn hổ mang N.atra với thông số kỹ thuật sau: - Bộ kít xét nghiệm có khả phát nọc rắn chuẩn pha dung dịch đệm ng/ml, huyết nước tiểu 10 ng/ml - Bộ kít phản ứng chéo với nọc rắn hổ chúa, lục xanh chàm quạp Có phản ứng chéo với nọc rắn hổ đất nồng độ 20 ng/ml Qua phân tích 148 mẫu huyết thanh, 20 mẫu nước tiểu, 37 mẫu dịch vết cắn 113 bệnh nhân chẩn đoán rắn hổ mang cắn điều trị Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hiệu phát nọc rắn hổ mang bệnh phẩm lâm sàng sau: - Tỷ lệ xét nghiệm dương tính mẫu huyết 69,9%; dịch vết cắn 89,2% nước tiểu 60% - Khi so sánh với kết xét nghiệm VDK Đài loan mẫu bệnh phẩm dịch vết cắn, huyết nước tiểu kít có độ phù hợp chẩn đoán với hệ số KAPPA 0,84; 0,78 0,41 Kết xét nghiệm kít với định sử dụng HTKNR có độ phù hợp vừa (KAPPA = 0,56), so với kết xét nghiệm ELISA kít có khả phát nọc rắn hổ mang tốt với độ phù hợp (KAPPA = 0,71) 24 KIẾN NGHỊ Tiếp tục theo dõi độ ổn định kít xét nghiệm thời gian lâu Cho phép ứng dụng kít chẩn đoán rắn hổ mang Naja atra sở cấp cứu điều trị rắn độc cắn, giúp sớm đưa định dùng HTKNR Cần có nghiên cứu sử dụng kít theo dõi kết điều trị để sớm đưa định dừng HTKNR Các kết nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu chế tạo kít chẩn đoán rắn độc cắn khác Nếu có điều kiện kinh phí hỗ trợ, cần tiến hành thêm số thử nghiệm sau: + Mở rộng phương pháp tối ưu để tăng độ nhạy cách lựa chọn quy trình tinh kháng thể, chất đánh dấu hệ đệm khác + Thử nghiệm phản ứng chéo với nọc độc loài rắn độc thường gặp khác + So sánh độ phù hợp chẩn đoán với kít VDK Đài loan thời điểm lấy mẫu DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN Nguyễn Ngọc Tuấn, Trịnh Thanh Hùng, Đặng Hồng Thanh, Nguyễn Đặng Dũng (2016), “Nghiên cứu chế tạo tinh kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra”, Tạp chí Y - Dược học Quân sự, (1), tr 77-84 Nguyễn Ngọc Tuấn, Trịnh Thanh Hùng, Nguyễn Trung Nguyên, Nguyễn Đặng Dũng (2016), “Nghiên cứu lựa chọn cặp kháng thể sử dụng cho chế tạo xét nghiệm sắc ký miễn dịch phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra”, Tạp chí Y - Dược học Quân sự, (2), tr 35-43 ... rắn hổ mang Naja atra kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm hai mục tiêu: Chế tạo kít phát nhanh nọc rắn hổ mang Naja atra theo nguyên lý sắc ký miễn dịch Đánh giá khả phát nọc rắn Naja atra xét nghiệm... lý sắc ký miễn dịch để phát triển xét nghiệm nhanh phát nọc rắn hổ mang có thành công định [59] Từ sở lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài Nghiên cứu chế tạo kít phát nhanh nọc rắn hổ mang. .. đóng góp luận án: Trong nghiên cứu này, lần Việt nam phát triển thành công kít phát nhanh nọc rắn hổ mang kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch Bộ kít có khả phát nọc rắn chuẩn pha dung dịch đệm ng/ml, huyết