Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 357-362 Nghiên cứu bước đầu chế tạo Kit phát nhanh E.coli nước thải sinh hoạt Nguyễn Thị Tâm Thư1, Trần Thị Thanh Quỳnh1, Trần Thị Huyền Nga2*, Nguyễn Tuấn Anh2, Phạm Kiên Cường1 Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học Công nghệ Quân sự, Số 17 Hồng Sâm, Cầu Giấy, Hà Nội Khoa Mơi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 15 tháng năm 2016 Chỉnh sửa ngày 20 tháng năm 2016; Chấp nhận đăng ngày 06 tháng năm 2016 Tóm tắt: E coli xem vi khuẩn thị cho ô nhiễm vi sinh vật nước thực phẩm Đã có nhiều phương pháp phát E coli nước thực phẩm hầu hết phương pháp cần thiết bị đắt tiền, cần thực phịng thí nghiệm Do đó, việc tìm công cụ để phát nhanh E coli nước thực phẩm cần thiết Cơng trình nghiên cứu môi trường tăng sinh cho vi khuẩn E coli đảm bảo đạt tới giới hạn phát que thử từ nồng độ ban đầu 20 CFU/ml Que thử tạo có độ đặc hiệu đạt 90% ngưỡng phát 106 CFU/ml Kết sở để chế tạo kit phát nhanh E coli nguồn nước sinh hoạt điều kiện trường Bộ kit dễ dàng sử dụng cho người dân đội gặp điều kiện bất lợi sóng, gió, thủy triều hay lũ lụt Từ khóa: Nước sinh hoạt, ô nhiễm, Kit, Que thử, E coli Mở đầu* E coli vi khuẩn đứng hàng đầu nguyên gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, viêm màng não viêm phổi (đặc biệt trẻ em sinh) E coli tiêu môi trường cần giám sát tất loại nước, từ nước mặt, nước ngầm, nước ăn uống hay nước thải Khi phát nguồn nước bị nhiễm E coli chứng tỏ nguồn nước bị nhiễm phân bị nhiễm nhiều vi sinh vật khác; mơi trường bị nhiễm nguồn nước cần xử lý [2] Hiện nay, việc phát vi khuẩn gây bệnh đường ruột E coli trường cấp thiết, đặc biệt vùng biển đảo, vùng bị lũ lụt Các phương pháp phát vi khuẩn gây bệnh đường ruột sử dụng Vi khuẩn gây bệnh đường ruột E coli có mặt nhiều nước, thực phẩm, sống điều kiện biển đảo (nhiệt độ cao, độ mặn lớn) Các vi khuẩn thường có mặt phân nên dễ gây nhiễm nguồn nước dự trữ vùng biển đảo điều kiện sóng, gió thủy triều E coli tổ chức y tế giới WHO công nhận vi khuẩn thị cho ô nhiễm vi sinh vật nước Do đó, vi khuẩn sử dụng làm đối tượng phát ô nhiễm vi sinh vật nước sinh hoạt [1] _ * Tác giả liên hệ ĐT.: 84-983077505 Email: tranthihuyennga@hus.edu.vn 357 358 N.T.T Thư nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 357-362 đếm khuẩn lạc, MPN hay PCR thường phải thực phịng thí nghiệm cần trang thiết bị đắt tiền, người thực phải có chun mơn sâu Các phương pháp khơng thể thực ngồi trường, đồng thời thời gian thực lâu (từ PCR hay 24 – 48 việc đếm khuẩn lạc, MPN) [37] Do đó, việc phát nhanh thực điều kiện trường phục vụ cho đội cơng tác ngồi biển đảo, người dân vùng lũ cần thiết Cho đến nay, mơ phương pháp phát nhanh, xác vi sinh vật điều kiện trường sử dụng dạng que thử dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch [8] Tuy nhiên, để tạo que thử sắc ký miễn dịch có độ nhạy độ xác cao, cần nghiên cứu kỹ yếu tố liên quan sử dụng loại kháng thể, nồng độ kháng thể, điều kiện phun kháng thể lên que thử Mặt khác, mẫu nước sinh hoạt, nồng độ E coli cho phép 20 CFU/100 ml [2], giới hạn phát que thử Do đó, việc tìm mơi trường tăng sinh tế bào điều kiện biển đảo để tăng số lượng vi sinh vật đến 105 – 106 CFU/ml (giới hạn phát vi sinh vật que thử dạng sắc ký miễn dịch) thời gian từ – cần thiết Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu - Mẫu phân nước nhiễm E.coli 2.2 Phương pháp nghiên cứu Phân lập vi khuẩn E coli Các vi khuẩn E coli phân lập từ mẫu phân mẫu nước nghi nhiễm phân môi trường thạch Endo [9] cách pha lỗng mẫu theo dãy thập phân Các khuẩn lạc có màu đỏ có ánh kim mơi trường thạch Endo vi khuẩn E coli Để xác định xác chủng vi khuẩn E coli cần định danh chủng vi khuẩn theo phương pháp giải trình tự 16S rRNA Định danh vi khuẩn E coli Các chủng vi khuẩn E coli phân lập định danh theo phương pháp giải trình tự 16S rRNA Trước hết, lấy khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập để tách DNA theo kit DNA tổng số vi khuẩn điện di kiểm tra gel agarose 1% Các mẫu có băng DNA sử dụng làm khn để nhân đoạn gen 16S rRNA phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi 27F/1492R [3, 6] Kết nhân đoạn gen 16S rRNA kiểm tra điện di gel agarose 1% Các mẫu có băng với kích thước phù hợp gửi để giải trình tự Trình tự 16S rRNA vi khuẩn so sánh ngân hàng gen quốc tế NCBI Các chủng có trình tự 16S rRNA tương đồng 99% với chủng E coli lựa chọn cho nghiên cứu Xác định môi trường tăng sinh phù hợp cho vi khuẩn E coli Chủng vi khuẩn E coli từ khuẩn lạc hòa vào nước muối sinh lý tạo nồng độ ban đầu Sau pha lỗng theo dãy thập phân đến nồng độ 10-8 Từ nồng độ pha loãng, lấy 100 µl dung dịch gốc để gạt đĩa xác định số lượng vi khuẩn mẫu ban đầu Cũng từ nồng độ này, lấy ml dung dịch pha lỗng vào 100 ml mơi trường ni cấy (bao gồm môi trường LB, LST, canh thang thường lục sáng) Sau ủ 37oC khoảng thời gian khác 4, 6, giờ, lấy từ nồng độ môi trường tương ứng 100 µl để gạt đĩa, xác định số lượng khuẩn lạc Mơi trường có độ tăng số lượng vi khuẩn E coli cao đạt nồng độ 104 – 106 tế bào từ nồng độ ban đầu thấp lựa chọn làm môi trường tăng sinh kit phát nhanh vi khuẩn E coli điều kiện trường Đánh giá phản ứng kháng nguyên kháng thể để lựa chọn kháng thể phù hợp Phản ứng kháng nguyên kháng thể đánh giá dựa phương pháp ELISA Kết phản ứng dựa việc đo độ màu phản ứng N.T.T Thư nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 357-362 Phun kháng thể lên màng Kháng thể phun lên màng máy in phun Limonas5 Điều kiện in phun cần độ ẩm < 50%, nhiệt độ < 30oC Chế độ in phun tốc độ dòng 20 ml/s, µl/40mm, nồng độ kháng thể mg/ml [7] Mỗi màng nitrocellulose phun lên vạch tương ứng với kháng thể vạch C (kháng thể đối chứng để nhận biết que thử có giá trị sử dụng hay không), kháng thể vạch T tương ứng với kháng thể bắt cặp với kháng nguyên E coli, để nhận biết mẫu thử có E coli hay khơng Sau phun kháng thể lên màng, màng để khô điều kiện phòng (độ ẩm 35 – 50%, nhiệt độ 28 – 29oC) qua đêm Sau màng cố định dung dịch BSA (huyết bò) 1% PBS (dung dịch đệm photphat) 10 phút Rửa lại dung dịch rửa chứa 0,01% SDS Để khô nhiệt độ phòng qua đêm sử dụng để thử phản ứng Đối với kháng thể cộng hợp vàng, vàng gắn với kháng thể bắt giữ nồng độ 20 OD sau nhúng trực tiếp màng cộng hợp cố định vào Sau đó, để khơ màng điều kiện phòng qua đêm, cắt nhỏ màng gắn liên kết với màng nitrocellulose màng hút mẫu tạo que thử Đánh giá độ đặc hiệu ngưỡng phát que thử Độ đặc hiệu que thử đánh giá thông qua phản ứng với tế bào số loại vi khuẩn khác Klebsiella, Listeria, V a 359 cholerae, Bacillus xem có phản ứng khơng Nếu có phản ứng với chủng tức có phản ứng chéo, độ đặc hiệu Nếu khơng có phản ứng, độ đặc hiệu cao Số que sử dụng cho phản ứng loại vi khuẩn 10 que (thí nghiệm tiến hành với loại vi khuẩn khác nhau) Độ đặc hiệu tính tỷ lệ số que khơng có phản ứng chéo với tổng số que thử nghiệm [8] Ngưỡng phát que thử đánh giá thông qua nồng độ vi khuẩn thấp cho phản ứng dương tính Mẫu vi khuẩn E coli pha lỗng nồng độ khác theo dãy thập phân, sau dùng que thử nhúng vào nồng độ vi khuẩn biết số lượng (CFU/ml) Nồng độ thấp vi khuẩn cho phản ứng dương tính với độ lặp lại tốt gọi giới hạn phát hay ngưỡng phát que thử [8] Kết thảo luận 3.1 Phân lập vi khuẩn E coli Từ mẫu phân mẫu nước nghi nhiễm phân, chủng vi khuẩn nghi ngờ E coli phân lập Các chủng có đặc điểm có màu hồng đến đỏ, có ánh kim môi trường thạch Endo Các chủng lựa chọn, cấy riêng rẽ ống thạch sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm b Hình Hình thái khuẩn lạc số chủng E coli phân lập chủng chuẩn DH5α 360 N.T.T Thư nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 357-362 Hình Kết tách DNA tổng số (a) PCR số chủng E Coli (b) a Ghi chú: M 1kb: marker 1kb; C: mẫu đối chứng, E1: Chủng E1; E3: Chủng E3 3.2 Định danh vi khuẩn E coli Các mẫu có kết tách DNA dương tính sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gen 16S rRNA phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi 27F/1492R [3, 6] Các mẫu có kết dương tính (kích thước băng nhận khoảng 1500 bp, hình 2b) sử dụng để giải trình tự Trình tự chủng nhận được so sánh ngân hàng gen quốc tế NCBI Các chủng có trình tự tương đồng 99% với chủng E coli công bố lựa chọn Kết trình bày Hình cho thấy mẫu E1 E3 tách DNA tổng số nhân đoạn gen 16S rRNA Do đó, mẫu tiến hành giải trình tự thiết bị giải trình tự hệ Kết nhận cho thấy mẫu E1 E3 có trình tự tương đồng 99% với số chủng thuộc E Coli Do đó, mẫu sử dụng nguồn vi khuẩn E coli lây nhiễm từ phân cho nghiên cứu 3.3 Xác định môi trường tăng sinh phù hợp cho vi khuẩn E coli Lựa chọn chủng E coli phân lập (E3) chủng E coli chuẩn DH5α để ni cấy mơi trường khác nhằm tìm môi trường tăng sinh phù hợp sử dụng kit b Hình Kết tăng số lượng vi khuẩn E coli DH5α (a) chủng E3 (b) khoảng thời gian khác Kết trình bày Hình cho thấy chủng E coli chuẩn chủng phân lập từ phân, môi trường LST cho số lượng vi khuẩn tăng nhanh sau đạt ngưỡng phát que thử Do đó, mơi trường LST lựa chọn môi trường tăng sinh kit phát vi khuẩn E coli 3.4 Đánh giá phản ứng kháng nguyên kháng thể để lựa chọn kháng thể phù hợp Đối với que thử dạng sắc ký miễn dịch, cần sử dụng tới ba loại kháng thể bao gồm kháng thể vạch T, kháng thể vạch C kháng thể cộng hợp Kháng thể cộng hợp kháng thể phải bắt cặp với kháng nguyên cần phát E coli Sau đó, theo dịng chảy mẫu nước, kháng thể cộng hợp bắt giữ kháng nguyên lên vị trí vạch T Kháng thể vạch T gọi kháng thể phát Đây kháng thể bắt cặp với kháng nguyên vị trí epitop khác với kháng thể cộng hợp vàng [8] Do đó, kháng thể N.T.T Thư nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 357-362 giữ lại kháng thể cộng hợp bắt cặp với kháng nguyên tạo màu hồng vạch T (mẫu dương tính) Các kháng thể khơng bắt cặp với kháng nguyên không bị giữ lại vạch T tiếp tục theo dòng mẫu lên vạch C Tại đây, tất kháng thể cộng hợp vàng lại bị bắt giữ kháng thể cộng hợp vàng bắt cặp với kháng thể vạch C Do đó, vạch C ln có màu dù mẫu dương tính hay âm tính Để lựa chọn kháng thể phù hợp với kháng nguyên E coli kháng thể vạch T, vạch C, cần phải kiểm tra bắt cặp cặp kháng thể kháng nguyên phương pháp ELISA trước phun kháng thể lên màng [8] Từ kết ELISA lựa chọn kháng thể phun lên màng vạch C ab6789 (Abcam), kháng thể phun lên màng vạch T C01805M, kháng thể cộng hợp vàng C01806M (Meridian Life Science) 3.5 Phun kháng thể lên màng Sau lựa chọn cặp kháng thể vạch C, kháng thể cộng hợp vàng kháng thể vạch T, ta tiến hành phun kháng thể lên màng nitrocellulose Sau phun kháng thể lên màng, kháng thể cần cố định để bảo quản nhiều ngày Sau đó, ta cần thử lại phản ứng với kháng thể vạch T vạch C để tìm nồng độ kháng thể tối ưu cần phun lên màng Kết lựa chọn điều kiện tối ưu để phun kháng thể lên màng độ ẩm 45%, nhiệt độ 30oC, tốc độ phun 20 ml/s với nồng độ kháng thể mg/ml Bảng Ngưỡng phát que thử phát nhanh E coli Nồng độ vi khuẩn Số que thử nghiệm Số mẫu dương tính Tỷ lệ mẫu dương tính 103 104 105 106 107 5 5 0 5 0 40% 100% 100% 361 3.6 Đánh giá độ đặc hiệu ngưỡng phát que thử Đối với que thử phát E coli, độ đặc hiệu que cần thiết để khơng có kết dương tính giả với vi sinh vật khác V cholerae, Listeria, Klebsiella, Enterobacter Do đó, que thử cần đánh giá phản ứng với vi khuẩn Các dung dịch vi khuẩn với nồng độ khoảng 106 CFU/ml loại vi khuẩn dung dịch vàng cộng hợp OD chuẩn bị để nhúng que thử Mỗi loại vi khuẩn nhúng 10 que ghi lại số mẫu dương tính số mẫu thử Kết thu cho thấy số loại vi khuẩn sử dụng để đánh giá độ đặc hiệu, có que có dấu hiệu dương tính tổng số 40 que thử Do đó, độ đặc hiệu que thử (40-3)/40* 100 = 92,5% (đạt 90%) Đối với ngưỡng phát que thử, cần tìm giới hạn thấp mà phát E coli que thử Do đó, mẫu ban đầu biết nồng độ vi khuẩn pha loãng thành nồng độ khác theo dãy thập phân, sau sử dụng que thử nhúng vào nồng độ vi khuẩn (mỗi nồng độ que lặp lại) Kết trình bày Bảng cho thấy nồng độ 105 CFU/ml, phát vi khuẩn E coli tỷ lệ thấp (40%) nồng độ 106 CFU/ml cho số mẫu dương tính 100% Do đó, chọn nồng độ vi khuẩn 106 ngưỡng phát que thử vi khuẩn E coli Kết luận Đã tìm môi trường tăng sinh phù hợp để đưa vào kit phát nhanh E coli điều kiện trường, tăng số lượng vi khuẩn lên ngưỡng phát 106 CFU/ml Đã tạo que thử phát E coli có giới hạn phát 106 CFU/ml với độ đặc hiệu > 90% Đây sở để chế tạo thành công kit N.T.T Thư nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số 1S (2016) 357-362 362 phát vi sinh vật gây bệnh đường ruột điều kiện trường với thời gian phát khoảng [4] Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Sở Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh: “Nghiên cứu chế tạo kit phát nhanh số vi sinh vật gây bệnh đường ruột nguồn nước sinh hoạt, ứng dụng cho đội đóng quân đảo lực lượng tàu ngầm” CNĐT TS Nguyễn Thị Tâm Thư [5] Tài liệu tham khảo [7] [1] Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD), 2003 Assessing Microbial Safety of Drinking Water W.H.O ISBN 92-9409946-8 [2] Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia chất lượng nước mặt, nước ngầm, nước thải công nghiệp nước thải sinh hoạt, 2008 [3] A.K Bej, J.L DiCesare, L.Haff, R.M Atlas, 1991b Detection of Escherichia coli and Shigella spp in water by using the polymerase chain reaction and [6] [8] [9] gene probes for uid Appl Environ Microbiol 57 (4), 1013–1017 Nguyễn Thị Ngọc Dao, 2004 Nghiên cứu chế tạo kit phát nhanh, xác vi sinh vật độc hại gây ô nhiễm khơng khí nước Báo cáo tổng kết đề tài nhánh Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC.04.10 T.S Hammack, P Feng, R.M Amaguana, G.A June, P.S Sherrod, W.H Andrews Comparison of sorbitol MacConkey and hemorrhagic coli agars for recovery of Escherichia coli O157: H7 from brie, ice cream, and whole milk J AOAC Int 1997; 80:335–340 [PubMed: 9086590] L Heijnen, G Medema, 2009 Method for rapid detection of viable Escherichia coli in water using real-time NASBA Water research 43, 3124-3132 D.R Shelton, J.S Karns Quantitative detection of Escherichia coli O157 in surface waters by using immunomagnetic electrochemiluminescence Appl Environ Microbiol 2001; 67:2908–2915 [PubMed: 11425701] C.W Raphael, Y.T Harley, 2009 Lateral flow immunoassay ISBN: 978-58829-908-6 E-ISBN: 978-1-59745-240-3 DOI 10.1007/978-1-59745240-3 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục, 2002 Producction of Rapid E.coli Detection Kit of in Water Nguyen Thi Tam Thu1, Tran Thi Thanh Quynh1, Tran Thi Huyen Nga2, Tran Thanh Huyen2, Pham Kien Cuong1 Institue of New Technology, Academy of Military Science and Technology, 17 Hoang Sam, Hanoi Faculty of Environmental Sciences, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Abstract: E coli is considered the indicator of microbial contamination in water and food There have been many methods to detect E coli in water and food, but most of them need expensive equipments in a laboratory Therefore, developing tools to rapidly detect E coli in water and food are needed This paper present the results on growth medium for E coli to reach the limit of detection by test strips in hours with the original concentration of below 20 CFU/ml Test strips have specificity of over 90% and the limit of detection is 106 CFU/ml This result is the basis for for E coli rapid detection kit in drinking water supply in field conditions The kit is easy to use for people under harsh conditions such as waves, wind, tidal or flood Keywords: Water, contamination, Kit, Test strip, E coli ... laboratory Therefore, developing tools to rapidly detect E coli in water and food are needed This paper present the results on growth medium for E coli to reach the limit of detection by test strips... Abstract: E coli is considered the indicator of microbial contamination in water and food There have been many methods to detect E coli in water and food, but most of them need expensive equipments... brie, ice cream, and whole milk J AOAC Int 1997; 80:335–340 [PubMed: 9086590] L Heijnen, G Medema, 2009 Method for rapid detection of viable Escherichia coli in water using real-time NASBA Water