Phát hiện các đột biến trên gen Beta Globin bằng kỹ thuật ARMS PCR và lai điểm ngược REVERSE DOT BLOT

Phát hiện các đột biến trên gen Beta Globin bằng kỹ thuật ARMS PCR và lai điểm ngược REVERSE DOT BLOT Phát hiện các đột biến trên gen Beta Globin bằng kỹ thuật ARMS PCR và lai điểm ngược REVERSE DOT BLOT luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Thu Hà PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Thu Hà PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN BETA GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR VÀ LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan Cô ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, dạy giúp đỡ em tận tình suốt q trình học tập làm việc Cơ khơng truyền đạt cho em kiến thức mà dạy cho em cách giải vấn đề, cách bố trí thí nghiệm hiệu quả, tác phong làm việc khoa học Cơ cịn quan tâm, giúp đỡ em giải khó khăn sống Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tạ Bích Thuận Cơ ln động viên, quan tâm, dẫn em tận tình suốt q trình thực đề tài Cơ ln khích lệ em nhiều lúc em gặp khó khăn, giúp em có thêm động lực để hồn thành luận văn Em xin cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên dạy dỗ, truyền đạt cho em kiến thức khoa học, tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Anh Thùy Dƣơng, ThS Ngơ Thị Hà, bạn em thuộc Phịng thuộc phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội giúp đỡ nhiệt tình chia sẻ khó khăn suốt q trình em thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè thân thiết động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2017 Lê Thị Thu Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1- TổNG QUAN 1.1 BỆNH Β-THALASSEMIA 1.1.1 Tình hình mắc bệnh giới Việt Nam 1.1.2 Vị trí, cấu trúc gen β-globin mã hóa chuỗi β-globin 1.1.3 Các đột biến gen β-globin gây bệnh β-thalassemia 1.1.4 Đặc điểm kiểu hình bệnh β-thalassemia 1.1.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 10 1.2 KỸ THUẬT ARMS-PCR (AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM - PCR) 13 1.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật ARMS-PCR 13 1.2.2 Thiết kế mồi cho phản ứng ARMS-PCR 14 1.2.3 Ƣu điểm nhƣợc điểm kỹ thuật ARMS-PCR 16 1.2.4 Kỹ thuật ARMS-PCR chẩn đoán bệnh β-thalassemia 16 1.3 KỸ THUẬT LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) 17 1.3.1 Nguyên tắc chung kỹ thuật lai axit nucleic 17 1.3.2 Đầu dò kỹ thuật lai điểm ngƣợc 18 1.3.3 Màng sử dụng kỹ thuật lai điểm ngƣợc 20 1.3.4 Kỹ thuật lai điểm ngƣợc chẩn đoán bệnh β-thalassemia 21 Chƣơng 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Trình tự đầu dò oligo sử dụng nghiên cứu 25 2.1.4 Trình tự mồi 26 2.1.5 Thiết bị 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 28 2.2.2 Tách ADN tổng số 29 2.2.3 Phƣơng pháp PCR 29 2.2.4 Phƣơng pháp ARMS-PCR 31 2.2.5 Phƣơng pháp điện di 33 2.2.6 Quá trình lai điểm ngƣợc 34 2.2.7 Phƣơng pháp tách dòng 35 Chƣơng 3- KẾT QUẢ 38 KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI 39 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β-GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS-PCR 42 2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 mẫu thalassemia ARMS-PCR 42 2.2 Sàng lọc đột biến Cd 26 mẫu thalassemia ARMS-PCR 43 2.3 Sàng lọc đột biến Cd 41/42 mẫu thalassemia ARMS-PCR44 SO SÁNH KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN CÁC MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI VỚI KẾT QUẢ CHẨN ĐỐN SINH HĨA 47 3.1 Đặc điểm Hb đột biến nghiên cứu 48 3.2 Giá trị HbE mẫu có đột biến Cd 26 52 3.3 So sánh kết chẩn đoán sinh hóa với kết phân tích PCR đa mồi 53 KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở NHĨM NGƢỜI BÌNH THƢỜNG 55 BIẾN NẠP, TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN βGLOBIN 58 5.1 Biến nạp, tách dòng 58 5.2 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 17 61 5.3 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 26 62 5.4 Giải trình tự đoạn gen β-globin có đột biến Cd 41/42 64 5.5 Giải trình tự đoạn gen β-globin khơng có đột biến 66 LAI ĐIỂM NGƢỢC (REVERSE DOT BLOT) 67 6.1 Đánh dấu trình tự đích cho q trình lai điểm ngƣợc 67 6.2 Tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc 68 6.3 Kết lai số mẫu bệnh phẩm 73 KẾT LUẬN 76 KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT (-) Âm tính (+) Dƣơng tính 3‟UTR 3‟ Untranslated Region (Vùng 3‟ không dịch mã) 5‟UTR 5‟ Untranslated Region (Vùng 5‟ không dịch mã) ADN Acid deoxyribonucleic ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation System-PCR ARN Acid ribonucleic BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate- BCIP bp base pair Cd Codon DCIP Dichlorophenol Indophenol dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate EDC 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride H2O Nƣớc Hb Hemoglobin huyết sắc tố HbA Adult hemoglobin HbA2 Adult hemoglobin HbE Hemoglobin E HbF Fetal hemoglobin HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) HPV Human papillomavirus IVS Intervening sequence (Intron) LB Luria Bertani MCH mean corpuscular hemoglobin (Lƣợng hemoglobin trung bình hồng cầu) MCV mean corpuscular volume (Thể tích trung bình hồng cầu) NBT nitro-blue-tetrazalium SA-AP Streptavidine alkaline phosphatase SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Saline Sodium Citrate TBE Đệm Tris - Borate - EDTA TBE Tris-Borate-EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) WHO World Health Organisation (Tổ chức Y tế Thế giới) α alpha β beta γ Gama δ Delta DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cụm gen β-globin (A) cấu trúc gen β-globin (B) Hình 1.2 Các đột biến gen β-globin gây bệnh β-thalassemia Hình 1.3 Biểu đồ sàng lọc ngƣời bệnh β-thalassemia 11 Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật ARMS-PCR phát đột biến điểm 13 Hình 1.5 Cấu trúc oligonucleotide amino-linkers spacer arm 17 Hình 1.6 Cơ chế phát màu trình lai điểm ngƣợc 18 Hình 2.1 Sơ đồ minh họa vị trí mồi sử dụng nghiên cứu 24 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm phát đột biến gen β- 26 globin Hình 3.1 Kết điện di minh họa ADN tổng số tách từ mẫu máu 35 Hình 3.2 Kết điện di minh họa sản phẩm PCR đa mồi 37 Hình 3.3 Kết sàng lọc đột biến Cd 17 kỹ thuật ARMSPCR 38 Hình 3.4 Kết sàng lọc đột biến Cd 26 kỹ thuật ARMSPCR 39 Hình 3.5 Kết sàng lọc đột biến Cd41/42 kỹ thuật ARMSPCR 40 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen βglobin cặp mồi 95 NF/Control R 52 Hình 3.7 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi vector M13F/R 52 Hình 3.8 Kết tách plasmid 53 Hình 3.9 Kết PCR kiểm tra plasmid 1.1, 2.1, 4.1 lần lƣợt với mồi đột biến Cd 17, Cd 41/42, Cd 26 53 Hình 3.10 Kết so sánh trình tự đoạn gen β-globin mẫu T57 với ngân hàng liệu NCBI 54 Hình 3.11 Kết so sánh trình tự đoạn gen β-globin mẫu T365 với ngân hàng liệu NCBI 56 Hình 3.12 Kết so sánh đột biến Cd 42 (TTT→CTT) với sở liệu HbVar 57 Hình 3.13 Kết so sánh trình tự đoạn gen β-globin mẫu T57 với ngân hàng liệu NCBI 58 Hình 3.14 Kết so sánh trình tự đoạn gen β-globin mẫu T99 với ngân hàng liệu NCBI 59 Hình 3.15 Minh họa kết đánh dấu đoạn gen β-globin với biotin 60 Hình 3.16 Kết tối ƣu điều kiện lai điểm ngƣợc 62 Hình 3.17 Chuẩn hóa nồng độ đầu dị CD26 chấm lên màng 63 Hình 3.18 Kết lai điểm ngƣợc mẫu ADN ngƣời khơng có đột biến khảo sát với đầu dị CD 17, CD 26, CD 41/42 64 Hình 3.19 Kết lai điểm ngƣợc ba mẫu bệnh phẩm phát ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 gen β-globin 65 Hình 3.20 Kết lai điểm ngƣợc số mẫu bệnh phẩm phát ba đột biến Cd 17, Cd 26, Cd 41/42 gen βglobin 66 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T114 Nguyễn Khắc Lợi T116 Hoàng Thị Bích Toan T117 Tạ Thị Trang T118 T119 T120 T121 T122 T123 Nơng Quốc Hậu Trƣơng Thị Ngỗn Nguyễn Thị Bạch Kim Đặng Viết Duy Dƣơng Hải Trân Ma Thị Hồn Kí hiệu Họ Tên T124 T125 T126 T127 Lèo Văn Lả Nguyễn Thị Hòa Vũ Thị Năm Vũ Nho Đắc Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Giới tính Nam Nữ Nữ Nam T128 Vũ Đình Gia Huy Nữ T129 Phạm Nguyễn đạt Nam T130 Bàn Thị Liên T131 Đinh Thái Quang Nữ Nam Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia Thalassemia 9,3 23,9 76,1 88,4 72,5 27,5 79,3 5,7 51 43,3 97,6 90,4 6,3 87,7 9,1 53,2 42,4 Thalassemia Thalassemia Chẩn đốn sinh hóa Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác Thalassemia Các thiếu máu khác Các thiếu máu 105 2,3 1,1 + + + + + + + + + 19.6 2,4 3,3 3,2 4,4 Kết điện di Hb Hb A1 69,7 97,7 93,4 94,7 Hb F 4,5 3,3 Hb Hb Hb MMM E A2 H 30,3 2,3 2,1 92,6 4,9 2,5 74,9 94,7 2,8 2,5 93,1 2,9 19,1 + + + + + + + - + Cd17 N Đột biến Cd41/42 Cd26 M N M N + + + + Cd95 M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm khác T132 T133 T134 T135 T136 Nguyễn Duy Thanh Tạ Thị Nghĩa Trần Thị Ngọc Hồ Thị Hƣơng Mơ Lê Thanh Phong T137 Nguyễn Thị Hịa T138 T139 T140 T141 T142 T143 Kí hiệu Hà Văn Duy Cao Thị Mến Lê Thu Hà Lƣơng Đức Thạo Nguyễn Thị Thúy Đặng Hƣơng Giang Họ Tên T144 Nguyễn Xuân Ánh Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Giới tính Nam T145 Bùi Ngọc Mai T146 Mai Hƣơng Ly Nữ Nữ T147 Trịnh Thị Minh Nguyệt Nữ 87,5 93,1 99,1 Thalassemia α-Thalassemia β-thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác β-thalassemia Thalassemia 6,8 5,7 2,9 0,9 50,8 49,2 58,9 25,9 15,2 75 74,1 59,1 17,4 89,9 Thalassemia Thalassemia Chẩn đốn sinh hóa Các thiếu máu khác Thalassemia Hb F 92,2 72,9 Hb E + + + + + + + + Cd17 Hb Hb MMM A2 H + + N 3,8 + + + + + + + + + + + + + + + + + Đột biến Cd41/42 Cd26 M N 20,9 M N + + + + + + + 27,1 20,7 40,1 39,2 106 + 25 25,6 74,4 39,2 60,8 25,9 16,4 24,5 37,7 44,9 6,9 3,2 79,1 Các thiếu máu khác + + Kết điện di Hb Hb A1 + + + Cd95 M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T148 Tô Thu Hƣơng T149 Đặng Ngọc Khiêm T150 Đinh Phƣơng Thảo T151 Lƣơng Thị Thùy Nữ Nam Nữ Nữ T152 Trần Thị Khiên Nữ T153 Hoàng Thị Kim Cúc Nữ T154 T155 T156 T157 Trịnh Thị Minh Nguyệt Nguyễn Quốc Đạt Lê Thị Hồng Anh Trần Đăng Quang Nữ Nữ Nữ Nam T158 Nguyễn Thu Trang Nữ T159 Đinh Thị Hải Nữ T160 Trần Bảo Ngọc Nam T161 Vi Văn Địu T162 Vi Văn Đạo T163 Nguyễn Bá Quang Nam Nam Nam Kí hiệu Giới tính Họ Tên Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia 94,9 Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Thalassemia β-thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác 5,1 9,8 41,9 48,3 22,9 74,6 87,4 3,3 2,1 83,3 10,8 5,9 107 + + + + + 10,5 + + + + 19,9 39,4 40,7 90,1 4,9 3,2 8,6 88,2 21,6 9,7 68,7 + + + + + + + + + + + + + + 1,7 89,7 5,1 5,2 92,1 5,6 2,3 4,9 46,7 48,4 4,5 20,7 74,8 94,8 Chẩn đốn sinh hóa + + 40,4 26,4 33,2 92,6 Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia + Hb F Hb E + 5,7 + + + 5,2 Kết điện di Hb Hb A1 + Hb Hb MMM A2 H Cd17 N + + + + + + + Đột biến Cd41/42 Cd26 M N M N Cd95 M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T164 Đinh Công Trƣờng Nam T167 Ma Dỗn Thanh Phong Nam T168 Lị Văn Pị Nam T169 T170 T171 T172 T173 T174 T175 T176 T177 T178 T179 T180 T181 T182 Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Phạm Văn Bình Hà Thị Tụy Lê Thúy Hạnh Ngô Bảo Châu Nguyễn Thị Thu Thủy Tạ Thị Chen Phạm Xuân Quyết Nguyễn Minh Quang Lê Thị Đinh Lƣơng Công Hƣng Lôi Việt Nguyễn Hoàng Minh Tâm Phan Hoàng Đức Đặng Văn Giang T184 Dƣơng Gia Huy Nam T185 Nguyễn Thị Hiền T187 Nguyễn Thị Thu Trang Kí Họ Tên Nữ Nữ Giới α-Thalassemia Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia 85,4 17 Thalassemia β-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia Chẩn đoán sinh 108 2,3 12,3 47,1 35,9 72,8 27,2 6,4 8,8 97,6 97,9 93,3 97,6 98,8 94,5 84,5 7,6 66,6 97,3 98,4 98,1 39,7 53,9 88,1 91,6 3,2 4,4 3,3 33,1 59,3 29,3 + 3,1 2,4 2,1 2,3 2,4 1,2 2,2 1,9 + + + + + + + + + + + + + + + + + 13,6 4,1 2,7 1,6 1,9 + + + + 5,2 89,7 0,8 9,5 78,4 19,9 1,7 Kết điện di Hb + + Đột biến Luận văn thạc sĩ hiệu T188 T189 T190 T197 T198 T199 T200 T204 T205 T207 T210 T211 T212 T213 T214 T215 T219 T224 T225 T227 Kí Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm tính Nguyễn Thị Hiền Nguyễn Tuyết Lan Vũ Mạnh Quỳnh Trần Minh Quang Phạm Thị Loan Phạm Văn Thời Hà Quang Vinh Hoàng Văn Thùy Hà Thị Lảnh Phạm Thị Thoan Trịnh Thị Ngọc Hà Thị Ngọc Mã Tùng Lâm Hoàng Việt Quang Ma Thị Nƣơng Phạm Thu Hà Lê Văn Hiệp Hoàng Công Hiệp Đặng Văn Công Vũ Thị Khánh Ly Họ Tên Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Giới hóa Cd17 Thalassemia β-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia β-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Chẩn đoán sinh 109 Hb Hb Hb Hb Hb MMM A1 F E A2 H 90,3 6,3 3,4 89,3 1,8 8,9 96,9 3,1 59,1 19,3 21,6 56,1 43,9 37,6 62,4 43,5 56,5 97,8 2,2 21 52,7 26,3 33,8 31,5 34,7 84,2 1,9 13,9 48,7 48,2 3,1 27,1 68,7 4,1 78 18,8 3,2 91,3 5,9 2,8 94,2 2,1 3,7 79,6 14,6 5,8 95,2 4,8 92,8 7,2 64,7 29 6,3 Kết điện di Hb N Cd41/42 M N Cd26 M N + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + Đột biến Cd95 M + Luận văn thạc sĩ hiệu Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm tính hóa Cd17 Hb A1 97,2 94,2 Hb F Hb E Hb Hb MMM A2 H 2,8 2,8 T228 Hoàng Hữu Nhẫn T229 Vũ Thị An Nguyễn Thị Thanh T230 Loan T233 Nguyễn Tấn Cƣờng Nam Nữ Thalassemia Nữ Thalassemia 89,9 5,6 4,5 Nam 89 4,8 6,2 T234 Nguyễn Thanh Thủy Nữ 94 T235 Ngô Thị Lý Nữ Thalassemia Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác 94,2 5,8 T236 Nguyễn Thị Kim Anh T237 Lê Viết Thọ T238 Ngô Kim Phƣơng T240 T242 T243 T244 T245 T250 T251 T252 Trần Ánh Hồng Lý Phƣơng Thảo Dƣơng Thị Hằng Vũ Văn Thảo Nguyễn Thị Phƣơng Nga Nguyễn Hữu Thêm Bùi Đức Đông Trần Thị Xuân Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Thalassemia Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia α-Thalassemia Thalassemia Nữ Thalassemia Nam Nam Nữ Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu Nữ + + + - M N 94,9 43,9 53,9 5,1 2,2 84,3 11,2 4,5 + + 93,3 95,2 99 92,5 2,6 2,1 7,5 + + 12 4,1 2,7 53,2 34,8 96,3 25,5 24,6 49,9 94,5 2,8 110 N Cd41/42 + + Cd26 M N + + + + + + 3,7 2,7 Cd95 M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm khác Nguyễn Thị Phƣơng Dung T254 Nguyễn Văn Thạch T255 Lê Văn Hiệp T253 Kí hiệu T256 T257 T258 T259 T260 T261 Họ Tên Đàm Thị Hồng Hạnh Nguyễn Thị Giang Lê Phƣơng Uyên Triệu Thị Xuân Nhung Lê Minh Hoàng Phùng Khánh Hà Nữ KTSK 75,3 Nam Nam KTSK Thalassemia 92,2 84,8 Giới tính Chẩn đốn sinh hóa Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Thalassemia T262 Dƣơng Gia Huy Nam T263 Nguyễn Thị Phƣơng T264 Trần Văn Thăng T266 Trƣơng Hồng Thuận Nữ Nam Nam T267 Lê Thị Thu Hiền Nữ T269 Lý Thị Thu Thủy T270 Bùi Văn Ne T271 Phạm Thị Tuyến Nữ Nam Nữ 2,7 9,4 + 5,1 5,8 + + Kết điện di Hb Hb A1 90,3 93,1 36,6 91,5 61,4 Thalassemia Thalassemia D59 Thalassemia Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu 24,7 Hb F 43,8 3,9 3,5 22,7 5,6 20,3 95,9 4,1 69 28,4 98,6 43 12,7 44,3 2,6 1,4 77,8 94,9 94,6 111 1,5 5,1 5,4 N Đột biến Cd41/42 Cd26 M 20,7 N M N + + + + + + + + + + + 55,2 44,8 + + Cd17 Hb Hb Hb MMM E A2 H 56,2 5,8 + 3,4 + 40,7 2,9 18,3 + + + - + + + + + + + + Cd95 M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T272 Trần Thị Ngân Nữ T273 Trần Diệu Linh Nữ T274 Nguyễn Thiện Dũng Nam T276 Dƣơng Thị Thi Nữ T277 Cẩm Thị Thu Hà Nữ T278 Nguyễn Mạnh Quyền T279 Ma Cơng Hồng T280 Đinh Cơng Nhân Kí hiệu Họ Tên T281 Đoàn Thái An T282 Nguyễn Thị Phƣơng Dunfg Nam Nam Nam Giới tính Nam Nữ T283 Nguyễn Văn Thạch Nam T284 Nguyễn Thị Thao T285 Trần Văn Chuẩn Nữ Nam khác Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác TMTS Các thiếu máu khác β-thalassemia Thalassemia Thalassemia 93,9 2,2 3,9 74,1 5,7 20,2 + + 66,2 6,7 27,1 + + + + + + + + + + 96,3 8,4 3,7 47,2 44,4 7,9 41,7 50,4 19 36,6 44,4 95,4 2,3 Chẩn đốn sinh hóa Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Thalassemia Thalassemia + Hb A1 Hb F 88,8 4,6 88,3 83 33,3 Hb E + + 2,3 Kết điện di Hb 69,8 112 + Cd17 Hb Hb MMM A2 H N Đột biến Cd41/42 Cd26 M N M N + + + + Cd95 M 6,6 30,2 4,7 1,8 66,7 + + 15,2 + Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T286 Nguyễn Thị Nga Nữ T287 Nguyễn Văn Quản Nữ T288 Đoàn Hải Phong Nữ T289 T290 T291 T292 T293 T294 T295 T296 Hà Lê Kiều Trinh Bùi Thanh Huyền Hoàng Thị Thanh Phạm Văn Thịnh Lị Thị Thìn Nguyễn Văn Nghĩa Đặng Xn Hiếu Trƣơng Công Hoan T297 Đặng Thị Hiền T298 T299 T300 T301 T302 Nguyễn Việt Phƣơng Lê Quyết Tiến Đào Thị Minh Trần Thị Thu Phƣơng Lƣơng Phƣơng Nam T303 Đỗ Thị Loan Kí hiệu Họ Tên Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nam Nữ Giới tính Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác β-thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia 71,8 28,2 93,6 92,6 Các thiếu máu khác KTSK β-thalassemia β-thalassemia Thalassemia Thalassemia Các thiếu máu khác Chẩn đoán sinh hóa 113 6,4 4,2 3,2 80,9 15,8 6,4 24,8 68,8 43,8 56,2 7,5 49,1 43,4 95,1 92,2 4,5 96,2 95,1 3,3 95,9 4,1 21,6 30,2 48,2 35,3 64,7 95,8 72,5 3,2 78,8 93,8 2,2 + + + + + + + 4,9 3,3 3,8 4,9 4,2 1,5 2,2 22,8 19 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Kết điện di Hb Cd17 Đột biến Cd41/42 Cd26 Cd95 Luận văn thạc sĩ T304 T307 T308 T309 T310 T311 T312 T313 T314 T315 T316 T317 T318 T319 T320 T321 T322 T323 T324 T325 T326 T327 Vũ Thị Tiến Đỗ Thị Châu Loan Trƣơng Thị Bạch Mai Hoàng Hải Hà Trần Tuấn Hƣng Hứa Minh Hiệp Mai Xuân Thịnh Đặng Thái An Giáp Thị Lý Nguyễn Thị Chinh Lò Sơn Quỳnh Đặng Minh Đức Đinh Thị Hƣơng Đỗ Mạnh Hùng Nguyễn Thị Thanh Thủy Đỗ Ngọc Khanh Nguyễn Tuấn Anh Nguyễn Quang Vinh Quan Văn Trƣờng Quan Trung Thái Vũ Văn Trƣờng Lê Thị Cẩm Tú Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Hb Hb Hb Hb Hb MMM A1 F E A2 H 94,1 5,9 + 70,4 29,6 94 + 72,9 1,4 25,7 82,2 1,7 16,1 96,2 3,8 74,9 2,1 23 94 3,5 2,5 16,1 80,7 3,2 51,1 48,9 96,8 3,2 95,8 4,2 36,4 26,6 37 85,1 8,6 6,3 + D75.2 Thalassemia TM Thalassemia KTSK Thalassemia Thalassemia β-thalassemia Thalassemia β-thalassemia Các thiếu máu khác KTSK Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia XƠ TỦY TMTS 114 92,8 4,9 2,3 90,7 84 77,1 94,7 94,6 96,1 88,4 3,9 5,4 2,5 1,9 5,3 5,4 3,9 6,8 4,8 N M N M N + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 13,5 21 + + M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T328 Vũ Văn Bẩy Kí hiệu Họ Tên Nam Giới tính T329 Trần Ngọc Đông Nam T330 Trịnh Thị Thúy T331 Lê Lan Dƣơng Nữ Nữ T332 Mai Thị Minh Trang Nữ T333 T334 T335 T336 T337 T338 T339 T340 T341 T342 T343 T344 T345 T346 Hoàng Thị Hiền Lê Thị Hà Trang Hoàng Nhật Tam Thiệu Việt Hoàng Đinh Hoàng Tú Ngân Nguyễn Thiị Miến Nơng Thị Dƣơng Trần Thảo Nhi Hồng Thị Hiền Ma Truongf Giang Nguyễn Mai Liên Phùng Thị Tiến Hoàng Hồng Cảnh Chu Văn Đức Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nam Nam β-thalassemia 81,2 Chẩn đốn sinh hóa Các thiếu máu khác α-Thalassemia KTSK Các thiếu máu khác KTSK KTSK KTSK 2,3 Kết điện di Hb Hb A1 Hb F Hb E 84,3 95,7 115 Cd17 Hb Hb MMM A2 H 1,9 25,9 96,1 Thalassemia Thalassemia Thalassemia 16,5 N Đột biến Cd41/42 Cd26 M N M N + + + + + + 13,8 74,1 + + 3,9 1,6 2,7 94,9 74,2 25,8 96,4 96,2 22,5 73,9 12,6 83 86 93,5 94,6 91 6,9 27,3 28,4 44,3 96,2 2,4 98,5 97,4 5,2 3,6 3,8 3,6 4,4 2,2 2,5 5,4 2,1 1,4 1,5 2,6 + + + - 11,8 + + Cd95 M Luận văn thạc sĩ T348 T349 T350 T351 T352 Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm Nguyễn Thị Tƣơi Bùi Tuyết Mai Đào Văn Có Hồng Thị Út Trần Thị Quỳnh Chi Kí hiệu Họ Tên T353 T354 T355 T356 T357 T358 T359 T360 T361 T362 T363 T364 T365 T366 T367 T368 Hứa Văn Tú Riêu Thị Thùy Dung Triệu Hoàng Ánh Tuyết Nguyễn Thị Đông Mai Khánh Ly Trần Mạnh Cƣờng Trần Phƣơng Thảo Nguyễn Minh Ngọc Nguyễn Khánh Ly Lê Anh Dũng Lê Anh Duy Phạm Thị Tình Vy Thị Lý Trần Mạnh Cƣờng Nguyễn Tuyết Nhung Hoàng Thị Hƣơng Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Giới tính 71,6 28,4 44,4 15,3 40,3 96 67,6 32,4 80,4 12,6 Chẩn đốn sinh hóa Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nữ 116 + + + + + + Kết điện di Hb Hb Hb Hb Hb Hb MMM A1 F E A2 H 59,2 36,9 3,9 63,1 17,6 19,3 96,3 3,7 96 95,8 4,2 91,6 8,4 94,5 5,5 94,5 5,5 93,5 6,5 93 94,3 5,7 91,7 2,2 6,1 8,6 91,4 74,4 25,6 91,8 2,7 5,5 31,3 68,7 Cd17 + + + + Đột biến Cd41/42 Cd26 N M N + + + + + + + - + + + + + + M N + + + + + Cd95 M Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T369 T370 T371 T372 T373 Trần Văn Quân Khoáng Thanh Việt Cẩm Thị Phƣơng Vân Bùi Thị Hằng Nga Hoàng Nguyễn Thị Thu T374 Phƣơng T375 Nguyễn Anh Thƣ Kí hiệu Họ Tên T378 Phạm Thành Phong T379 Hoàng Thị Hƣơng Mơ T380 Thăng Quang Sáu Phạm Nguyễn Thùy T381 Linh T382 Nguyễn Thị Thanh Hiền T383 Lê Thị Quyên T384 Vũ Thị Linh T385 Nguyễn Mạnh Cƣờng T386 Hoàng Xuân Trƣờng T387 Sầm Thị Tâm T388 Lê Quang Dƣơng Nam Nam Nữ Nữ Nam 96,1 64,6 61,7 35,4 38,3 25,8 74,2 71,3 24,6 Nữ 27 Nam Giới tính 3,9 59,3 Chẩn đốn sinh hóa + + Kết điện di Hb Nam Nữ Nam Nữ 93,8 6,2 Nữ Nữ Nữ Nam Nam 95,5 95 95,3 35 95,9 4,5 4,7 Nam Các thiếu máu khác Các thiếu máu 117 Cd17 Hb Hb Hb MMM E A2 H 21,3 2,1 12,8 6,5 + + N Đột biến Cd41/42 Cd26 M + + N M N + + 24,3 M + + + + + + 4,1 1,8 Cd95 + 65 91,2 75,7 + 4,7 Hb A1 78,7 85,1 93,5 Nữ + + + 4,1 73 36 Hb F + + + + + + Luận văn thạc sĩ T389 T390 T391 T392 T393 T394 T395 Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm Phạm Vi Anh Nguyễn Thị Tuyết Hà Văn Lâm Phùng Quỳnh Mai Đinh Thị Thu Hà Đinh Thị Hƣơng Phạm Thị Vân Anh Nam Nữ Nam Nữ Nữ Nữ Nữ T396 Nguyễn Thị Hợi Nữ T397 Dƣơng Thị Thảo Nữ T398 Vũ Mạnh Hiếu T399 Dđào Thị Kiều Chinh T400 Nguyễn Văn Lĩnh Kí hiệu Họ Tên T401 Nguyễn Hoàng Thắng T402 Đào Quang Vinh T403 Nguyễn Thị Hòa T404 Lê Minh Việt Trung Nam Nữ Nam khác Thalassemia Thalassemia Thalassemia Thalassemia KTSK Thalassemia KTSK Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Thalassemia KTSK 73 82,4 90,2 88 68,1 Chẩn đốn sinh hóa Nam Nam KTSK KTSK Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Nam 31,9 24,4 75,6 118 12,5 8,8 8,9 + + 94,6 5,4 95,1 4,9 + + 94,3 5,7 + + 74,3 91,1 96,5 Giới tính Nữ 3,6 5,1 3,1 25,7 8,9 3,5 Kết điện di Hb Hb A1 93,2 93,4 + + Hb F Hb E Cd17 Hb Hb MMM A2 H 6,8 + 6,6 95,8 4,2 92,2 7,8 N + + + + + + + + Đột biến Cd41/42 Cd26 M N + + M N Cd95 M + + Luận văn thạc sĩ Lê Thị Thu Hà - K23 Sinh học thực nghiệm T405 Lê Thị Hồng Sơn Nữ T406 Phạm Khánh Chi Nữ T407 Nguyễn Văn Long Nam T408 Nguyễn Phan Sơn Nam Thalassemia Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác Các thiếu máu khác 47,5 52,5 119 + 93,7 6,3 93,8 6,2 96,2 3,8 + + + + + ... LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β -GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI 39 SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN β -GLOBIN BẰNG KỸ THUẬT ARMS- PCR 42 2.1 Sàng lọc đột biến Cd 17 mẫu thalassemia ARMS- PCR. .. ? ?Phát đột biến gen beta globin kỹ thuật ARMS- PCR lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) ” với nội dung nghiên cứu: (1) xây dựng đƣợc kỹ thuật ARMS- PCR để sàng lọc số đột biến phổ biến gen ? ?globin Việt... nhiều đột biến, kỹ thuật lai điểm gây tốn thời gian bƣớc lai rửa cần riêng biệt đột biến Do đó, kỹ thuật lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) đƣợc phát triển cho phép phát đƣợc đồng thời nhiều đột biến