Mục tiêu của luận văn nhằm thiết kế và lựa chọn được các mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1; nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi,...; thử nghiệm được phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm.
MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus A/H5N1 là vấn đề quan tâm đối với cả thế giới, đặc biệt là đối với các nước châu Á như Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 đã gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn ni gia cầm và gây tử vong cho hàng trăm người. Cả giới đang lo sợ trước nguy cơ có thể xảy ra một đại dịch cúm trên người do virus A/H5N1 giống như các vụ đại dịch cúm đã xảy ra trong thế kỷ 20. Các nước trên thế giới đã tiêu tốn hàng tỷ đơ la cho việc chuẩn bị chống lại một đại dịch cúm H5N1 có thể xảy ra trong tương lai như mua thuốc và các thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành các phương án phịng chống dịch, thực hiện chiến lược nhằm kiểm sốt chặt chẽ đường biên giới Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên tồn quốc. Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đang đứng thứ 2 trên thế giới (sau Indonesia) về số người nhiễm và tử vong do virus A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 là virus có khả năng biến đổi gen nhanh chóng và hình thành nên các chủng virus mới nên việc sử dụng vaccine để dự phịng thường khơng đạt được hiệu quả cao. Ở Việt Nam hiện nay, dịch cúm A/H5N1 vẫn liên tục xảy ra trên gia cầm và người, mặc dù mức độ khơng trầm trọng như giai đoạn trước đây nhưng nếu khơng được phát hiện và có các biện pháp dập dịch kịp thời thì dịch có thể trở nên bùng phát. Khi có dịch cúm gia cầm, một phương pháp chẩn đốn nhanh, nhạy và chính xác là cần thiết cho việc điều trị, kiểm sốt và ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng ra cộng đồng. Để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu bệnh phẩm ở người và gia cầm, hiện nay hầu hết các phịng xét nghiệm đều áp dụng kỹ thuật RTPCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát hiện virus với độ chính xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 46 giờ nếu thực hiện Realtime RTPCR và 1224 giờ nếu thực hiện RTPCR và điện di trên gel agarose. Với RTPCR thơng thường, ng ười ta phải thực hiện ba phản ứng để chẩn đốn xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: một phản ứng để xác định virus cúm A, một phản ứng xác định subtype H5 và một phản ứng xác định subtype N1 Để đơn giản hóa q trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm và tiết kiệm chi phí người ta có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex RTPCR, cho phép chẩn đốn xác định cúm A/H5N1 chỉ với một phản ứng RTPCR thay vì phải làm ba phản ứng RTPCR. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế và xây dựng quy trình thực hiện kỹ thuật multiplex RTPCR khá phức tạp nên hiện nay hầu hết các phịng xét nghiệm trong nước chưa áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đốn cúm A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tơi thực hiện ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” tại Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: Thiết kế lựa chọn được mồi phù hợp để thực hiện phản ứng multiplex RTPCR phát hiện virus cúm A/H5N1 Nghiên cứu tối ưu hóa được các điều kiện của phản ứng multiplex RT PCR: nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ mồi, Thử nghiệm được phản ứng multiplex RTPCR phát hiện A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người và gia cầm. Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1. Phân loại học và danh pháp 1.1.1.1. Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế về phân loại virus (ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm 3 type là A, B và C. Chúng là các virus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn âm [32]. Sự phân biệt virus cúm A, B và C dựa trên sự khác nhau về đặc tính kháng ngun của nucleoprotein (NP) và protein nền M1 (matrix protein). Ngồi ra, hệ gen của virus cúm A và B đều có 8 đoạn RNA cịn virus cúm C chỉ có 7 đoạn RNA [36] Trong 3 type thì type A là virus có giới hạn vật chủ rất rộng, lưu hành phổ biến trên gia cầm và một số động vật có vú như lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… và cả con người [32]. Virus cúm A là loại có độc lực mạnh nhất, có khả năng biến đổi gen rất lớn và ngun nhân chủ yếu gây ra các vụ đại dịch cúm trong thế kỷ qua. Dựa vào sự khác biệt về đặc tính kháng ngun của hai glycoprotein là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA), virus cúm A cịn được chia thành 16 subtype HA (H1H16) subtype NA (N1N9) Sự tái tổ hợp các subtype HA và NA, về mặt lý thuyết sẽ tạo ra nhiều subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [2]. Tất cả các subtype HA và NA đều hiện diện trên các chủng virus lưu hành ở các lồi thủy cầm hoang dã. Tuy nhiên, chỉ có một số subtype nhất định thường xuyên lưu hành trên người như H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11]. Cúm A/H5N1 là một subtype có khả năng gây nhiễm cao của virus cúm. Các chủng của virus cúm gia cầm có thể xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi và con người Virus cúm B và virus cúm C lưu hành chủ yếu trên người và chỉ gây ra các vụ dịch ở mức độ vừa và nhỏ 1.1.1.2. Phân loại virus cúm A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 được phân biệt với các subtype virus cúm A khác dựa trên sự khác biệt về đặc tính kháng ngun HA và NA. Do có khả năng biến đổi di truyền nhanh chóng nên các chủng virus cúm A/H5N1 đang lưu hành cịn được phân chia thành nhiều clade/subclade (nhóm/phân nhóm), mỗi clade/subclade có các đặc điểm di truyền đặc trưng [2] Các genotype của virus cúm A/H5N1 Trong năm gần đây virus cúm A/H5N1 đã có những biến đổi di truyền và được phân chia thành nhiều nhóm dựa vào sự khác biệt về kiểu gen (genotype). Kiểu gen của virus cúm A/H5N1 thể đặc điểm di truyền của virus được hình thành do sự kết hợp của 8 phân đoạn gen. Trên cơ sở gen H5 và N1 của chủng gốc Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1 được phân chia thành các kiểu gen khác nhau với các đặc điểm di truyền được hình thành do sự tái tổ hợp 6 gen cịn lại từ các nguồn khác nhau. Các kiểu gen khác nhau của virus cúm A/H5N1 đã được xác định bao gồm A, B, C, D, E, G, V, W, X 0, X1, X2, X3, Y, Z và Z+ [26]. Trong số các kiểu gen này, chỉ có một số kiểu gen (B, Z, Z+, V, G, W, và X0) lưu hành được trên 2 năm, chứng tỏ chúng đã thích nghi để có thể tồn tại [22]. Kiểu gen Z là kiểu gen lưu hành phổ biến ở Indonesia, Thái Lan, Việt Nam và phía nam Trung Quốc từ năm 2003 đến nay [14]. Các clade của virus cúm A/H5N1 Các tổ chức WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for Animal Health) và FAO (Food and Agriculture Organization) đã cùng nhau xây dựng một hệ thống danh pháp thống nhất để có thể xác định các clade A/H5N1 [50]. Hiện nay, hệ thống danh pháp này chia virus A/H5N1 thành 10 clade khác nhau, mỗi clade cịn có thể phân thành các subclade (phân dịng) [5, 46]. Hiện tại chỉ có các virus thuộc clade 0, 1, 2 và 7 là lây nhiễm cho người. Clade 2 gồm một số subclade khác nhau vẫn đang lưu hành và tiếp tục hình thành các subclade mới [5]. Kể từ 2008, các clade A/H5N1 hiện đang lưu hành và gây bệnh ở người gồm có clade 2.3.2 (Trung Quốc), 2.3.4 (Trung Quốc và Việt Nam) 2.2 (Ai Cập), 2.1 (Indonesia), 1 (Campuchia) và 7 (Trung Quốc) [51] 1.1.1.3. Danh pháp virus cúm Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã quy định thống nhất danh pháp c ủa virus cúm theo thứ tự kí hiệu: type virus (A, B hoặc C), vật chủ (có thể bỏ qua nếu vật chủ là người), địa điểm phân lập virus, mã số chủng virus và năm phân lập. Nếu là virus cúm A thì phải thêm kí hiệu của kháng ngun HA và kháng ngun NA đặt trong dấu ngoặc đơn Ví dụ: A/Hong Kong/156/1997 (H5N1) là chủng virus cúm A ở người, phân lập ở Hong Kong, mã số chủng là 156, phân lập năm 1997, có kháng ngun HA là H5 và kháng ngun NA là N1 A/Chicken/Vietnam/G62/2005 (H5N1) là chủng virus cúm A phân lập ở gà tại Việt Nam năm 2005, mã số chủng là G62, kháng ngun HA là H5 và kháng ngun NA là N1 1.1.2. Hình thái và cấu trúc virus cúm A/H5N1 Virus cum H5N1 la mơt subtype cua virus cum A, thc ho ́ ̀ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ Orthomyxoviridea. Virus cúm A/H5N1 mang cac đăc điêm cua virus cum A (hình 1.1) ́ ̣ ̉ ̉ ́ Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A. http://thefutureofthings.com/news/6684/ humanantibodiesneutralizeavianflu.html Virus cúm A là virus có vỏ bọc, cấu trúc dạng hình cầu với đường kính từ 80120 nm (nanomet) hoặc hình sợi dài 200300 nm, đường kính 20 nm. Vỏ bọc của virus là lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ tế bào vật ch ủ, trên màng có khoảng 500 cấu trúc hình gai nhơ ra. Các cấu trúc này chính là các kháng ngun bề mặt của virus, dài khoảng 1014 nm, đường kính 46 nm, bản chất là các glycoprotein HA, NA và M2 nằm xen kẽ với nhau. Sự phân bố của các kháng ngun trên bề mặt của hạt virus khơng đồng đều, tỉ lệ HA/NA khoảng 45/1. Bên trong màng lipid được lót bởi một lớp protein nền M1 (khoảng 3000 phân tử M1) [36] Vật chất di truyền (hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm ()ssRNA, gồm 8 phân đoạn riêng biệt mã hóa cho 10 hoặc 11 protein virus (tuy theo t ̀ ưng ̀ chung virus ma co thê co hoăc khơng co protein PB1F2 ̉ ̀ ́ ̉ ́ ̣ ́ ). Bên trong hạt virus, mỗi phân đoạn đều liên kết với nucleoprotein (NP) và 3 tiểu đơn vị của enzyme polymerase (bao gồm PB1, PB2, PA) hình thành nên phức hợp ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein vRNP) [37]. 1.1.3. Hệ gen và các protein của virus A/H5N1 H5N1 có hệ gen là RNA sợi đơn âm bao gồm 8 phân đoạn gen mang tên từ 18 với kích thước phân tử giảm dần hoặc gọi theo tên protein mà chúng mã hóa tổng hợp là PB2, PB1, PB1F2, PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2) và NS (NS1 và NEP) (hình 1.2) Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1 Đặc điểm các phân đoạn gen của virus cúm A/H5N1 như sau: Các phân đoạn mã hóa cho các kháng ngun bề mặt của virus (đặc trưng theo từng chủng virus): Phân đoạn 4 (gen HA): Có kích thước khoảng 17041707 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein HA, là một kháng ngun bề mặt của virus cúm có bản chất là glycoprotein. Kháng ngun này có vai trị trong việc giúp cho virus gắn với tế bào vật chủ và vận chuyển vật liệu di truyền của nó vào bên trong tế bào vật chủ. Q trình này có thể bị chặn lại nếu có các kháng thể đặc hiệu gắn kết với các kháng ngun trên bề mặt của virus. Protein HA cịn là kháng ngun bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng subtype HA, và tham gia vào phản ứng trung hịa virus. HA là protein vừa quyết định tính kháng ngun, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus cơ thể nhiễm, là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay. Một đặc điểm di truyền để phân biệt giữa virus cúm gia cầm và virus cúm người là: virus cúm gia cầm chỉ gắn với thụ thể alpha 23 sialic acid cịn virus cúm người chỉ gắn với thụ thể alpha 26 sialic acid trên tế bào chủ. Ở một số động vật (lợn, gà ) có cả 2 loại thụ thể nên có thể bị nhiễm cả virus cúm gia cầm và cúm người [24]. Người ta đã phát hiện ra sự đột biến ở một số vị trí trên gen HA làm cho virus cúm gia cầm có thể gắn với tế bào người và gây bệnh cho người [11]. Một số nghiên cứu trong thời gian gần đây đã cho thấy ở người cũng có các thụ thể alpha 23 sialic acid với mật độ rất thấp và ở gia cầm cũng có các thụ thể alpha 26 sialic acid với mật độ rất thấp [28]. Người ta cũng nhận thấy nếu đột biến xảy ra ở 2 vị trí trên gen HA tương ứng với axit amin 182 và 192 thì virus có thể gắn với cả thụ thể của người và gia cầm [10, 27] Phân đoạn 6 (gen NA): Có kích thước khoảng từ 13501410 bases, mang gen mã hóa cho neuraminidase, một kháng ngun bề mặt của virus, có vai trị là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử carbonhydrate của protein HA, giải phóng các hạt virus con ra khỏi tế bào vật chủ Ngồi ra, NA cịn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan lỗng màng nhầy bề mặt biểu mơ đường hơ hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mơ và thốt khỏi các chất ức chế khơng đặc hiệu Giống kháng ngun HA, NA cũng là đích chủ yếu của cơ chế bảo vệ miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các chủng virus đang nhễm. Như vậy, hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus là cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện này cho người và gia cầm và hạn chế lây truyền sang người [2]. Các phân đoạn mã hóa cho các protein thành phần của enzyme polymerase của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao, gồm: Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB2, là tiểu đơn vị thành phần phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus [2]. Nghiên cứu thấy rằng, trên PB2 tất cả các virus cúm gia cầm đều có axit amin vị trí 627 là glutamine, cịn PB2 ở các chủng A/H5N1 phân lập từ người mang đột biến chứa axit amin lysine ở vị trí 627. Sự có mặt của lysine ở vị trí 627 của PB2 s ẽ tạo thuận lợi cho virus phát triển ở cả đường hơ hấp trên và đường hơ hấp dưới của động vật có vú, là ngun nhân làm cho A/H5N1 có độc lực cao [29] Phân đoạn 2 (gen PB1) có kích thước khoảng 2431 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein PB1 PB1F2 PB1 tiểu đơn vị xúc tác phức hợp enyzme polymerase, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA [5]. PB1F2 liên quan đến độc lực của virus và có thể có vai trị quan trọng trong việc xác định mức độ nguy hiểm của dịch cúm [43]. Khi so sánh các chủng virus trong vụ dịch ở Hong Kong năm 1997, người ta nhận thấy sự biến đổi axit amin asparagine ở vị trí 66 thành serine (N66S) trên PB1F2 liên quan đến độc lực của virus. Sự thay đổi axit amin N66S cũng được phát hiện trên PB1F2 của virus cúm gây ra đại dịch cúm năm 1918 [17]. Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước khoảng 2233 bases, là phân đoạn gen bảo tồn cao, mã hóa tổng hợp protein PA, tiểu đơn vị enzyme polymerase chịu trách nhiệm kéo dài RNA trong q trình tổng hợp RNA của virus [40] Các phân đoạn mã hóa các protein chức năng khác của virus, chúng có kích thước tương đối ổn định giữa các chủng virus cúm A, gồm: Phân đoạn 5 (gen NP) có kích thước khoảng 1556 bases, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP), chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. NP có đặc tính kháng ngun biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA Phân đoạn 7 (gen M): có kích thước khoảng 1027 bases, mang gen mã hóa tổng hợp protein nền M1 và M2 của virus. Các protein này kết hợp với 2 kháng ngun bề mặt tạo nên lớp vỏ capsid của virus. Hai protein này được tạo ra từ cùng một phân đoạn RNA với các khung đọc mở khác nhau. Protein M1 gắn với RNA của virus và M2 có tác dụng phá vỡ vỏ bọc của virus để giải phóng các phân đoạn RNA vào tế bào chất của tế bào chủ. M2 là protein xun màng có bản chất là một kênh ion, cần thiết cho q trình xâm nhiễm của virus [36]. Sự thay thế axit amin ở vị trí 31 serin thành asparagine trên protein M2 của một số chủng H5N1 liên quan đến tình trạng kháng amantadin của virus [25] Phân đoạn 8 (gen NS) có kích thước khoảng 890 bases, ch ứa gen mã hóa cho 2 protein khơng cấu trúc của virus là NS1 và NEP (nuclear export protein) (thường được gọi là protein NS2) Độc lực của virus liên quan đến protein NS [39]. NS1 là protein có vai trị trong việc ghép nối, dịch mã và vận chuyển RNA qua màng tế bào NEP có vai trị trung gian trình v ận chuyển các ribonucleoprotein của virus (vRNPs) vào nhân tế bào chủ 1.1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A/H5N1 Chu trình tái bản của virus cúm xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mơ đường hơ hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (hình 1.3) Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A 10 Trong nhưng năm gân đây, dich cum gia câm do virus cum A/H5N1 đa xay ra ̃ ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̃ ̉ ở nhiêu n ̀ ươc, đăc biêt la cac n ́ ̣ ̣ ̀ ́ ươc trong khu v ́ ực Đông Nam A. Không chi gây bênh ́ ̉ ̣ trên gia câm, virus cum A/H5N1 con lây nhiêm va gây bênh trên ng ̀ ́ ̀ ̃ ̀ ̣ ươi v ̀ ơi ti lê t ́ ̉ ̣ ử vong rât cao. Theo T ́ ổ chức Y tế Thế giới, Viêt Nam la n ̣ ̀ ươc co sô ng ́ ́ ́ ươi t ̀ ử vong do cum A/H5N1 đ ́ ưng th ́ ứ 2 trên thê gi ́ ơi, sau Indonesia. ́ Ở nươc ta, dich cum gia câm ́ ̣ ́ ̀ A/H5N1 vân đang xay ra va co thê bung phat bât c ̃ ̉ ̀ ́ ̉ ̀ ́ ́ ứ luc nao. Khi d ́ ̀ ịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm sốt và ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng là vơ cùng quan trọng. Do đo, viêc xây d ́ ̣ ựng mơt ky tht chân đoan nhanh, ̣ ̃ ̣ ̉ ́ nhạy va chinh xac virus cum A/H5N1 la hêt s ̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ưc c ́ ấp thiêt đ ́ ể sàng lọc số lượng lớn loại virus này. Trong các kỹ thuật phân tử chẩn đốn virus cúm, phản ứng multiplex RTPCR được xem là tốt nhất cho kết quả nhanh, nhạy và chính xác cũng như tiết kiệm chi phí hố chất cho xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; BellauPojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007). Trong nghiên cưu c ́ ủa chúng tôi, ky thuât ̃ ̣ multiplex RTPCR vơi 3 căp môi ́ ̣ ̀ cho phep phat hiên đông th ́ ́ ̣ ̀ ời ca 3 trinh t ̉ ̀ ự đăc hiêu cua virus cum A (trên gen M), ̣ ̣ ̉ ́ subtype H5 (trên gen HA) va subtype N1 (trên gen NA) ̀ đa ̃được xây dựng thanh ̀ công. Kỹ thuật multiplex RTPCR được thực hiện theo phương pháp một bước (phản ứng phiên mã ngược và phản ứng khuếch đại được thực hiện trong cùng một tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy cơ ngoại nhiễm. Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm cũng được giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT và PCR thực hiện trong 2 tube riêng biệt) và kỹ thuật RTPCR phát hiện từng gen riêng biệt. Kết quả thử nghiêm cho thây ky thuât multiplex RTPCR ̣ ́ ̃ ̣ chi ̉ đăc hiêu v ̣ ̣ ơi virus cum A/H5N1 va co đô nhay cao, c ́ ́ ̀ ́ ̣ ̣ o kha năng phat hiên khi ́ ̉ ́ ̣ trong mâu th ̃ ử co t ́ ư 10 ban sao virus tr ̀ ̉ ở lên. So với kỹ thuật RTPCR phát hiện từng gen riêng biệt, đô nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng multiplex không bị giảm. Thử nghiêm trên 14 mâu bênh phâm d ̣ ̃ ̣ ̉ ương tinh v ́ ơi virus cum A/H5N1 (8 mâu thu thâp ́ ́ ̃ ̣ từ gia câm va 6 mâu t ̀ ̀ ̃ ừ người), phan ̉ ưng multiplex RTPCR đêu khuêch đai thanh ́ ̀ ́ ̣ ̀ 70 công gen H5, N1 va M cua virus. Nh ̀ ̉ ư vây, ky thuât nay co thê ̣ ̃ ̣ ̀ ́ ̉ ứng dung đê phat ̣ ̉ ́ hiên nhiêm cum A/H5N1 trên ca ng ̣ ̃ ́ ̉ ươi va gia câm. Các c ̀ ̀ ̀ ặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen M, HA và NA của các chủng virus cúm phân lập từ các vật chủ khác nhau nên kỹ thuật multiplex RTPCR cịn có thể dùng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 ở một số động vật có vú khác. Ky tht multiplex RTPCR đ ̃ ̣ ược thiêt kê v ́ ́ ơi 3 căp mơi co nh ́ ̣ ̀ ́ ưng ̃ ưu điêm ̉ vượt trôi nh ̣ ư: đơn gian hoa cac b ̉ ́ ́ ươc trong qua trinh xet nghiêm, giam th ́ ́ ̀ ́ ̣ ̉ ơi gian lam ̀ ̀ xet nghiêm va tiêt kiêm đ ́ ̣ ̀ ́ ̣ ược khoang 50% chi phi hoa chât phuc vu cho xet nghiêm ̉ ́ ́ ́ ̣ ̣ ́ ̣ Tuy phản ứng multiplex realtime RTPCR cho kết quả nhanh, nhạy và chính xác yêu cầu có máy móc đại chi phí tốn Do vậy, kỹ thuật multiplex RTPCR chúng xây dựng thuận tiện cho nhiều phịng thí nghiệm như trong nước ta hiện nay. Kết luận 1. Đã thiết kế được 3 cặp mồi đặc hiệu với 3 gen M, HA và NA dùng để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng mutiplex RTPCR 2. Đa xây d ̃ ựng thanh công ky thuât multiplex RTPCR cho phep phat hiên ̀ ̃ ̣ ́ ́ ̣ nhanh virus cum A/H5N1 v ́ ơi đô nhay va đô đăc hiêu cao va co thê ap dung đê phat ́ ̣ ̣ ̀ ̣ ̣ ̣ ̀ ́ ̉ ́ ̣ ̉ ́ hiên nhiêm cum A/H5N1 ̣ ̃ ́ ở gia câm va ng ̀ ̀ ười. 3. Ky thuât multiplex RTPCR chi đăc hiêu v ̃ ̣ ̉ ̣ ̣ ơi virus cum A/H5N1, không co ́ ́ ́ phan ̉ ưng cheo v ́ ́ ơi cac loai khac. Ky thuât co kha năng phat hiên khi trong mâu th ́ ́ ̀ ́ ̃ ̣ ́ ̉ ́ ̣ ̃ ử co t ́ ư 10 ban sao RNA tr ̀ ̉ ở lên. Kiến nghị 71 Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu vào xét nghiệm cúm A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm gia cầm và người, chúng tơi đề xuất kiến nghị như sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng multiplex RTPCR này vào phát hiện virus cúm A/H5N1 trên số lượng lớn mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm và người bị bệnh trong các vụ dịch cúm 2. Ứng dụng quy trình multiplex RTPCR phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu thu thập từ gia cầm khoẻ mạnh và mơi trường nơi đã có dịch cúm xảy ra để đánh giá sự lưu hành của virus cúm gia cầm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm tại Việt Nam, Hội nghị phịng chống dịch cúm gia cầm do Bộ Nơng nghiệp và phát triển Nơng thơn 2. Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2(1): 118 3. Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 8186 4. Tơ Long Thành (2004), “Bệnh cúm lồi chim”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2): 5358 Tiếng Anh 5. AbdelGhafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al, 2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans”, N. Engl. J. Med, 358, pp. 26173 72 6. Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004, “Atypical avian influenza (H5N1)”, Emerg Infect Dis, 10, pp. 1321 4 7. Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture” Virus Res, 79(12): 177185 8. Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in humans”, Arch. Virol., 119, pp. 3742 9. Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S, Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, N Engl J Med, 353, pp. 1374 85 10. Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to Faster Human Spread, Published 11. Butler D. (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp. 2489 12. CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks and respirators in health care settings during an influenza pandemic. 13. Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58 S64 14. Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp. 2845 50 15. Chen, H., G. Deng, Z. Li, G. Tian, Y. Li, and P. Jiao (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA, 101: p. 1045210457 16. Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al (2005), “Human disease from influenza A (H5N1)” Emerg Infect Dis, 11, pp. 201 9 17. Conenello G, Zamarin D, Perrone L, Tumpey T and Palese P (2007), “A Single Mutation in the PB1F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 Influenza A Viruses Contributes to Increased Virulence”, PLoS Pathog, 3(10), pp. 141421 18. De Jong MD, Bach VC, Phan TQ, Vo MH, Tran TT, Nguyen BH, Beld M, Le TP, Truong HK, Nguyen VV, Tran TH, Do QH, Farrar J (2005), “Fatal avian 73 influenza A (H5N1) in a child presenting with diarrhea followed by coma”, N Engl J Med, 352, pp. 68691 19. De Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM, Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Ha DQ, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12, pp. 1203 07 20. De Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC, Bach VC, Phan TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J (2005), “Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection”, N Engl J Med, 353, pp. 266772 21. Drake J W (1993), “Rate of spontaneous mutation among RNA viruses”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90(9): 41714175 22. Duan L, Bahl J, Smith G, et al. (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 19962006”, Virology, 380, pp. 24354 23. Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, et al. (2006), “Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses”, Virology; 344:432438 24. Greninger A (2004), The Definition and Measurement of Dangerous Research 25 Guan Y, et al (2004), “H5N1 influenza: A protean pandemic threat”, PNAS, 101(21), pp. 815661 26 Guan Y, et al (2002), “Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR”, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, pp. 8950–5 27 Hamada S., Suzuki Y., Suzuki T., et al (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A virus to humantype receptors”, Nature, 444(7117), pp.37882 28. Harder T. C. and Werner O. (2006), “Avian Influenza”, Influenza, Report 2006 29 Hatta M., et al (2007), Growth of H5N1 Influenza A Viruses in the Upper Respiratory Tracts of Mice, PLoS. Pathog 74 30. Hoa, L.T., D.D. Khang, P.V. Chi, N.V. Hai, T.N. Hai, N.T.B. Nga, and L.T. Binh (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 – 2006”, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture , p. 6871 31. Hui DS (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection”, Respirology, 13(suppl 1):S10S13 32 International Committee on Taxonomy of Viruses Index of Viruses (2009), Orthomyxoviridae, In: ICTVdB The Universal Virus Database, version 7. B#chenOsmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA 33 Julkunen I, Pyhala R, Hovi T, 1985, Enzyme immunoassay, complement fixation and hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and B virus infections”, Purified hemagglutinin in subtypespecific diagnosis, J. Vir.Methods. 10, 7584 34 Kandun IN, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen, Hadisoedarsuno W, et al. (2006), “Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005”. N. Engl. J. Med, 355, pp. 218694 35. Katz JM, Lim W, et al. (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of antiH5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, pp. 176370 36. Lamb RA and Krug RM (2001), “Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication”, Fields Virology, 4th Edition, (D.M. Knipe and P.M. Howley, eds), pp 14871531. 37. Lamb RA (1989), Genes and proteins of the influenza viruses. In: Krug R M, editor. The influenza viruses. 1st ed. New York, N.Y: Plenum Press 38. Le, Q., M. Kiso, K. Someya, Y. Sakai, T. Nguyen, K. Nguyen, N. Pham, H Nguyen, S. Yamada, Y. Muramoto, T. Horimoto, A. Takada, H. Goto, T. Suzuki, Y. Suzuki, and Y. Kawaoka (2005), “Avian flu: isolation of drug resistant H5N1 virus”. Nature, 437(7062): p. 1108 75 39 Lee C. W., Suarez D., Tumpey T., et al (2005), “Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”, Journal of Virology, 79(6), pp. 36923702 40. Luong, G. and P. Palese (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop, 2: p. 7781 41. Ng EK, Cheng PK, Ng AY, Hoang TL, and Lim WW (2005), “Influenza A H5N1 detection”, Emerg. Infect. Dis., 11, pp. 13035 42. Rowe T, Abernathy RA, HuPrimmer J, et al (1999), Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays, J Clin Microbiol, 37(4), pp. 937 43 43. Sastre A (2006), Antiviral Response in Pandemic Influenza Viruse, CDC, vol 12 number 1 44. Senne, DA, Panigrahy, B, Kawaoka, Y, Pearson, JE, Suss, J, Lipkind, M, Kida, H and Webster, RG (1996), “Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential”, Avian Diseases, 40: 425437 45. Swayne DE and Halverson DA (2007), Diseases of Poultry: Influenza, 12th edn. Ames, IA: Blackwell Publishing Professional 46. Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y, Yamada S, SakaiTagawa Y, Macken C, Kawaoka Y (2009), “Phylogenetic characterization of H5N1 avian influenza viruses isolated in Indonesia from 20032007”, Virology, 390, pp. 1321 47. Tran TH, Nguyen TL, Nguyen TD, Luong TS, Pham PM, et al (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, pp. 117988 48 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A. Kongchanagul, K. Ungchusak, S. Angkasekwinai, K. Chokephaibulkit, K. Srisook, N Vanprapar, and P Auewarakul (2007), “Apoptosis and 76 pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis, 13(5): p. 708712 49. WHO intercountryconsultation, influenza A/H5N1 in humans in Asia: Manila, Philippines, 67 May 2005 50 World Health Organization (2009), Continuing progress towards a unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses 51. Xu C, Dong L, Xin L, Lan Y, Chen Y, Yang L, Shu Y (2009), “Human avian influenza A (H5N1) virus infection in China”, Science, 52, pp. 407–11 52 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, SakaiTagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses humantype receptors”, Nature, 444(7117): 378382. 77 MỤC LỤC 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1.1 Phân loại virus cúm .3 1.1.1.2 Phân loại virus cúm A/H5N1 1.1.1.3 Danh pháp virus cúm Virus cúm A tương đối nhạy cảm với tác nhân vật lí hay hóa học Các hạt virus tồn thích hợp khoảng pH từ 6.5 đến 7.9 Ở pH acid hay kiềm, khả lây nhiễm virus bị giảm mạnh Lớp vỏ virus chất lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ bị phá hủy dung mơi hịa tan lipid, chất tẩy rửa chất sát trùng: formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng hydroxylamine Virus bị bất hoạt ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn 15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt virus không phá hủy kháng nguyên virus Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn toàn 100oC 60oC/30 phút, tồn tháng nhiệt độ thấp (trong phân gia cầm), tới hàng năm nhiệt độ bảo quản (-70oC) Trong phủ tạng gia cầm (40oC), virus tồn 25-30 ngày tồn - ngày nhiệt độ thể người (37oC); nước, virus sống tới ngày nhiệt độ 30oC 16 1.2 CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 17 1.2.2.1 Các phương pháp xét nghiệm phát cúm A/H5N1 18 1.2.2.2 Chẩn đoán 24 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 78 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình Cấu 1.1 trúc virus cúm A Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein virus cúm A/H5N1 Hình 1.3 Chu trình tái virus cúm A… 10 Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các lồi vật chủ của virus cúm A 13 Bảng 2.1: Các thành phần phản ứng RT PCR 33 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng RT PCR 33 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng multiplex RT PCR .37 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT PCR 38 Bảng 3.1: Cặp mồi phát gen M virus cúm A 43 Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát gen M virus cúm A .43 79 Bảng 3.2: Cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5N1 44 Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5 .45 Bảng 3.3: Cặp mồi phát gen NA virus cúm A/H5N1 46 Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát gen NA virus cúm A/N1 46 Bảng 3.4: Trình tự mồi được lựa chọn để thực phản ứng RT PCR… 47 Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RTPCR phát gen riêng biệt 49 Hình 3.5 Ảnh kết điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT PCR .50 Hình 3.6 Ảnh điện di kết tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 51 Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD RNA gen M, HA NA 51 Hình 3.7 Ảnh điện di đánh giá độ nhạy phản ứng RT PCR 52 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RTPCR phát gen M 53 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt phản ứng RTPCR phát gen M .54 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RTPCR phát gen H5 54 80 Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RTPCR phát gen H5 54 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RTPCR phát gen N1 55 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RTPCR phát gen N1 55 Hinh 3.8: ̀ Ảnh điện di tôí ưu nhiệt độ gắn mồi cho phan ̉ ưng ́ multiplex RT PCR 56 Hình 3.9 Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT PCR 57 Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT PCR 58 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT PCR 59 Hinh ̀ 3.12: Thử nghiêm ̣ đanh ́ giá độ nhaỵ cuả phan̉ ưng ́ multiplex RT PCR… .59 Hinh ̀ 3.13: Ảnh điện di đanh ́ giá độ đăc̣ hiêu ̣ cua ̉ phan ̉ ưng ́ multiplexRT PCR .60 Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT PCR 60 Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RTPCR ……………………….61 Hinh ̀ 3.14: Kêt qua th ́ ̉ ử nghiêm ̣ phan ̉ ưng ́ multiplex RTPCR trên mâu bênh phâm ̃ ̣ ̉ dương tính………………………………………………………………………………… 62 Hình 3.15: Kêt qua th ́ ̉ ử nghiêm ̣ phan ̉ ưng ́ multiplex RTPCR phát hiện virus cúm gia c ầm A/H5N1 phâm………………………………………….63 ̉ 81 số mẫu bênh ̣ Hinh ̀ 3.16: Kêt qua th ́ ̉ ử nghiêm ̣ phan ̉ ưng ́ RTPCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bênh phâm………………………………………………….… ̣ ̉ 64 Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RTPCR và multiplex RTPCR m ẫu bệnh phẩm……………………………………………………………………… 64 Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hố chất làm xét nghiệm giữa phản ứng multiplex RTPCR RTPCR……………………………………………………………… 65 CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair DEPCtreated water: Diethylpyrocarbonate treated water DNA: Deroxi ribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Etilendiamin tetraaxetic acid 82 HA (H): Haemagglutinin LB: LuriaBertani media M: Matrix protein NA (N): Neuraminidase NP: Nucleoprotein NS: Nonstructural protein PA: Polymerase A protein PB: Polymerase B protein RTPCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic acid TBE: Tris Base, Acid Boric, EDTA vRNP: Viral ribonucleoprotein LỜI CẢM ƠN! Với tấm lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình, chu đáo của GS.TS Lương Xn Hiến Trường Đại học Y Thái 83 Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Nam Thắng và các thầy cơ trong Trung tâm dịch vụ Khoa học kỹ thuật Y dược Trường Đại học Y Thái Bình đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn này Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cơ giáo trong Khoa Sinh học Trường Đại học khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội đã giảng dạy, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học Cuối cùng tơi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, các thầy cơ trong Bộ mơn Sinh học Trường Đại học Y Thái Bình, gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện cho tơi đi học và động viên tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn này. Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2011 Học viên Trần Thị Tình 84 ... thuật? ?này? ?trong? ?chẩn đốn? ?cúm? ?A/H5N1. Chính vì vậy, chúng tơi thực? ?hiện? ? ? ?Nghiên? ?cứu? ?xây? ?dựng? ?quy? ?trình? ?phát? ?hiện? ?nhanh? ?virus? ?cúm? ?gia? ?cầm? ?A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ? ? thuật Multiplex Reverse Transcription. .. hố vào? ?phát? ?hiện? ?cúm? ?A/H5N1? ?trên? ?mẫu? ?bệnh? ?phẩm, chúng tơi thực? ?hiện? ?phản ứng trên cả ? ?mẫu? ?bệnh? ?phẩm? ?đã xác định dương tính với? ?cúm? ?A/H5N1? ?và? ?mẫu bệnh? ?phẩm? ?thu thập từ ? ?gia? ?cầm? ?bị? ?bệnh? ?trong? ?các vụ... nghiệm phải? ?nhanh? ?[34]. Các? ?kỹ? ? thuật? ?xét nghiệm có thể áp dụng? ?trong? ?chẩn đốn? ?virus? ?cúm? ?A/H5N1? ?bao gồm: phân lập? ?virus; ? ?phát? ?hiện? ?kháng ngun;? ?phát? ? hiện? ?RNA của? ?virus? ?bằng? ?kỹ? ?thuật? ?RTPCR, realtime RTPCR và? ?phát? ?hiện? ?sự