Paraquat (viết tắt của paraquaternary bipyridyl) là một thuốc diệt cỏ giá thành rẻ, hiệu quả diệt cỏ dại nhanh chóng, ít ảnh hưởng tới môi trường do đó hiện đang được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam với nhiều tên thương mại khác nhau. Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại là một chất hóa học vô cùng độc với người. Liều tử vong của PQ ước tính là khoảng 10 ml dung dịch 20%. Tại nhiều nước phát triển, PQ đã bị cấm sử dụng nhưng ở Việt Nam việc thiếu các chính sách và biện pháp quản lý sử dụng hóa chất này nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1]. Trên thế giới, nhiều ca tử vong do ngộ độc PQ đã được báo cáo
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paraquat 1.1.1 Công thức paraquat 1.1.2 Tính chất lý, hóa học paraquat 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat 1.1.4 Dược động học paraquat 1.1.4.1 Hấp thu .6 1.1.4.2 Phân bố .6 1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ 1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết tương 1.2 Các phương pháp xác định paraquat huyết tương 1.2.1 Phương pháp quang phổ 1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phở 10 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ .11 1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao .13 1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat .15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 19 2.2.1 Chất chuẩn .19 2.2.2 Hoá chất 19 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu .21 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat 21 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn .21 2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương .21 2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ huyết tương 21 2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ huyết tương 22 2.3.2.1 Tính chọn lọc 22 2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính .23 2.3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng 23 2.3.2.4 Đánh giá độ độ chụm 23 2.3.2.5 Độ ổn định 23 2.3.3 Phân tích PQ mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ 24 2.3.3.1 Đối tượng nghiên cứu .24 2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu cao 26 3.1.1 Xác định bước sóng phát chất phân tích với detector DAD 26 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích mẫu tiêm vào cột .26 3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động 28 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động 29 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH pha động 31 3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm .33 3.1.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ natriheptanesulfonate 33 3.1.6.2 Ảnh hưởng nồng độ KCl 35 3.1.6.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ PEG 36 3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ dòng 37 3.1.8 Đường chuẩn, giới hạn phát giới hạn định lượng .39 3.1.8.1 Xây dựng đường chuẩn 39 3.1.8.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 41 3.1.8.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn .42 3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 45 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch TCA 45 3.2.2 Khảo sát thời gian lắc xoáy 46 3.2.3 Khảo sát độ ởn định mẫu phân tích .48 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 49 3.3.1 Đánh giá độ chọn lọc 49 3.3.2 Đánh giá độ phương pháp 49 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi phương pháp 49 3.3.2.2 Đánh giá độ phương pháp phân tích 50 3.3.3 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại 51 3.3.3.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị .51 3.3.3.2 Đánh giá độ chụm phương pháp phân tích 53 3.3.4 Độ ổn định 56 Độ ổn định thời gian phân tích 56 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ .56 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 56 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ .58 KẾT LUẬN 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 ĐẶT VẤN ĐỀ Paraquat (viết tắt paraquaternary bipyridyl) thuốc diệt cỏ giá thành rẻ, hiệu diệt cỏ dại nhanh chóng, ảnh hưởng tới mơi trường sử dụng rộng rãi Việt Nam với nhiều tên thương mại khác Tuy nhiên, paraquat (PQ) lại chất hóa học vô cùng độc với người Liều tử vong PQ ước tính khoảng 10 ml dung dịch 20% Tại nhiều nước phát triển, PQ bị cấm sử dụng Việt Nam việc thiếu sách biện pháp quản lý sử dụng hóa chất nên năm vừa qua có nhiều trường hợp ngộ độc PQ đến cấp cứu [1] Trên giới, nhiều ca tử vong ngộ độc PQ báo cáo [10][19][27] Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, năm gần đây, số lượng bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng trở thành vấn nạn vô cùng nghiêm trọng, vượt ngưỡng 300 ca năm 2013 năm 2014 lên tới 391 ca Tỉ lệ tử vong ngộ độc PQ cao, thường khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu tác giả nước [29][32] Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bệnh viện Bạch Mai, tỉ lệ tử vong năm 2007 72,5% [4], năm 2011 72,9% [2], nghiên cứu bệnh viện Chợ Rẫy thành phố Hồ Chí Minh 85% Trong chẩn đốn điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lượng PQ huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu biện pháp điều trị, đặc biệt lọc máu hấp phụ Tỷ lệ tử vong ngộ độc cấp PQ cao thiếu biện pháp điều trị hiệu Gần đây, nghiên cứu nhiều tác giả nước số tác giả Việt Nam cho thấy kĩ thuật lọc máu mới, lọc máu hấp phụ cột than hoạt cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho kết khả quan, cứu sống số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ Xét nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu biện pháp điều trị tăng thải trừ Tuy nhiên, Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng mức độ định tính nước tiểu phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc PQ mà chưa có sở xét nghiệm thực việc định lượng nồng độ PQ máu với kết đáng tin cậy Điều dẫn đến khoảng trống lớn chẩn đoán, tiên lượng đánh giá hiệu biện pháp lọc máu làm cho việc điều trị ngộ độc PQ Trung tâm Chống độc khoa hồi sức cấp cứu nước gặp nhiều khó khăn Để định lượng PQ huyết tương giới áp dụng phương pháp sắc ký khí khối phở (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu cao để xét nghiệm độc chất chưa có quy trình chuẩn định lượng PQ huyết tương Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu định lượng Paraquat mẫu huyết tương người phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” với hai mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách Paraquat huyết tương người phân tích HPLC để định lượng paraquat Xác định giá trị sử dụng phương pháp áp dụng định lượng paraquat huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paraquat 1.1.1 Công thức paraquat Paraquat từ viết tắt paraquaternary bipyridyl, tên khoa học 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium thuốc diệt cỏ phở biến đặc tính diệt cỏ nhanh triệt để PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc bipyridylium, tổng hợp vào năm 1882, ứng dụng nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ năm 1950 [42] PQ có khối lượng phân tử tương đối 186,2 có cơng thức hóa học hình 1.1: Hình 1.1: Cơng thức hóa học paraquat 1.1.2 Tính chất lý, hóa học paraquat PQ thường có màu trắng vàng, khơng mùi, tỷ trọng 20 oC 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180 oC, điểm sôi khoảng 300oC pH dung dịch PQ nước 6,5 - 7,5 PQ thường dạng dimethylsulphate dichloride Dạng dichloride tinh thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa PQ ổn định dung dịch môi trường acid trung tính khơng ởn định môi trường kiềm PQ tan tốt nước (độ tan 700 g/l 20 oC), tan cồn không tan dung môi hữu khác PQ bị phân hủy ánh sáng UV, bị bất hoạt tác nhân hoạt động bề mặt anionic đất sét, bị hoạt tính nhanh tiếp xúc với đất PQ không bay Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, thiếc, sắt mạ kẽm nhôm [43] PQ sản xuất nhiều công ty khác với tên thương mại hàm lượng khác nhau, nói chung thường đều dạng dung dịch màu xanh Một số tên gọi thường gặp PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone, Owen [42] Do độc tính gây tử vong cao nên hầu phát triển đều cấm sử dụng PQ loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ nước Châu Âu) Một số nước Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm lượng thấp 4,5% giúp giảm thiểu nguy bị ngộ độc Thực tế giới có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ có Việt Nam [42] Hiện Việt Nam thuốc từ cỏ PQ lưu hành dạng dung dịch 20% nguy ngộ độc cấp tính lớn Một điều đáng nói công ty sản xuất PQ lớn giới Syngenta hay còn gọi Zeneca đặt nhà máy Trung Quốc Anh Trên đất nước họ cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất sang nước thứ ba [39] 1.1.3 Cơ chế gây độc paraquat Cơ chế gấy độc PQ mô tả theo sơ đồ sau [37]: Hình 1.2 Cơ chế gây độc paraquat [15] Trong giai đoạn đầu chu trình này, ion PQ 2+ cùng với NADPH trải qua phản ứng tạo ion paraquat bị khử (PQ +) NADP+ PQ+ phản ứng với oxy tái tạo lại PQ 2+ gốc superoxid Có sẵn NADPH oxy, chu trình oxy hố - khử PQ xảy liên tục, với việc NADPH liên tục bị không ngừng tạo gốc superoxid Gốc tự superoxid sau phản ứng với thân để tạo peroxid hydro (H 2O2), với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự hydroxyl [18] [31] Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào Chu trình oxy hố - khử tạo thành gốc tự hydroxyl dẫn tới nhiều chế làm tổn thương tế bào: phản ứng với lipid màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA protein tối cần thiết cho tế bào sống sót bị gốc tự hydroxyl phá hủy [12] [39] [40] Hậu lên tế bào việc hình thành gốc tự (superoxid gốc tự khác) đối tượng nhiều nghiên cứu Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc thay đổi gốc tự chất desferioxamin, superoxid dismutase, α-tocopherol vitamin C cùng với niệu cưỡng Tuy nhiên, khơng có chất số khuyến cáo dùng Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học gốc tự do PQ sinh chưa biết người ta biết về sở để ngộ độc tương tác PQ, NADPH oxy Sau đó, mức độ tế bào, oxy yếu tố tối cần thiết cho việc hình thành bệnh lý PQ Đây sở cho việc hạn chế cung cấp oxy việc điều trị ban đầu bệnh nhân ngộ độc PQ PQ có tính ăn mòn gây tổn thương giống kiềm tiếp xúc với da, mắt niêm mạc Các quan đích chủ yếu ngộ độc toàn thân PQ đường tiêu hố, thận phởi Dạ dày, ruột bị tởn thương nặng nề tác dụng ăn mòn trực tiếp bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao Thận quan đào thải PQ DQ có nồng độ bipyridyl cao so với quan khác Riêng phổi, PQ vào phế bào týp I II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP Do PQ gây tổn thương hầu hết tất quan thể đều có liên quan đến chuyển hóa hơ hấp tế bào, nhiên vị trí hấp phụ nhiều PQ liên quan đến thải trừ PQ tởn thương đến sớm hơn, nặng nguyên nhân hàng đầu gây tử vong tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận, viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa biến chứng nhiễm trùng [6][13][37] Việc tiếp xúc với lượng PQ làm chậm nguy tử vong xơ phổi tiến triển suy thận [33] Một số nghiên cứu gần còn cho thấy phơi nhiễm PQ có liên quan với hội chứng Parkinson [21][23] Trong ngộ độc cấp PQ, tiên lượng bệnh dựa nồng độ PQ huyết tương Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua µg/ml hầu hết tử vong, nhiên vài trường hợp bệnh nhân hồi phục nồng độ máu cao µg/ml [7][10][22] 1.1.4 Dược động học paraquat 1.1.4.1 Hấp thu Ở đường tiêu hoá PQ hấp thu nhanh (5-10%) Hấp thu chủ yếu ruột non Khi dày ruột bị tổn thương lan rộng, số lượng chất độc hấp thu tăng lên PQ không gắn với protein huyết tương Nồng độ đỉnh PQ huyết tương đạt vòng giờ sau uống [6] [37] Tiếp xúc qua da, hấp thu vào thể nói chung chỉ xảy tiếp xúc kéo dài da bị tổn thương Tiếp xúc với PQ qua đường hô hấp không làm cho lượng PQ hấp thu đến mức đủ để gây nhiễm độc Bởi kích thước hạt chứa PQ lớn (hầu hết 100 m) làm cho PQ không sâu xuống đường hô hấp để hấp thu [11] Mắt tiếp xúc với PQ bị tổn thương, không đủ để gây nhiễm độc toàn thân 1.1.4.2 Phân bố Sau uống, PQ phân bố nhanh chóng tới tất quan phởi, thận, gan cơ, đặc biệt phổi, PQ bị khử thành dạng gốc tự hoạt tính cao [8][22] Thể tích phân bố PQ 1,2 - 1,6 l/kg PQ đạt nồng độ cao tồn lâu phổi, nồng độ phởi cao so với nồng độ huyết tương gấp 50 lần Sau uống 5-7 giờ, nồng độ PQ tổ chức phổi đạt cao Tuy nhiên, lượng PQ huyết tương cần đạt đến ngưỡng tới hạn trình hấp thu phổi diễn [11] PQ qua thai Trong nghiên cứu, nồng độ PQ dịch ối máu dây rốn, bào thai cao nồng độ máu mẹ 4-6 lần [11] Khơng có bào thai sống sót Tuy nhiên mẹ ngộ độc PQ còn sống đến lần có thai sau khơng nguy hiểm đến bào thai 1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ PQ đào thải hoàn toàn qua thận nhờ trình lọc cầu thận trình tiết tích cực ống thận Trong vòng 12-24 giờ sau uống, 90% PQ đào thải dạng khơng đởi qua thận, chức thận bình thường [11].Tuy nhiên xét nghiệm thấy PQ nước tiểu vài ngày sau có tái phân bố PQ từ quan Thời gian bán thải PQ kéo dài 12120 giờ lâu có suy thận Ngồi PQ còn đào thải qua phân dạng không đổi [8][22] 1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết tương Tiên lượng bệnh nhân uống PQ dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo thời gian Nồng độ PQ phải đo trước điều trị biện pháp điều trị làm giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…) Proudfoot cộng [29] lần trình bày biểu đồ tiên lượng khả sống từ kết định lượng nồng độ PQ huyết tương nhiều thời điểm khác 79 bệnh nhân Những BN sống có nồng độ 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 0,1 mg/l tương ứng 4, 6, 10, 16, 24 giờ sau uống PQ Schermann cộng [35] mở rộng đường cong tiên lượng BN lên đến ngày thứ sau nhiễm độc, nghiên cứu cho thấy BN nồng độ PQ huyết tương 10 mg/l (định lượng vòng giờ), thường chết sốc tim 24h, BN có nồng độ thấp (nhưng đường tiên lượng), chết xơ phổi suy hô hấp muộn 24 giờ sau uống Suzuki cộng (1991) [36] kết hợp liệu Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann (1987), Sawada (1988) thêm nhóm 78 BN, kết luận đồ thị tiên lượng xác 101 102 trường hợp tử vong 61 63 BN sống đánh giá vòng 24 h sau uống PQ Mặc dù đồ thị xác, giúp xác định mức độ nặng tiên lượng tử vong định lượng PQ lập tức, đồ thị theo chuẩn t Mức thêm chuẩn lựa chọn để thêm vào mẫu huyết tương sau: PQ µg/ml Mỗi mẫu phân tích lặp lại 10 lần Kết biểu diễn bảng 3.16 Bảng 3.16: Kết phân tích lặp lại mẫu huyết tương thêm chuẩn Giá trị phân tích lại (µg/ml Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 10 1,99 2,05 2,0 1,97 2,0 2,04 1,99 1,98 2,02 1,99 ) PQ Từ kết trên, sử dụng phần mềm minitab 16, chúng tơi tính tốn đại lượng thống kê bảng 3.17 Bảng 3.17: Các đại lượng thống kê PQ Giá trị phân tích Độ lệch chuẩn Sai số lại trung bình tương đối tương đối (µg/ml) (%) (%) 2,01 0,5 0,5 Kết so ttính sánh với tbảng (P=0,95; f=9) = 2,26 0,37 ttính < tbảng Đối với phương pháp phân tích PQ cho kết ttính < tbảng chứng tỏ sai khác giá trị phân tích lại giá trị thêm chuẩn khơng có ý nghĩa thống kê Hay nói cách khác, phương pháp phân tích khơng mắc sai số hệ thống dùng phương pháp để phân tích định lượng PQ mẫu huyết tương 52 3.3.3 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại 3.3.3.1 Đánh giá độ lặp lại thiết bị Với hệ máy có độ nhạy cao ởn định lặp lại đóng vai trò quan trọng phân tích Lặp lại tốt cho độ xác tốt, phạm vi cho phép Đối với hệ máy sắc ký, lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình tách, yếu tố quan trọng định hiệu phân tích độ lặp thiết bị, bao gồm độ lặp diện tích pic thời gian lưu Bảng 3.16 chỉ độ lặp lại hệ sắc ký chọn về diện tích pic thời gian lưu Q trình khảo sát thực điều kiện cố định sau: - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Detector UV-VIS: bước sóng 259 nm - Hệ dung mơi pha động: ACN – dung dịch đệm chứa 1,1mg/ml natri heptanesulfonate; mg/ml KCl; 0,2 %v/v PEG; 0,05% triethyamine điều chỉnh pH = 2,5 H3PO4 - Chế độ pha động đẳng dòng ACN - Đệm: - 95 %v/v - Thể tích mẫu tiêm: 30 µl Mỗi dung dịch bơm lần vào cột để xác định độ lặp diện tích pic thời gian lưu Kết biểu diễn bảng 3.18: Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lưu diện tích pic chất 1,00 µg/ml Lần Trung 5,00 µg/ml 10,00 µg/ml Diện tích Thời gian Diện tích Thời gian Diện tích Thời gian pic lưu pic lưu pic lưu (mAU) 200,95 198,34 205,88 201,52 209,69 203,28 (phút) 11,87 11,98 11,94 11,89 11,96 11,93 (mAU) 1023,57 1025,05 1026,18 1025,97 1033,30 1026,81 (phút) 11,85 11,94 11,86 11,81 12,02 11,90 (mAU) 2058,56 2061,04 2062,44 2049,53 2053,04 2056,92 (phút) 11,99 12,00 11,94 12,02 12,01 11,99 53 bình RSD 2,21 (%) 0,39 0,37 0,70 0,27 0,25 Kết cho thấy giá trị RSD < 3% chứng tỏ điều kiện hệ thống sắc ký HPLC lựa chọn ổn định, phù hợp để định lượng PQ 3.3.3.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp) phương pháp phân tích Để xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích, chúng tơi tiến hành đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại tái lặp Thơng thường, q trình đánh giá thực thiết bị khác cho kỹ thuật viên khác cùng thực phép thử nghiệm Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn phương pháp đổi kỹ thuật viên Mẫu huyết tương thêm chuẩn µg/ml Mẫu xử lý mục 3.3.4 phân tích hệ thống HPLC Quá trình phân tích thực song song với mẫu khơng thêm chuẩn Từ đó, xác định nồng độ PQ thêm vào dựa phương trình đường chuẩn Mỗi kỹ thuật viên làm lặp lại 10 lần Kết thể bảng 3.19: Bảng 3.19: Kết hàm lượng PQ tìm lại phương pháp thêm chuẩn kỹ thuật viên khác STT KTV-1 (µg/ml) KTV-2 (µg/ml) KTV-3 (µg/ml) 1,99 1,99 2,01 2,00 1,99 2,00 2,00 1,97 2,00 2,00 1,97 1,97 1,99 1,98 1,98 2,00 2,02 1,98 2,00 1,98 2,00 1,98 1,98 2,01 1,98 2,00 2,00 54 10 2,00 2,01 2,00 Từ kết trên, sử dụng phần mềm minitab 16, thu bảng kiện thống kê bảng 3.20 Bảng 3.20: Các kiện thống kê đánh giá độ lặp lại phương pháp phân tích tiến hành ba KTV khác Đại lượng đánh giá Xtb Độ lệch chuẩn lặp lại (SD) Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (% RSD) Sai số tương đối (ER) (%) (so với giá trị mẫu chuẩn) Phương sai KTV-1 1,99 0,01 0,45 KTV-2 1,98 0,02 0,75 KTV-3 1,99 0,01 0,65 -0,35 -0,55 -0,20 0,000081 0,000225 0,000169 Như vậy, vào giá trị % RSD KTV kết luận, phép định lượng PQ, độ chụm (hay độ lặp lại) KTV-1 tốt KTV-2 Tuy nhiên, giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ ba KTV làm thí nghiệm đều cho độ chụm (độ lặp lại) tốt Dựa vào sai số tương đối giá trị trung bình tìm giá trị μ kết luận kết phân tích ba KTV đều mắc sai số hệ thống âm Độ đánh giá qua sai số tương đối cho thấy kết phân tích PQ KTV-3 tốt KTV-2 Tuy nhiên, ba giá trị sai số tương đối đều thấp (< 1%), chứng tỏ KTV đều làm Nói cách khác, kết phân tích ba KTV đều xác (độ chụm tốt, độ cao) Từ kết bảng 3.20, chúng tơi tiếp tục tính tốn độ lệch chuẩn tái lặp PTN theo công thức: - Phương sai cùng mẫu (within-sample estimation of variance): = 55 - Trung bình tập hợp - Phương sai mẫu (between-sample estimation of variance): - Phương sai tái lặp S2R= S2L + = MSwithin + MSbetween - Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối %RSDR = 100.SR/ (%) - Dùng công thức trên, thu kết bảng 3.21 Bảng 3.21: Các kiện đánh giá độ tái lặp phương pháp phân tích Đại lượng Phương sai cùng mẫu MSwithin PQ 0,000158 Trung bình tập hợp 1,99 Phương sai mẫu MSbetween 0,000037 Phương sai tái lặp Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối 0,000195 (% RSDR) 0,70 Nhận xét thấy, giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích nhiều phòng thí nghiệm khác 3.3.4 Độ ổn định Trong phạm vi để tài, tiến hành đánh giá độ ổn định PQ huyết tương thời gian phân tích thời gian bảo quản 56 Độ ổn định thời gian phân tích Chuẩn bị mẫu PQ huyết tương trắng nồng độ µg/ml, xử lý mẫu tiến hành sắc ký tiếp tục giờ lần vòng giờ Nồng độ đo sau giờ cho bảng sau Bảng 3.22: Kết xác định độ ổn định ngày Giờ Mẫu 1(µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) 2,0 2,0 2,0 RSD 1,99 1,99 1,98 1,98 1,98 0,402 2,00 2,00 1,99 1,98 1,97 0,851 2,00 2,03 1,99 1,98 1,98 0,601 (%) Nhận xét thấy, giá trị RSD nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp có độ tái lặp tốt giá trị sử dụng cao, ứng dụng để phân tích thời điểm khác sau xử lý mẫu vòng tiếng 3.4 Phân tích mẫu PQ huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ 3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: 31 bệnh nhân ngộ độc PQ đủ tiêu chuẩn chọn vào nghiên cứu Trong 16 bệnh nhân (BN) nam (51,6%) 15 BN nữ (48,4%) 57 70% 60% 50% 40% 65% 30% 20% 10% 19% 16% 0% < 18 tuổi 18-50 tuổi > 50 tuổi Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm t̉i Trong nhóm BN nghiên cứu, t̉i thấp 14 t̉i, t̉i cao 63 t̉i, trung bình: 32,1 15,2 Ngộ độc PQ hay gặp độ tuổi lao động 18-50 tuổi (64,5%) Đặc điểm phân bố nhóm t̉i BN nghiên cứu tương tự nghiên cứu trước tác giả Đặng Thị Xuân, Nguyễn Thị Dụ [4] Vũ Mai Liên [2] Trung tâm chống độc Đáng ý 16,1% BN ngộ độc PQ tuổi thiếu niên Phân bố bệnh nhân theo nghề nghiệp chỉ hình 3.18 40% 35% 30% 25% 20% 15% 36% 26% 26% 10% 5% 0% 07% làm ruộng học sinh sinh viên công nhân 07% hành khơng việc làm Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệp 58 Trong số bệnh nhân nghiên cứu, nghề làm ruộng chiếm tỉ lệ cao 11 bệnh nhân (35,5%) phù hợp với việc PQ dùng nơng nghiệp nên sẵn có nông thôn Học sinh, sinh viên chiếm tỉ lệ cao thứ hai (25,8%) đáng quan tâm Khi xem xét về nguyên nhân ngộ độc, hầu hết BN nghiên cứu ngộ độc tự tử (29 bệnh nhân - 93,6%) Chỉ có BN tai nạn (6,4%), BN bất cẩn phun thuốc, BN uống nhầm Trong sản phẩm thương mại PQ BN gia đình mang đến viện, Gfaxone 20SL hay gặp nhất, ngồi có số tên sản phẩm khác: Gramoxone, Fansipan, Tungmaxone, Cỏ cháy 26% Sống Tử vong 74% Hình 3.19: Kết bệnh nhân ngộ độc Paraquat 3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương tiên lượng bệnh nhân đánh giá hiệu lọc máu hấp phụ Thời gian từ lúc BN uống PQ lấy mẫu xét nghiệm trình bày bảng 3.23 Trung bình thời gian từ lúc uống đến lúc lấy mẫu xét nghiệm 6,6 ± 4,23 giờ Thời gian ngắn giờ, nhiều 23 giờ Thời gian lấy mẫu sau uống chủ yếu giờ (74,2%) 59 Bảng 3.23: Thời gian từ lúc uống đến lấy mẫu xét nghiệm Thời gian Số bệnh nhân Tỉ lệ % ≤ giờ 3,2 >2 - giờ 22,6 >4 - giờ 12 38,7 Sau giờ 11 35,5 Nồng độ Paraquat huyết tương vào viện: Áp dụng quy trình phân tích xây dựng được, xác định nồng độ PQ huyết tương Mỗi mẫu phân tích lặp lại lần Kết thu bảng 3.24 Giá trị nồng độ PQ huyết tương trung bình 8,1 µg/ml (thấp nhất: 0,215 µg/ml; cao 88,66 µg/ml) 60 Bảng 3.24: Kết định lượng PQ 31 bệnh nhân Dinh Thi P 18 Kieu Anh V 21 Thời gian Giới uống Vào đến viện XN Nữ 18,68 Nam 21,48 Hoang Van G 60 Nam 38,98 Nguyen T Hong T 42 Nữ 8,6 9,77 S T T Bệnh nhân Tuổi Kết định lượng PQ (µg/ml) Sau HP1 Trước HP2 Sau HP2 Trước HP3 Sau HP3 0,05 0,12