Sử dụng một số hệ IZOZYM để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam

Sử dụng phương pháp nghiên cứu phổ izozym esteraza bằng điện di trên gel polyacrylamid theo gradien nồng độ 8-16% đã thành công trong việc phân loại các loài và dòng khác n[r]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

Q

SỬ DỤNG M ỘT SỐ HỆ IZOZYM B Ê NGHIÊM • • • cứu

ĐA DẠNG D I TRUYỂM ỏ m ộ t s ố LO À I CÂY DƯỢC U Ệ U

BẢN B ỊA Ỏ V IỆ T MAM MẢ SỐ: QT - 04 -15

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: THS HỒNG THỊ HỊA

Các cán tham gia: TS Đinh Đoàn Long KTV Trần Thị Nhuận ThS Phạm Thanh Huyền

BÁO CÁO TÓM TẮT 1.Tên đề tài:

SỬ DỤNG MỘT SỐ HỆ IZOZYM ĐỂ NGHIÊN c ứ u ĐA DẠNG DI TRUYỂN ở

MỘT SỐ LOAI CÂY DƯỢC LIỆU BẢN ĐỊA Ở VIỆT NAM

# Mã số: QT - 04 - 5

2 Chủ trì đề tài: ThS Hồng Thị Hoà 3 Các cán tham gia: TS Đinh Đoàn Long

KTV Trần Thị Nhuận ThS Phạm Thanh Huyền

4 Mục đích nội dung nghiên cứu:

Mục đích:

Góp phần xác định tính đa hình di truyền, dấu chuẩn di truyền phân loại loài mối quan hệ di truyền số loài dược liệu địa Việt Nam

Nội dung nghiên cứu:

- Chọn thu thập mẫu (Lựa chọn số dược liệu địa Việt Nam cịn nghiên cứu) Đã chọn hai loài thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) diệp hạ châu (Phyllanthus

urinaria L.); thu thập mẫu số vùng miền Bắc Việt Nam).

- Xử lý mẫu

- Chạy điện di, nhuộm theo phương pháp phân tích hệ izozym Superoxide dismutaza (SOD), Esteraza (EST), peroxidaza (PO), chụp ảnh mẫu

- Phân tích số liệu - Viết báo cáo

5 Các kết đạt được:

Vê mặt khoa học:

- Tổng quan có chọn lọc nghiên cứu nước đối tượng nghiên cứu nghiên cứu izozym số đối tượng khác

- Kết cho thấy sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST PO để đánh giá mức độ đa dạng, khoảng cách di truyền phân loại nhanh loài Phyỉlanthus amarus Phyỉỉanthus urinaria từ còn nhỏ (đặc biệt hệ izozym SOD) Phát quần thể Phyllanthus

urinaria L Nội Bài - Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang băng đặc trưng

của lồi Phylỉanthus amarus Có thể lai lồi Phylìanthus

amarus Phỵllơnthus urinaria L. Sản phẩm:

- Báo cáo tổng kết đề tài

- Một phần kết nghiên cứu công bố báo khoa học (1 tiếng Việt tiếng Anh)

Vê mặt đào tạo:

- Đào tạo cử nhân Sinh học: Sinh viên Cao Lệ Quyên lớp Sinh K46A

với đề tài khoá luận liên quan đến nội dung đề tài QT-04-15, bảo vệ tốt nghiệp đạt 9,5 điểm

- Khả ứng dụng

Kết nghiên cứu sở khoa học góp phần phân loại hai loài cây thuốc diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) thu thập miền Bắc Việt Nam.

6 Tình hình kinh phí đề tài:

Tổng kinh phí để tài: 16.0Ơ0.000 VNĐ

- Chi phí nghiệp vụ chun mơn dụng cụ, hố chất 6,740.000 VNĐ

- Chi phí thuê mướn, thuê lao động 6.000.000 VNĐ

- Quản lý phí, hỗ trợ đào tạo nghiên cứu khoa học 1.120.000 VNĐ

- Thanh toán điện nước 640.000 VNĐ

- Nghiệm thu để tài, in , mua tài liệu 1.500.000 VNĐ

Đã toán

SUMMARY

a) The title of subject: Using some isoenzyme systems to assess the genetic diversity of some Vietnamese native medicinal plants

b) Numberical code: QT- 04-15

c) The g ran t holder: M.Sc Hoang Thi Hoa d) The Participants: Dr Dinh Doan Long

M.Sc Pham Thanh Huyen Tech Tran Thi Nhuan

e) Objectives and contents:

* Objectives: The two native medicinal plant species Phyllanthus

amarus Schum Et Thonn and Phyllanthus urinaria L are colecting

from different areas in the north of Vietnam

* Contents: In Vietnam, Phyllanthus amarus Schum Et Thonn and

Phyllanthus urinaria L are the two most well-known medicinal plants

among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae These medicinal plants have been used for centuries in the traditional medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra, hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite

Recently, numerous pharmaceutical products derived from these two plant species, e.g Livbilnic (Traphaco Co Ltd), VG-5 (Central pharmaceutical company N05), Hepaphyl (Central pharmaceutical company 25), Hepamarin, Livsin-94 (Haphaco) etc have been commercialized and widely used in clinical treatment of liver ailments, including the hepatitis B infection

In order to assess the genetic diversity of these medicinal plants and to establish a method for rapid identification of these two plant species, we performed the analysis of some isozyme markers: Izozym Superoxide

dismutaza (SOD), Izozym Esteraza (EST), Izozym Peroxidaza (PO) The study revealed that the SOD, EST, PO isozymes profile of the two species are

obviously distinct All collected samples of p amarus accessions were

specified by electrophoretic markers of SOD isozyme at Rfs that are equal to 0.63; 0.71 and 0.75; EST isozyme at Rfs are 0,09; 0,42; PO isozyme at Rfs are 0,85; 0,87 Whereas, these markers were absent from most of p urinaria samples, except for some seemingly interspecific forms

g) The obtained results:

In conclusion, our study indicated that the analysis of SOD, EST, PO isozyme markers might be used as a simple and cost-effective technique for assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two medicinal plant species - Phyllanthus amarus Schum Et Thonn and

Phyllanthus urinaria L.

XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI

PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa ThS Hoàng Thị Hoà

XÁC NHẬN CỦA TRƯỜNG

PHÓ HiỆb IRƯÓNB

PŨS.T s dí)ù.L ^ỈẰuiL^Ối.

MỤC LỤC

Mở đầu

Nội dung đề tài 7

TThương Tổng quan tài liệ u 7

1 Các nghiên cứu Phyllanthus L

1.1 Phân loại học thực vật tên gọi

1.2 Hình thái học, tế bào học phân b ố

1.3 Phân bố sinh thái

1.4 Sử dụng Phylỉanthus L y học cổ truyền

1.5/Thành phẩn hoá học Phyllanthus L

1.6 Các nghiên cứu tác dụng dược lý Phyllanthus L

1.7 Các dược phẩm bào chế từ p amarus p urinaria 10

2 Đại cương izozym 11

2.1 Izozym Superoxide dismutaza (SOD E c.1.15.1.1) 13

2.2 Izozym Esteraza (EST E.C.3.1.1.2) 14

2.3 Izozym Peroxidaza (PO E.c 1.1.1.17) 14

Chương Vật liệu phương pháp 16

2.1 Vật liệu thực v ậ t 16

2.2 Phương pháp phân tích đa hình izozym 18

2.2.1 Phương pháp thu m ẫ u 18

2.2.2 Phương pháp nghiền m ẫ u 19

2.2.3 Phương pháp điện d i 19

2.2.4 Phương pháp phân tích kết nghiên c ứ u 19

Chương Kết thảo lu ậ n 21

3.1 Phổ điện di hệ izozym SOD c ủ a 21

3.2 Phổ điện di hệ izozym E S T 25

3.3 Phổ điện di hệ izozym P O 27

3.4 Quan hệ di truyền quần t h ể 31

Kết L u ậ n 32

Tài liệu tham k h ả o 33

MỞ ĐẨU

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) diộp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) ià hai loài thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ Ẽuphorbiaceae, phân bố tương đối rộng rãi Việt Nam Hai loài thuốc này sử dụng lâu đời y học cổ truyền nước ta nhiều nước khác thuộc vùng Đông Nam Á An độ, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Lào, Trung quốc, Inđônêsia Tuy vậy, việc sản xuất dược phẩm từ hai loài p amarus p urinaria L chủ yếu dựa trên dược liệu thu hái tự nhiên, phần lớn dạng mọc hoang dại, bộc lộ số nhược điểm sau:

- Viêc thu hái khơng có quy hoạch dẫn đến nguy nguồn tài nguyên di truyền,

- Việc thu hái từ dạng hoang dại không đáp ứng yêu cầu công nghiệp dược nguồn dược liệu ban đầu thường khơng ổn định khơng kiểm sốt mặt hóa học, hoạt tính sinh học.

- Dược liệu thu thập hoang dại có nguy nhiễm với dạng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virút .), mang theo nguồn chất độc

ngoài ý muốn.

- Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy nhiễm độc với nguồn hóa chất độc khác nhau, chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, chất thải công

nghiệp thu hái từ vùng bị ô nhiễm thực tế tình hình

này khổ kiểm sốt.

Hình Cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus L (A)

Ngoài ra, thực tế p amarus p urinaria L hai lồi thuốc có đặc điểm hình thái giống (xem Hình la,b) giống với số lồi Phyllanthus khác có Việt nam, p niruri, p reticulaĩus

vốn quan tâm mục đích chế biến dược liệu Việc phân loại

chính xác lồi phyllanthus thực nhờ chuyên gia phân loại thực vật sau phát triển đến giai đoạn trưởng thành Trước thực tế vậy, việc thu thập dược liệu tự phát từ người dân đứng trước nhiều nguy nhầm lẫn khó đảm bảo chất lượng nguồn dược liệu sử dụng cho sản xuất dược phẩm quy mô công nghiệp

Trong hồn cảnh đó, báo cáo đề tài chúng tơi nhằm góp phần cung cấp cơng cụ phục vụ cho việc phân loại nhanh hai loài dược liệu dẻ nhầm lẫn Ngoài ra, kỹ thuật cịn cho phép đánh giá mức độ đa hình di truyền quần thể mẫu thu thập từ số địa phương khác miền Bắc nước ta, dẫn liệu cho việc chọn lọc nguồn nguyên liệu phục vụ công tác chọn, tạo giống loài thuốc Việt Nam tương lai

Đây nghiên cứu Việt Nam cho thấy khả ứng dụng thị phân tử (molecular fingerprintings) việc phân loại định danh nhanh loài thảo dược nước ta, vốn từ trước đến thực chủ yếu dựa vào thị hình thái (là thị dễ gây nhầm lẫn nhiều trường hợp) số trường hợp thị hóa học

NỘI DUNG CHÍNH CỦA ĐỂ TÀI

CH Ư Ơ NG T Ổ N G Q U A N T À I LIỆU 1.1 CÁC NGHIÊN CỨU VỂ PH YLLAN TH U S L.

1.1.1 Phân loại học thực vật tên gọi

Chi Phyllanthus chi lớn họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), thuộc Euphorbiales, phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Hai mầm (Dicotyledons) Chi gồm 11 phân chi: Isocladus, Kirganelia, Cicca, Emblica, Phyllanthus, Conami, Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylỉa, Botryanthus, Eriococcus (ưnander et al., 1990) có khoảng gần 700 lồi p amarus p urinaria thuộc phân chi Phyllanthus p

amarus thuộc nhánh Phyllanthus p urinaria thuộc nhánh Urinaria;

phân chi Phyllanthus cịn có nhánh khác Lysiandra Pentandra [25] Trong chi Phyllanthus, nhiều lồi có p amarus p

urinaria sử dụng làm thuốc y học dân tộc nước ta số nước

nhiệt đới khác giới Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Brazil, Peru, Tanzania, từ cách hàng nghìn năm Nhưng, phải đến năm 1738 chúng Linné mô tả đặt tên (tại Barbados) Mặc dù vậy, tài liệu cổ cho thấy từ lâu loài ghi nhận mô tả [25]

Về tên gọi, sử dụng rộng rãi y học dân tộc nhiều quốc gia từ hàng nghìn năm, nên hai lồi p amarus p urinaria gọi nhiều tên địa phương khác nhau, như: herbe du chagrin, petit tamarin rouge, surette (Pháp), Chanca piedra (Peru), quebra-pedra, arranca-pedras, erva pombinha (Braxin), pemilla del pasto (Puerto Rico), Holy Friday (Colombia), gale of wind (Florida Caribe thuộc Anh), Hurricane weed (Bahamas), Creole quinine, arrebentapedra, Paraparaimè (Paraguay), Santa Maria, San Pedro, herb of San Pablo, sampasampalkan (Philippines), zhen chu cao, ye xia zhu, Hsieh-hsia Chu (Trung Quốc), Komikansou (Nhật Bản), Pitirishi, Budhatri (An Độ), Đôi khi, số địa phương, tên thường dùng lẫn lộn để gọi tên hai loài số loài khác thuộc chi Phyllanthus [25]

ỏ Việt Nam, thuốc p amarus p urinaria gọi tên tên địa phương khác nhau, chẳng hạn chó đẻ cưa, cam kiềm, vườn kiềm, diệp hạ châu, diệp hoè thái, lão nha châu, trân châu thảo, rút đất, khao ham Và giống số nước, nước ta tên địa phương đôi dùng lẫn lộn cho hai loài Nhưng phổ biến p amarus gọi diệp hạ châu đắng hay chó đẻ chân chim, chó đẻ thân xanh, phân biệt với P urinaria gọi diệp hạ châu hay chó đẻ cưa [1],

1.1.2 Hình thái học, tê bào học

Các đặc điểm hình thái p amarus p urinaria mơ tả sau: thân thảo, sống năm nhiều năm, cao trung bình 20-30cm, đơi cao đến 60-70cm; Thân nhẵn, tròn;

mọc so le, hình bầu dục, xếp sít thành hai dãy, cành kép hình lồng chim, mặt xanh lục nhạt, mặt màu xanh mốc; phiến thuôn, dài 5-15mm, rộng 3-6mm, đầu nhọn hay tù, mép nguyên; gân - phụ mảnh, có 4-6 cặp; khơng có cuống cuống ngắn Hoa mọc nách lá, nhỏ, có cuống ngắn, đơn tính gốc; hoa đực

b đầu cành, hoa cuối cành, tiểu nhụy 3, nhị dính nhau; Quả nang,

hình cầu đường kính khoảng 2mm, mọc rủ xuống nên gọi diêp hạ châu (nghĩa hạt lá); có hạt hình tam giác, màu nâu nhạt, có vân ngang Cây thường hoa từ tháng đến tháng từ tháng đến tháng [1,7]

Ngoài đặc điểm chung trên, hai loài p amarus p urinaria cũng có số điểm khác biệt hình thái như: p amarus thường mọc thẳng, thân mầu xanh, chia nhánh p urinaria lại thường phân nhánh, thân có mầu xanh xẫm tím; p amarus thường có nhẫn, khơng gai cịn p urinaria thường có gai; hoa p amarus có lá đài, cịn hoa p urinaria có đài (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 1999) Tuy vậy, đặc điểm phân biệt thường rõ rệt đạt đến giai đoạn trưởng thành (ra hoa, kết quả) phân loại nhà phân loại học có kinh nghiêm Trong thực tế q trình thu thập chế biến dược liệu nay, khó khăn phân loại dễ dẫn đến việc thu thập nhầm lẫn hai loài [2,5]

Cho đến có nghiên cứu tế bào học Phyllanthus

amarus p urinaria Nghiên cứu Bancilhon cộng (1971) cho

thấy nhiễm sắc thể lưỡng bội p amarus 2n= 26 2n= 52; Nghiên cứu Rossignol cộng (1987) lại cho thấy nhiễm sắc thể lưỡng bội p urinaria 2n= 50 Một dẫn liệu khác cho nhiễm sắc thể lưỡng bội p amarus 2n=26, p urinaria 2n=14, 2n= 52, 2n= 50 tuỳ theo thứ (Phạm Hoàng Hộ, 1999) Như vậy, nói, đến chưa có nghiên cứu hoàn chỉnh số lượng đặc điểm nhiễm sắc thể loài Phyllanthus [5,11,17],

1.1.3 Phân bố sinh thái

Ở Việt Nam, chi Phyllanthus L có khoảng 40 lồi Trong có hai lồi Phyllanthus amarus Phylỉanthus urinaria L có hình dáng gần giống nhau, mọc rải rác khắp nơi trừ vùng cao lạnh Trên giới, loài phân bố rộng rãi Campuchia, Lào, Malaysia, Thái lan, Trung quốc, Ấn độ, Brazil, Florida Texas (Mỹ) Phylỉanthus L ưa ẩm ưa sáng chịu bóng, thường mọc lẫn bãi cỏ, ruộng cao ( đất trổng màu), nương rẫy, vườn nhà vùng đồi Cây mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh mùa hè tàn lụi vào mua thu Do khả hoa kết quả, nhiều hạt giống phát tán gần nên mọc thành đám dày đặc, lấn át cỏ dại trồng khác [1],

1.1.4 Sử dụng Phyllanthus L y học cổ truyền

Các tác dụng điều tri biết đến rộng rãi hai loài Phyllanthus

amarus Phyllanthus urinaria bao gồm điều trị số rối loạn đường tiêu

hóa (đặc biột bệnh lý gan), bệnh tiểu đường, số bệnh thận, đường tiết niệu, (Calixto et al., 1998) Gần đây, số nghiên cứu lâm sàng dược lý chứng minh dịch chiết thành phần hai lồi thuốc có tác dụng ức chế trình chép virút viêm gan B nhiều retrovirút khác (trong có HIV) nhờ tác dụng ức chế hoạt động enzym chép ngược reverse transcriptaza [13,21,22]

Ngoài ra, số nghiên cứu khác cho thấy dịch chiết Phyllanthus có hoạt tính ức chế ACE (angiotensin-converting enzym) liên quan đến số biến chứng bệnh tiểu đường [24,25]

1.1.5 Thành phần hoá học Phyllanthus L.

Các chất hoá học Phylanthus L tìm thấy lá, thân rễ gồm số chất như:

Lignan : phyllanthin, hypophyllanthin, niranthin

Flavonoid : phyllanthin flavonoid FG-1, phyllanthin flavonoid FG-2 Tannin : repandusinic acid, geraniin

Ngồi cịn số thành phần hố học như: glycoside, alkaloid, elligitannin, phenylpropanoid, lipid, sterol, flavonol, [12]

Hypophyllanthin Phyllanthin Niranthin

1.1.6 Các nghiên cứu tác dụng dược lý Phyllanthus L.

Từ thập niên 60, Phyỉỉanthus L trở thành đề tài nghiên cứu hoá thực vật để xác định phân tử hoạt động hoạt động dược lý chúng Nguổn hố thực vật tìm thấy giống Phyllanthus Nhiều phân tử hoạt động thuộc tính hoạt động sinh học lignan, glycoside, flavonoid, alkaloid, elligitannin, phenylpropanoid tìm thấy lá, thân rễ Các lipid, sterol, flavonol thấy phổ biến [12, 17]

Hai chất phyllanthin hypophyllanthin xác định có hoạt tính chống viêm gan [18,20]

1.1.7 Các dược phẩm bào chế từ p amarus p urinaria

Hiện nay, dược phẩm dạng cao p amarus p urinaria có mặt nhiều nước giới (Hình 3) Riêng nước ta, vài năm gần đây, nhiều biột dược có nguồn gốc từ p amarus p urinaria sử dụng rộng rãi Trong đó, kể đến Iivbilnic® (Cơng ty cổ phần dược phẩm Traphaco), VG-5® (Cơng ty dược phẩm TW 5), Hepaphyl® (Cơng ty dược phẩm TW25), Hepamarm®, Livsin-94® (Cơng ty cổ phần dược phẩm Hà Tây), v.v Hiện nay, dược phẩm sử dụng rộng rãi trong việc điều trị số bệnh lý gan, đặc biệt viêm gan siêu vi B Trong y học cổ truyền, tồn Phylìanthus L rửa sạch, dùng tươi hay phơi khô Dùng khô cách pha trà sắc thuốc uống hàng ngày.

Hình Một số biột dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus (hình A) p urinaria

Hình Một số dược phẩm dang tiêu thụ thị trường nước.

VG5® cơng ty dược TW có thành phần p amarus (A) Livbiln® cơng ty Traphaco có thành phần p urinaria (B)

Mặc dù loại dược phẩm nêu nước ta nhiều người sử dụng, phần lớn cơng ty dược khơng có vùng trồng ngun liệu ổn đinh, mà thường thu mua từ dân Việc thu mua nguyên liêu cách tự phát biểu lộ số nhược điểm sau: (1) Gây nguy làm nguồn tài nguyên di truyền; (2) Khó kiểm sốt tính ổn đinh thành phần hóa học hoạt tính sinh học dược liệu; (3) Dược liệu có mang theo hợp chất hố học khơng mong muốn (chất độc, chất nhiễm, )■

Trong hồn cảnh đó, viộc xây dựng vùng nguyên liệu để khai thác ổn đinh, vững điều cần thiết Với ý nghĩa vậy, việc sử dụng các chĩ thị phân tử nhằm đánh giá đa dạng nguồn gen hiên có cung cấp dẫn liêu cần thiết cho việc đinh hướng, quy hoạch công tác chọn tạo giống tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu làm thuốc từ thảo mộc.

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỂIZOZYM

Bản chất hoá học enzym protein, cấu trúc khơng gian tồn phân tử có vai trị quan trọng hoạt tính sinh học xúc tác enzym.

định Hay nói cách khác izozym dạng enzym có hoạt tính xúc tác tương tự giống (cùng phản ứng hố học) có đặc tính hố học (độ pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất ức chế, .) khác Trên sở đặc điểm di truyền, chia izozym làm loại:

- Izozym đơn gen: izozym chịu kiểm sốt gen, hình thành từ chuỗi polypeptít đơn, có kiểu phân tử khác (v.d: thành phần trật tự axít amin); vậy, phân tách điện di

- Izozym đa gen: izozym mã hố hay nhiều gen, phân biệt hoá miễn dịch dựa đặc tính enzym

Các biến dạng tương ứng izozym allozym Allozym sản phẩm alen khác lơcut, khác với izozym sản phẩm lôcut khác

Các nhà khoa học đánh giá tầm quan trọng việc nghiên cứu izozym để phục vụ cho nhiều lĩnh vực khác Một số cơng trình nghiên cứu phân loại tiến hóa lồi sinh vật

Với trình độ kỹ thuật tiên tiến phát triển khoa học, ngày có nhiều phương pháp để nghiên cứu tính đa hình izozym Ban đầu phương pháp đơn giản như: phương pháp pha loãng, phương pháp độ nhớt, phương pháp làm hoạt tính kéo dài thời gian thể đến phương pháp sắc kỷ (chromatography), phương pháp điện di (Electronphoresis) phương pháp ghi hình (scanning) Trong phương pháp phương pháp nghiên cứu điện di gel polyacrylamid sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khoa học, dễ thực hiện, thời gian thực nhanh có hiệu kinh tế [19]

Sử dụng phương pháp nghiên cứu phổ izozym esteraza điện di gel polyacrylamid theo gradien nồng độ 8-16% thành công việc phân loại lồi dịng khác bèo hoa dâu [23]

Trong lĩnh vực di truyền chọn giống, phương pháp điện di izozym coi biện pháp hữu hiệu Đây phương pháp thành công để nhận biết lai cách dễ dàng Đã có nhiều cơng trình nước sử dụng số hệ izozym để phân tích đa hình di truyền, phân loại nhận biết lai thực vật Các nhà chọn giống di truyền học sử dụng phương pháp điện di gel tinh bột để nghiên cứu cấu trúc di truyền loài lúa Oryza sativa [' ] Từ phát lơcut gen đa hình mã hóa cho enzym nghiên cứu số 1688 giống lúa truyền thống Châu Á Phân tích izozym enzym dẫn tới nhận dạng nhóm lúa [4]

Sử dụng hệ thống izozym người ta nghiên cứu di truyền phân loại loại an táo, lê, đào, dâu tằm, vải, cam, xoài, chuối, khoai sọ

V.V [ , ]

Để xác định đặc điểm di truyền hoạt tính hệ enzym esteraza enzym có liên quan đến tính kháng thuốc, người ta tiến hành phân tích izozym để góp phần phân loại phịng trừ muỗi, sâu tơ .[9]

Theo nhận xét tác giả Trịnh Đình Đạt, người nghiên cứu hệ izozym nhiều năm phân loại muỗi, tằm, mối, sâu tơ, cá rơ phi, lươn .bằng phân tích hệ izozym esteraza mô máu [3]

Đã có nhiều tác giả nghiên cứu tính đa hình izozym peroxidaza thực vật cho thấy hình thái izozym peroxidaza có nhiều biến đổi trình sinh trưởng sinh vật., giống lúa chịu hạn tốt, hoạt tính peroxidaza cao rõ rệt so với giống lúa không chịu hạn [6, 10]

Những nghiên cứu izozym lĩnh vực y học đạt kết có triển vọng Hiện xuất hàng loạt cơng trình hóa sinh lâm sàng mà theo biến đổi vể phương diện izozym huyết bệnh nhân có ỷ nghĩa chẩn đốn phân biệt Ngồi phương pháp nghiên cứu izozym cịn dùng để xác định thành phần nhân chủng số tộc người Việt nam Điểu góp phần vào việc nghiên cứu đặc trưng huyết học phục vụ cho nghiên cứu thông số sinh học người Việt Nam [8]

1.2.1 Izozym Superoxide dismutaza (SOD E c l.15.1.1)

Superoxide dismutaza (SOD) enzym có mặt hầu hết thể sống hiếu khí bào quan có hình thành dạng oxi hoạt động SOD lần tách Mann Kellis vào năm 1938 lúc tác giả cho protein có chứa kim loại đồng (Cu2+) Sau người ta gọi enzym với số tên như: erythrocuprein, indophenoloxidaza hay tetrazolium oxidaza Đến năm 1969 Me Cord Fridovich phát chức nâng xúc tác đặc biệt enzym đặt tên superoxide dismutaza (SOD) xúc tác cho phản ứng biến đổi superoxide (0*‘2) thành peroxide hydro (H20 2) oxi ( 2) theo phản ứng sau:

SOD-Cu + 0*2 — ► SOD-Cu1+ + SOD-Cu1+ + 2H+— ► SOD-Cu2+ + H20 Phương trình tổng quát là:

SOD

0*2 + 0*2 + 2H+ - * + H20

Như SOD có vai trị trung tâm việc triệt tiêu gốc superoxide tạo q trình oxi hố

Về mặt di truyền tất enzym SOD mã hố nhân chuyển đến quan đích nhờ trình tự tín hiệu dân đường

v ề mặt phân loại enzym SOD cẩn có ion kim loại cho hoạt

động xúc tác chúng dựa thành phần cofactor kim loại mà người ta chia SOD thành dạng khác bao gồm:

- Các SOD chứa Mangan (MnSOD)

MnSOD nhóm enzym tách từ ty thể hệ thống oxi hoá photphoryl hoá tế bào nhân chuẩn (eukaryote) hay từ tê bào nhân sơ (procaryote) tế bào chất Staphylococcus xỵlosus.

MnSOD sinh vật nhân sơ hầu hết có dang dimer với monomer có chứa ion Mn2+ Các hợp chất hữu đóng vai trò làm khung bao lấy ion Mn2+

- Các SOD chứa sắt (FeSOD)

Martin cộng cho thấy FeSOD tế bào vi khuẩn s mutans OMZ176 holoenzym có khối lượng vào khoảng 43000 Da phẩn đơn vị có khối lượng 20700 Da Và theo tác giả trật tự axit amin enzym có đặc điểm giống với trật tự axit amin MnSOD tìm thấy vi khuẩn

- Các SOD chứa đồng kẽm (Cu/ZnSOD)

Cu/ZnSOD lần phát Photobacter sau phát hầu hết vi khuẩn nhân sơ Brucella abortus, Legionella

sp, E coli, Neisseria meningitidis số đại diện chi Haemophilus, Actinobaccilus Pasteureỉìa, Salmonella Gen mã hoá cấu trúc

enzym xác định

Cu/ZnSOD enzym có cấu trúc đặc biệt điển hình, dạng dimer có khối lượng phân tử khoảng 32 kDa [19]

1.2.2 Izozym Esteraza (EST E.c.3.1.1.2)

Esteraza (EST) nhóm izozym khơng nguồn gốc, biểu chun hóa chất, song tất esteraza có đặc tính chung phá hủy liên kết este axit cacbonic chất phát sinh từ naphthol, indoxil methylum billphrin Izozym esteraza thuộc lớp hydrolaza xúc tác cho phản ứng phân giải tổ hợp este theo sơ đổ sau:

ROORj + HOH * * RCOOH + R,OH

Năm 1957- 1961 ủy ban enzym Hội Hóa sinh quốc tế soạn thảo phân loại thống danh pháp enzym Qua enzym phân làm nhóm , nhóm chia thành phân nhóm , phân nhóm tiểu phân nhóm Esteraza xếp vào nhóm 3, phân nhóm thứ tiểu phàn nhóm thứ

Ở thực vật chứng minh có nhóm esteraza: Arylesteraza (A), Aliesteraza (B) Cholinesteraza (C) Các A.esteraza thủy phân este thơm nhanh mạch thẳng, B.esteraza thủy phân este

mạch thẳng nhanh nhóm A.esteraza c.esteraza có tác dụng mạnh cholineste thủy phân este mạch thẳng este thơm khơng dẽ dàng nhóm [19]

ị.2.3 Izozym Peroxidaza (PO E c l 1.1.17)

Izozym peroxidaza thuộc lớp enzym oxi hóa khử , chúng có khả oxi hóa hợp chất thơm có mặt H20 Peroxidaza giết chết vi sinh vật phá hủy chất hóa học có mặt H20 2, phenol, alcohol Đây loại izozym độc cho tế bào động vật thực vật Các izozym peroxidaza khác tìm thấy mơ khác Các peroxidaza thực vật có tính đặc hiệu chất rộng rãi Trong nghiên cứu peroxidaza cải ngựa (HRP) ( Maehly, 1960) cho thấy chế tác dụng peroxidaza gồm có giai đoạn:

Izozym peroxidaza chia làm hai nhóm chính: nhóm axit nhóm kiềm Bằng phương pháp điện di sắc ký đối tượng lúa mạch người ta thấy phần lớn dạng peroxidaza nằm nhóm kiềm, cịn dạng thuộc nhóm axit chiếm tỷ lệ thấp [19]

HRP + H2Oz

Complex I + AH Complex II + AH Phương trình tổng quát là:

H20

Complex I Complex II + A

HRP + A + 2H ,0

CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU THỰC VẬT

Hai loài thuốc diộp hạ châu đắng (Phylỉanthus amarus Schum et Thơnn.) diệp hạ châu 0Phyllanthus urinaria L.) điển hình đối tượng sử dụng nghiên cứu chúng tôi.

n

Phyỉlanthus amaru Phyỉlanthus urinaria L.

Bảng Danh sách địa điểm thu thập mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus p urinaria

STT Ký hiệu mẫu

Địa điểm thu mẫu Thời gian thu mẫu' Loài

Xã, huyện Tỉnh/Thành phố 1

Ahk Phyllanthus

amarus Hoàn Kiếm

Đợt

2 U-rx P urinaria Thanh Xuân Đơt

3 UTO P urinaria Trâu Ọuỳ, Gia Lâm Đơt

4

a nt Phyllanthus

amarus

Ngọc Trục, Từ Liêm

Đợt 1 5

Abđ Phyllanthus

amarus Ba Đình

Đợt

6 Urb P urinaria Đơt

7

a nb

Phyllanthus

amarus Nôi Bài, Sóc Sơn

Đợt

8 _ Unb P urinaria Đơt

9

Ađa Phyỉlanthus

amarus Thị trấn Đông Anh

Đợt

10 UữA p urinơria Đơt

11

Acl Phyllanthus

amarus Cổ Loa, Đông Anh

Hà Nội Đợt

12 UcL P urinaria Đơt

13

^HB Phyllanthusamarus Hải Bối, Đông Anh Đợt

14 Uh b P urinaria Đơt

15

Apj Phylỉanthus

amarus Phú Thị, Gia Lâm

Đợt

16 UpT P urinaria Đơt

17 UpL P urinaria Phủ Lỗ, Sóc Son Đơt

18

Ath Phyỉlanthus

amarus Tây Hồ

Đợt 19

^ĐD Phyllanthusamarus Đống Đa Đợt

20

^NH Phyỉlanthusamarus Ngũ Hiêp, Thanh Trì Đợt

21 Phyỉlanthus

amarus Mao Điền, cẩm

Đợt

22 U\1Đ P urinaria Đơt

23

^HD Phyllanthusamarus Thành phố Hải Dương

Hải Dương Đợt

24 Uhd P urinaria Đợt

25 U rK P urinaria Tứ K ỳ Đ ợt 2

1 Đợt 1: ngày 7-8/12/2004; Đợt 2: ngày 2-3/3/2005; Đợt 3: ngày 7-8/3/2005; Đợt 4: ngày 24-29/3/2005

Ký hiệu mẫu

Đia điểm thu mẫu Thời gian thu mẩu'

STT Loài

Xã, huyện Tỉnh/Thành phố 26

Avy

Phyllanthus

amarus Viêt Yên

Đợt

27 Uvv P urinaria Đơt

28

Aln

Phyllanthus

amarus Lục Ngạn

Bắc Giang Đợt

29

Asđ Phyllanthus

amarus Sơn Đông

Đợt

30 Uyr P urinaria Thuân Thành Bắc Ninh Đợt

31

UvL P urinaria Nghĩa Trai, Văn Lâm Hưng Yên Đợt

32 UphL P urinaria Phú Lãm, Hà Đông

Hà Tây Đợt

33 Ujijf P urinaria Thường Tín Đợt

34 Uls P urinaria Lương Sơn Hồ Bình Đợt

35

Ayđ Phyllanthus

amarus Yên Định Thanh Hóa

Đợt

36 UTĐ P urinaria Tam Đảo Vĩnh Phúc Đợt

Để thu thập nguyên liệu, tiến hành bốn đợt điều tra xác định vị trí phân bố tự nhiên quần thể hai loài p amarus p urinaria SỐ địa phương thuộc miền Bắc Cụ thể, đợt tiến hành ngày 7-8/12/2004, Hà Nội, Hà Tây, đợt ngày 2-3/3/2005, Bắc Giang, Hải Dương, đợt ngày 7-8/3/2005 ngoại thành Hà Nội đợt từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 Hà Nội, Hưng Yên, Hà tây, Hồ Bình Vĩnh Phúc Từ mẫu thu được, dựa vào khố phân loại hình thái, chúng tơi chọn 36 mẫu có đặc điểm hình thái tương đối điển hình hai lồi thuốc quan tâm nghiên cứu, 17 mâu thuộc lồi

Phyllanthus amarus (được ký hiệu A) 19 mẫu thuộc loài Phyllanthus urinaria (được ký hiệu U).Danh sách, địa điểm thời gian thu thập

mẫu nêu chi tiết Hình Bảng

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH IZOZYM

Phương pháp phân tích đa hình izozym thực theo qui trình Tanksley s D Orton T J (1983)[19] kết hợp với Zimmerman w J (1989)[ 23] có cải tiến, với bước thực sau:

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Để việc thu mẫu tương đối nhất, địa điểm chúng tồi chọn có kích thước vừa phải, sinh trưởng phát triển tốt Sau chung tơi đào lấy phần đất, cho vào túi ni lơng có sẵn giấy báo thấm nước buộc êtiket vào cây, bảo quản đưa vào phịng thí nghiệm cho tươi

2.2.2 Phương pháp nghiền mẫu

Chúng chọn cắt cành non, rửa nước cất, thấm khô, cân 500 mg mẫu chuyển vào cối sứ,bổ sung 500|il đệm nghiền thu dung dịch huyền phù đồng (quá trình nghiền giữ đá lạnh) Thu lấy dịch chuyển vào ống eppendorf Ly tâm lạnh (4°C) 14000 vòng/phút vòng 15 phút Thu phần dịch phía để tiến hành phân tích điện di hệ izozym

2.2.3 Phương pháp điện di

Bản chất hoá học enzym protein, alen khác qui định, nên cấu trúc bậc protein enzym khác nhau, hình thành nên enzym khác trọng lượng kích thước phân tử

Enzym chất đa điện ly, trạng thái dung dịch phân cực vẻ điện tích Trong điện trường dòng điện chiều, phân tử hỗn hợp protein chuyển động phía catot (-) anot (+) theo tốc độ khác Do gel, phân tử protein có kích thước khác nằm vị trí khác sau chạy điện di.

Sự khác băng điện di izozym dùng để so sánh, đánh giá khác chất di truyền lồi Sự khác quan hệ họ chúng gần ngược lại

Sử dụng gel polyacrylamid lớp cho việc nghiên cứu: gel có nồng độ 4% polyacrylamid gel tách có nồng độ 12% polyacrylamid

Chúng tiến hành điện di máy điện di Mini - ProteanR3(Biorad, Mỹ) Kích thước gel 10 X 10 cm, cường độ dòng điện 120vol, hiệu điện 40mA, nhiệt độ 5nc , thời gian 2h->3h vạch mầu chuẩn cách đáy gel khoảng lcm Sau điện di xong, gel lấy khỏi khuôn tiến hành nhuộm

Sau điện di đại đa số protein khơng có mầu (trừ Hemoglobin), vây ta phải tiến hành nhuộm để biết vị trí protein sau chạy điện di, đoi với loại prơtein có chất chất xúc tác thuốc nhuộm khác Phương pháp phân tích hệ izozym SOD phản ứng nhuộm màu với NBT Riboflavin Phân tích hệ izozym esteraza phản ứng nhuộm màu với hỗn hợp chất oc-Naphthyl acetat, p-Naphthyl acetat với thuốc nhuộm Fast Garnet Fast blue RR salt Phân tích hệ izozym PO phản ứng nhuộm màu bcnzidin A.accticl0% va xac định tren đọ nhạy earn với H 2o j[ 19,23]

2.2.4 Phương pháp phân tích kết nghiên cứu

Phương pháp tính Rf: Tính đa hình hệ izozym mẫu quần thể thuộc

hai loai p amarus p urinaria biểu thông qua khác biệt thành phần tốc độ di chuyển tương đối (Rf) băng điện di gel phan tích Để phân biẹt băng đa hình, độ di chuyển tương đối Rf

xác định tỷ lộ khoảng cách từ đầu gel tách đến vị trí báng điện di so với chiều dài gel tách [16]

R f = -

1

x: Khoảng cách từ đầu gel tách đến vị trí băng điện di 1: Khoảng cách từ đầu gel tách đến vạch kết thúc điện di

Phương pháp tính khoảng cách di truyền dựa dấu chuẩn izozym:

Các băng đa hình ghi nhận dựa có mặt vắng mặt chúng Các số liệu thu thập xử lý chương trình NTSYSpc 2.02h (Rohlf F.J, 1993) để xác định hệ số tương đồng di truyền xây dựng sơ đồ hình quan hộ di truyền mẫu quần thể thu

C H Ư Ơ N G III K Ế T Q UẢ VÀ T H Ả O LU ẬN

3.1 Phổ điện di hệ izozym SOD mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria thu thập số địa điểm

tại miền Bắc Việt Nam.

Kết phân tích băng điện di hệ izozym SOD mẫu quần thể

p amarus p urinaria thu thập địa điểm khác

đợt thu mẫu cho thấy có khác biệt rõ rệt kiểu hình hệ izozym SOD hai loài thuốc Mặc dù câc mẫu hai loài thu thập từ địa phương cách biệt mặt địa lý vào thời điểm khác (từ tháng 12/2004 đến tháng 3/2005), nhìn chung phổ điện di quần thể phạm vi lồi'có tính hình cao, đặc biột quần thể loài p amarus Trong nghiên cứu tất mẫu quấn thể loài p

amarus (ký hiệu A) cho phổ điện di phổ izozym SOD rõ nét,

các mẫu quần thể loài p urinaria (ký hiệu U) cho băng mờ không phát thấy băng điện di

Rf 0,22 0,40 0,43 0,52 0,60 0,63 0,67 0,71 0,75

Hình 5: Phổ điện di hệ izozym SOD cùa mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

là A) Phylỉanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Băc Việt Nam

Khi phân tích 17 mẫu lồi p amarus ( Hình 5,6,7,8) chúng tơi thu đươc tổng cộng băng đa hình khác tương ứng với giá trị Rf 22; 0,40; 0,43; 0,52; 0,60; 0,63; 0,67; 0,71; 0,75 Trong số đó, đáng chu y có ba băng đồng hình rõ nét xuất tất 17 mẫu quần thể cua loài p amarus (Rf= 0?63; Rf= 0,71 Rf= 0,75) Trong đó, việc

phân tích 19 mẫu quẩn thể loài p urinaria thấy xuất băng điên di 4/19 mẫu (chiếm « 20%) mẫu UVY (Hình 6), lim (Hình 7),

U ThT> và ƯL5 (Hình 8) vói tổng sổ băng đa hình (Rf = 0,45; Rf = 0,48- Rf =

0,63; Rf = 0;71 Rf = 0,75) Đối với 15/19 mẫu p urinaria cịn lại khơng quan sát thấy băng điện di Một điểm dáng ý số mẫu kể trên ( đặc biệt rõ hai mẫu UVY UNB), băng điện di xuất hiên cac VỊ tn Rf 0,63; 0,71 0,75, giống với băng hình rõ nét quần thể lồi p amarus Nhưng có khác biệt la các mẫu P urinaria này, băng điện di biểu mờ với cường độ ánh sang băng 1/2 so với mâu p amarus Ngoài ra, quan sát rhực tế chúng thấy hại mẫu UVY UNB thu thập từ khu vực có phân bố hai loài p amarus p urinaria phạm vi hẹp Điều dần chụng tơi đến giả thiết rằng: mẫu Uvy UNB “con lai” hại loài p amạrus p urinaria, hình thái chúng mang đặc điểm giống với lồi p urianaria (vì xếp vào nhóm U) la tượng đáng quan tâm, chưa ghi nhận nghiên cứu phân loại lồi Phyllanthus Mặc dù trước có số báo cáo cho thây có sự tồn dạng trung gian hình thái loài thuộc chi Phyllanthus (Taylor, 2003) [20].

Rf

0,40 0,43 0.52 0,63 0,67 0,71 0,75

Hình 6: Phổ điện di hệ izozym SOD mẫu quần thể hai loài phylỉanthus amarus (ký hiệu là A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập sô địa điểm miền Bắc Việt Nam

^illì ^Cl ^I)A ^\B ^NB ^ r r UphL ƯĐA UCL ƯI1B

Rf

0,60 0,63 0 71 075

Hình 7: Phổ điện di hệ izozym SOD mảu quẩn thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu A) Phyỉỉanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

0,63 0,67 71

Hình 8 ' Phổ điện di hệ izozym SOD mâu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu là A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

R f ^liK ^Vt ^CL ^ĐA ^NB ^TH A BĐ ANH 0,22

• 0,40

0,60 0,63 0,71 0,75

H ình 9: Phổ điện di izozym SOD cùa mẫu quần thể loài Phyllanthus A) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

amarus (ký hiệu là

R f ư p L Ư TQ U NB U M U nA U HB c, u r r ư-nc M

0,63 0,71

0,75

Hình lơ: Phổ điện di hẹ izozym SOD mẫu quần thể loài Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập sô' địa điểm miền Bắc Việt Nam

3.2 Phổ điện di hệ izozym EST mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria thu thập sô địa điểm

tại miền Bắc Việt Nam.

Trên hình 11, 12, 13, 14 phổ điện di izozym EST mẫu quần thể

hai loài Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam (36 mẫu).Tương tự phổ điện di izozym

SOD, thấy khác biệt rõ rệt kiểu hình hộ izozym EST hai loài thuốc Trong số 17 mẫu lồi p amarus, phân tích chúng tơi nhận phổ điện di cho băng đa hình Chúng tơi thu băng đa hình khác với giá trị Rf= 0,09; 0,24; 0,27; 0,42; 0,58 0,71 Trong số có băng đồng hình xuất tất 17 mẫu quẩn thể lồi p amarus (Rf= 0,09; 0,42; xem hình) Trong thì 16/19 mẫu quần thể lồi p urinaria khơng thấy xuất băng điện di Chỉ có 3/19 mẫu có thấy xuất băng, mẫu U-ThT , ƯLS UNB với tống số băng đa hình (Rf= 0,09; 0,38; 0,42; 0,63 Rf= 0,71) [Xem hình 12, 13]

R f Á NT AHK Apt u pr U„hL U BD U TQ Urx

0,09 K g l

0,27 l U f l f 0,42 |||||i

0,58 111111 0,71 lm s m

Hình 11: Phổ điện di hệ izozym EST mảu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

ià A) Phyỉlanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập sô' địa điểm miền Bắc Việt Nam

I IB ^ C L ^ Đ A N B N B ^ T T U p h L ^ Đ A ^ C L ^ H B

R f

0,09 0,24

0,42

0,58 0,71

Hình 12: Phổ điên di izozym EST mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

R f

0,09 0,24

0,42 0,58 0,71

M Abđ Ath Anh Ađa Ayđ Utđ UThT ƯLS u v

0,38

0,63

Hình 13: Phổ điện di hệ izozym EST mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu là A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Bấc Việt Nam

^ ^Mũ ^HD ^VY ^LN -^SĐ U yy UyK U HD U MD

R f 0,09 0,24 0,42 0,58

0,71

H ình 14: Phổ điện di izozym EST mẫu quần thể hai Loài Phyllanthus amarus (ký hiệu là A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập ỏ sô' địa điểm miền Bắc Việt Nam

Trong hai quần thể ư-rh-r , ULS (Hình 13) có băng điện di có Rf= 0,38; Rf= 0,63 (không trùng với Rf quần thể p.amarus) Riêng quần thể P urinaria Nội Bài UNB (Hình 12) băng điện di xuất vị trí Rf= 0,09; 0,42; 0,71 giống vị trí băng chung quần thể p

amarus mờ mảnh Kết phù hợp với kết

phân tích hệ izozym SOD phần (3.1.), củng cố thêm giả thiết “con lai” hai loài p.amarus p urinaria mà để cập trên.

3.3 Phổ điện di hệ izozym PO mẫu quần thể hai loài

Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria thu thập số địa điểm

tại miền Bắc Việt Nam

Dựa vào kết phổ điện di izozym PO từ hình 15 đến hình 18 chúng tơi cũng thấy 17 mẫu lồi p amarus xuất băng Chúng tơi thu tổng cộng băng đa hình khác với giá trị Rf= 0,29; Rf= 0,60; Rf= 64; Rf= 0,69 ; Rf= 0,85 Rf= 0,87 Trong số đó, có băng hình xuất tất 17 mẫu quần thể loài p amarus (Rf= 0,85 Rf= 0,87) Trong đó, kết phân tích 19 mẫu quần thể lồi p urinaria thấy xuất hiên băng điện di quần thể, quần thê ƯĐA,UHe , UphL (Hình 15), UXĐ ,ƯLS U-n,T (Hình 16), vói tổng số băng đa hình (Rf= 0,68; 0,74 0 79) Cả quần thể p urinaria có băng chung vị trí Rf= 0,74 Cịn lại 13/19 mẫu p urinaria khơng quan sát thấy băng điện di.

R f

0 ,6 0 ,6 0,6

0,85 0,8

Hình 15: Phổ điện di hẹ izozym PO mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu là A) Phylỉanthus urinaria (ký hiệu ư) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

0,85 0,87

H ình 16: Phổ điện di hệ izozym PO mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu là A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

Hình 17: Phổ điện di hệ izozym PO mẫu quần thể hai loài Phyllanthus amarus (ký hiệu

là A) Phyllanthus urinaria (ký hiệu U) thu thập số địa điểm miền Bắc Việt Nam

Để kiểm tra lại, tiến hành điện di lại 17 mẫu loài p

amarus 19 mẫu loài p urinaria đợt thu mẫu nhuộm với

hệ izozym SOD, EST PO kết thu khơng thay đổi (xem hình 9, 10)

3.4 Quan hệ di truyền quần thể hai loài Phyllanthus amarus

Phyllanthus urinaria dựa dấu chuẩn izozym SOD, EST PO

Trong hệ izozym SOD, EST PO nghiên cứu này, nhận thấy hệ izozym SOD cho độ đa dạng

Dựa băng đồng hình đa hình phân tích hệ izozym SOD từ 17 mẫu quần thể loài p amarus 19 mẫu quần thể lồi lồi p

urianarỉa, chúng tơi xác đinh đợc hệ số đồng dạng di truyền xây dựng

đợc quan hệ di truyền quần thể thập đợc hai loài p amarus vắ P urinaria việc sử dụng phần mềm NTSys 2.02h Kết trình bày hình 18

Từ kết phân tích, chia quần thể hai loài p amarus p

urinaria sử dụng nghiên cứu làm nhóm Nhóm thứ

nhất bao gổm tồn 17 quần thẽ p ứtìĩãrus VỚI hộ sô tơng đong di truyen dao động khoảng từ 0,63 đến 1,00 Nhóm thứ hai gồm 14 quần thể p

UMĐ> UHD, Ujk, UVL, U-JT, UpL) có hệ số tương đồng di truyền 1,00 (do hồn tồn khơng xuất băng điện di hệ izozym SOD) Nhóm cịn lại hệ trung gian hai nhóm gồm quần thể UVY, ƯNB, U^T, ULS

H h

-

I I I I I 1 11 » I » I - Ị ~

0,25 0,50 0,75

Hệ số tương đồng di truyền

Am A«K Apt A*tĐ Ahd Avy Aln Asđ AtìĐ Ath Ađđ A*H Ayđ A+hb Acl Aoa Anb ■ U N0

I UĩhT

IịỊls

■ UvY U p t UphL

Ubđ UvL

U t q U t x U t k

Uhd Umđ

U t t U p l U đ a Ucl Uhb Utđ "“ I 1,00 1— 0,00

Hình Sơ đồ quan hệ df truyèn cùa 36 quần thẻ m ẫu thuộc hai loài p am arus p urinaria xác kỹ thuật phân tích chì thị izozym SOD (địa điềm thu thập mẫu nêu Bảng 1)

đính

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ

KẾT LUẬN

Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau:

1 Có thể sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD, EST PO để góp phần phân loại hai lồi thuốc Phyllanthus amarus Schum et Thonn.và

Phyllanthus urinaria L từ nhỏ (đặc biệt hệ izozym

SOD)

2 Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng quần thể loài p

amarus nghiên cứu có Rf= 0,63; Rf= 0,71 Rf= 0,75.

3 Các băng điện di phổ izozym EST đặc trưng riêng quần thể lồi p

amarus có Rf=0,09 Rf=0,42.

ằ Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng quần thể loài p amarus có Rf= 0,85 Rf= 0,87.

j C Phát quần thể p.urinaria Nội Bài ,Sóc Sơn (UNB) có phổ điện di izozym SOD, EST mang băng đặc trưng lồi p amarus Có thể là lai loài p amarus p urinaria.

ế Có thể sử dụng hệ izozym SOD, EST PO để đánh giá mức độ đa

dạng khoảng cách di truyền loài p amarus p urinaria thu thập miền Bắc Việt Nam, hệ izozym SOD cho độ đa dạng

ĐỀ NGHỊ

1 Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền loài Phyllanthus spp đối tượng khác, nhằm góp phần vào việc phân loại kiểm định dược liệu

2 Có nghiên cứu sâu vể quần thể Phyllanthus urinaria L Nội Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem có lai lồi hay khơng?

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Đỗ Huy Bích cs.(1999), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam,

tập II, Tr 438, Nxb Khoa học kỹ thuật; Hà Nội.

2 Võ Vãn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội. Trịnh Đình Đạt cs (1999), “Một số hệ isozym dịng cá rơ phi - oreochromis niloticus ni Việt Nam”, Tạp chí sinh học, (23,3a),tr 167-

169

4 Hoàng Thị Hoà, Đinh Đoàn Long, Nguyễn Thị Biên, Trần Thị Nhuận (2004), “Xác định dòng lúa lai việc sử dụng hệ izozym esteraza”,

Tạp chí khoa học ĐHQGHN, T XX, số 2PT.

5 Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Thành phố Hổ Chí Minh

6 Nguyễn Như Khanh, Võ Minh Thứ (1995), “Tính đa hình izozym peroxidaza esteraza số giống lúa chịu hạn mặn” Di Truyền

Học ứng dụng, số tr 27-32.

7 Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nơm, Nxb Y học, Hà Nội

8 Chu Văn Mẫn, Trịnh Đình Đạt (1992), “ Tính đa dạng hệ isozyme ở người Việt Nam ”, Di Truyền Học ứng dụng, số 1, tr 11-14.

9 Đỗ Lê Thăng, Trịnh Đình Đạt (2001), “Hệ isozyme esterase sâu tơ (plutella xylo Stella) kháng thuốc diệt”, Di Truyền Học ứng dụng, số 4, tr 27-30

10 Allbert L and Andrew u s (1968), “Isoenzyme in biology and medicine”, Academic press, London.

11 Bancilhon, L (1971) “Contribution a' rétude taxonomique de genre

Phyllanthus (Euphorbiacees).” Boissiera 18, 9-81; 22 plates.

12 Calixto J.B., Santos A.R., Cechinel F.V., Yunes R.A (1998), A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential M ed Res Rev, 18(4): 225 - 258.

13 Chan H.L., Sung J.J., Fong W.F., Chim A.M., Yung p.p., Hui A.Y., Fung K.p Leung p c (2003), Double-blinded placebo-controlled study of p

urinaris for the treatment of chronic hepatitis B Ailment Pharmacol Ther

18: 339 - 345

14 Glaszmann J c (1987), “Isozyme and classification of Asian rice varieties”, Theor Appl Genet, 74, pp 21-30.

15 Nguyen V X, Yoshino H., Tahara M (1998), “Genetic control of four enzymes indiphoid Tarro, colocasis eskulenta (L.) schott”, Breeding Science 48, pp 273-280

16 Rohlf F.J.(1993), NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable

analysis system version 1.80 Exeter software Applied Biostatistics Ins.,

New York.

17 Rossignol L., Rossignol M., Haicour R (1987), “A systematic revision and Phyllanthus Subsection Urinaria (Euphorbiaceae).” American journal

and Botany, 74, 12, December, 1853-1862.

18 Syamasundar, K.V., Singh, B., Thakur, R.S., Husain, A., Kiso, Y., and Hikino, H (1985), “Antihepatotoxic principles of Phyllanthus niruri herbs.”

Journal o f Ethnopharmacology 14, 41-44.

19 Tanksley S.D and Orton T.J (1983), Isozymes in plant genetics and

breeding Elsevier Science Publ., Amsterdam.

20 Taylor L (2003), Chanca piedra “stone breaker" (Phyllanthus niruri) Sage Press Inc

21 Thyagarajan S.P., Subramanian s., Thirunalasundari T., Venkateswaran P.S., Blumberg B.s (1988), Effect of Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus Lancet, (8614): 764 -766.

22 Venkateswaran P.S., Millman I., and Blumberg B.s (1987), Effects of an extract from p niruri on hepatitis and woodchuck hepatitis viruses: invivo and invitro studies Proceedings o f National Academy o f Science USA, 84: -2

23 Zimmerman W.S., Lumpkin T.A., Watanable I (1989), Isozyme differentiation of Azolla Euphytica 42: 163 - 170.

24.ưeno H and et al (1988), “ Chemical and pharmaceutical studies on medicinal plants in Paraguay Geraniin, an angiotensin-converting enzyme inhibitor from ‘paraparai m i,’ Phyllanthus mruri.”, J Nat Prod, 51(2), pp 357-59

25 Unander W.D., Webster L G., Blumberg s B., (1990), “Records of usage or assays in Phyllanthus (Euphorbiaceae) I Subgenus Jsocladus,

Kirganelia, Cicca and E m b lica Jo u rn a l o f Ethopharmacology 30, 233-246.

Bộ Khoa h ọc Công nghệ HỘI ĐỔNG KHOA HỌC T ự NHIÊN

N gành Khoa học Sự sống

NHữNG VẤN ĐỂ NGHIÊN CỨU c BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG

BÁO CÁO KHOA HỌC,

HỘI NGHỊ TOÀN QUỐC 2005

NGHIÊN CỨU Cơ BẢN TRONG KHOA HỌC s ự SỐNG

Trường Đ ại h ọc Y Hà Nội, 03 tháng 11 năm 2005

NỌI DUNG■

N h ữ n g v ấn đ ề n g h iê n u b ản tro n g K hoa học S ự sống n ăm 2004-2005 v đ ề x u ất n h ữ n g đ ịn h h n g tiế p theo

GS.TS N g u y ễn Bá

M ột số h o t đ ộ n g k ế t q u ả n g h iê n cứu chủ yếu kh o a học công nghệ của Trường Đại học Y Hà Nội

GS.TS N g u y ễn Lân Việt

M ột số tax o n m i v à/h ay b ổ su n g cho h ệ thự c v ật V iệt N am vấn để bảo tồ n chúng

P han Kê'Lộc, N guyễn Tiến Hiệp, N guyễn Thị Thanh H ương, Đỗ Tiến Đoàn, N g u y ễn Q u an g H iếu, Tô Văn Thảo, N guyễn Tiến Vinh, N guyễn Sinh Khang, P hạm Văn Thế, D ươ ng Thị H oàn, J R egalado Jr., L.v A veryanov, A.L Averyanova D.D Soejarto, K.D Hill, S.K Wu, J Wen, A Farjon, s Swan, N Furey,

N guyễn M ạnh C ường, Vũ Ngọc Long

T ổ n g q u a n đặc điểm sin h học chủ yếu gặp b ệ n h n h â n ung th vòm m ũi họng V iệt N am M ột số ứ n g d ụ n g lâm sàng

Phan Thị Phi Phi

N h ữ n g k ế t q u ả nổ i b ậ t Đ ê tài n g h iê n cứu b ản vê áp d ụ n g kỹ th u ật sin h học p h ầ n tử V iện C ông n g h ệ S in h học, v iệ n KH& CNVN

Lê T rần Bình, N ơng V ăn Hải, Phan Văn Chi, Lê Q uang H uấn,

Trương Nam Hải, Đinh Duy Kháng

P a d n g đ ộ n g vật b ảo tồn n g u n g en V n Q uoc gia X uân Sơn - P hu Thọ

T rần M inh Hợi, N guyễn Xuân Đặng, Lê Đ ình Thuỷ, N guyễn Văn Sáng, Lê Xuân H uệ

I D A DẠNG SINH HỌC ■ •

V À BẢO TỒN NGUỒN GEN

K ết q u ả đ iề u tra bước đ ầu p h â n b ố k h u h ệ bò sát k h u bảo tồn th iê n n h iê n Bà N - N C húa, th n h p h ố Đà N ang

331 S d ụ n g h ệ izo zy m su p ero x id e d ism u ta za (SOD) tro n g n g h iê n u đa h ìn h di tru y ền và góp phần phân loại hai lồi thuốc Phyllattthus amarus vả Phyllanthus urinaria

à V iệt N a m

.H o n g Thị H òa, Đ inh Đ oàn Long, Cao Lệ Quyên, Trần Thị N huận, Phạm T hanh H uyền

332 N g h iê n cử u h a i k ỉế u tái sin h in vitro k h o lan g Ipom oea b atatas L.

N guyễn H ữ u Hổ, N guyễn V ăn U yển

333 N g h iê n u tạo p h â n tử chức n ă n g đ ế ứ n g d ụ n g tro n g y học

Lê Q uang H uân, Vũ Thị Bích H ườ ng

334 Đ n h giá đ a d n g n g u n g e n xoài V iệt N am (M angifera) sử d ụ n g kỹ th u ậ t RAPD

N guyễn Thị N gọc H uệ, T rần D anh Sửu, Trịnh H ồng Kiên

335 T ách dòng, xác đ ịn h so sá n h trìn h tự gen m ã hóa p ro tein N ib b ố n dòng virus gây b ệ n h đ ố m v ò n g trê n đ u đ ủ V iệt N am

N guyễn M inh H ùng, C hu H ồng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, Lê Duy Thành

336 P h ân tích đ a h ìn h d i tru y ề n tập đ o àn giố n g n ấm L inh C hi (G anoderm a) m ức độ p h â n tử n h ằ m p h ụ c v ụ công tác tu y ể n chọn p h â n loại giống nấm

T rần M ạnh H ùng, Đ ặng T rọng Lương, Bùi M ạnh Cường, N guyễn H uỳnh M inh Quyên

337 N g h iê n u công n g h ệ lê n m e n p h y tase từ vi k h u ẩ n Bacillus subtilis

Đỗ Thị N gọc H uyền, Lê Thiên Minh, N guyễn Thuỳ Châu, Trương Nam Hài

338 Biểu gen mã hóa protein vỗ virus gây bệnh viêm túi truyền nhiễm trứng gà

T rần Thị T hanh H uyền, Lê T hanh Hòa, Lê Q uang H uân

339 M ột số k h ác b iệ t h o ạt độ enzym , p h ổ b ăn g p ro tein A D N mối

M arcrotertnes carbonarius, M g ilvu s th u th ập M ã Đà Cát Tiên, tin h Đ ông Nai

Đ ặng Q u an g H ng, Phạm Thị T hanh Vân, Trần Thị H uyẽn Nga, N g u y ễn Q u an g H uy, Phan T uân N ghĩa

340 H aem ophilus influenzae T yp b: Đ ặc điểm sin h học p h â n tử, y ếu tố n g u ổ n lây m an g tín h gia đ ìn h

P han Lê T hanh H ương, Đ ặng Đức Anh, Vũ Thị Thu H n g , Lê N hật Minh, N gô Thị Thi, T rần Q uang C ảnh, Tsuguo Sasaki

341 K hảo sát tác đ ộ n g m ột số tác n h â n gây ức ch ế m iễn dịch lên h ệ m iễn dịch ch u ộ t n h ắ t trắ n g M us m usculus var A lbino

P han M inh Liêm, Phạm Văn Phúc, N guyễn Thị Thúy Anh, Phan Kim Ngọc, N gô Kê'Sương

1238

1242

1246

1250

1254

1258

1262

1266

1270

1274

1238

S IN H H Ọ C P H Ả N TỬ, T Ế BẢO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯ ỞNG ỨNG DỤNG

Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) nghiên cứu đa hình di truyền góp phần phân loại hai loàĩ thuốc Phyllanthus amarus va Phyỉianthus

urinaria Viêt Nam■

Hồng Thị Hịa, Đinh Đồn Long*, Cao Lệ Quyên, Trần Thị Nhuận

Trưởng Đại học KHTN, Đại học Quốc giá Hà Nội Phạm Thanh Huyền Khoa Tài nguyên Dược Liệu, Viện Dược Liệu, Bộ Y tế

MỞ ĐẦU

Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.) Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L.) lả hai loài thuốc thuộc chi Phyllanthus, họ Euphobiaceae, phân bố tương đối rộng rãi nước ta Hai loài cây thuốc sử dụng từ lâu đời y học cỗ truyền Việt Nam nhiều nước Châu Á Án độ, Malaysia, Thái lan, Campuchia, Lào, Trung Quốc, Indonesia Các tác dụng điều trị biết đến rộng rãi chúng bao gồm điếu trị rối loạn đường tiêu hóa (đặc biệt bệnh lý gan), bệnh tieu đường, số bệnh thận, đường tiết niệu (Calixto et al., 1998) Gần mpt số nghiên cưu dược lý đã chứng minh dịch chiết Phyllanthus có tác dụng ức chế q trình chép virus viêm gan siêu vi B loại retrovirus khác (bao gồm cà HIV) nhờ chế ức chế enzym chép ngược reverse transcriptaza (Thyagarajan et al„ 1988; Venkateswaran et ai., 1987; Chan et al„ 2003).

Riêng nước ta, vài năm gần đây, nhiều biệt dược có nguồn gốc từ Phyllanthus amarus p urinaria sản xuất sử dụng rộng rãi Trong đó, có thẻ kề đến Livbilnic®(Cơng ty cổ phần Dược phẩm Traphaco), VG-5® (Cơng ty Dược phẩm TW5), Hepaphyl® (Cơng ty Dược phẩm TW25), Hepamarin®, Livsin-94® (Cơng ty cổ phần Dược phẩm Hà Tây), .

Tuy vậy, việc sản xuất dược phẩm từ hai loài p amarus p urinaria dựa dược liệu thu hải tự nhiên bộc lộ số nhược điểm sau: (1) Việc thu hái khơng có quy hoạch dễ dẫn đến nguy mắt đi nguồn tài nguyên di truyền; (2) Việc thu hái từ dạng hoanq dại không đáp ứng yêu cầu của công nghiệp dược nguồn nguyên liệu ban đầu thường on định khó kiểm sốt thành phẩn hóa học, hoạt chất sinh học; (3) Dược liệu thu thập hoang dại có nguy nhiễm với dạng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) tác nhân gây bệnh khác, vi mang theo nguồn chất độc ngoài ý muốn; (4) Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy nhiêm độc với nguồn chất độc khác nhau, chẳng hạn chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, chất thải cõng nghiệp Ihu hái từ vùng bị ô nhiễm; (5) Trong thực tế, p amarus p urinaria lả hai lồi thuốc có đặc điểm hình thái giống giống với số lồi Phyllanthus khác cị Việt Nam, p niruri, p reticũlatus vốn quan tâm vi mục đích chế biến dược liệu Trước thực tế đó, việc thu hái dược liệu đứng trước nguy Cữ nhầm lẫn khó có thẻ đảm bảo chất lượng cho trinh sản xuát dược phẩm. Nhằm góp phần cung cấp cõng cụ phục vụ cho công tác bảo tồn, định hướng chọn tạo giống phân loại hai loài dược liệu dễ nhầm lẫn này, tiến hành đề tài “Sử dụng hệ izozym superoxide dismutaza (SOD) nghiên cứu đa hinh di truyền góp phằn phân loại h loài thuốc p amarus và P urinaria Việt Nam".

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu thự c vật

Đẻ thu thập nguyên liệu sử dụng nghiên cửu, chủng tiến hành bốn đợt điều tra xác định vị trí phân bổ tự nhien cua cac quằn thể hai Toài p amarus p urinaria số địa phương thuộc miền Bắc Cụ thể đợt tiến hành ngày 7-8/12/2004, Hà Nội Hà Tây; đợt ngày - 3/3/2005 Bắc Giang Hải Dương; đợt ngày - 8/3/2005 ngoại thành Hà nội; đợt từ ngày 24/3 đến ngày 29/3/2005 Hà nội, Hưng n, Hà Tây, Hịa Bình Vĩnh Phúc Từ mẫu thu được dựa vào khós phân loặi hình thái, chúng tỏi chpn 36 mâu có đặc điem hình thai tương đoi đi6n

hình CÙ3 hai lồi thuốc qusn tâm nghiên cứu, có 17 mâu thuộc loai p amarus (được ky

NHỮNG VẤN ĐỂ N G H IÊN cứu c B Ả N TRONG KHOA HỌC sự SỐNG 1239

hiệu lả A) 19 mẫu thuộc loải p urinaria (được kỷ hiệu U) Danh sách, đja điểm thời gian thu thập các mẫu nêu chi tiết Bảng 1.

Phân tích đa hình izozym

Phương pháp phân tích đa hỉnh izozym thực theo qui trinh Tansklẹy Orton (1983) kết hợp với Zimmerman (1989) cỏ cài tiến, với bước sau: (1) Chọn, cắt lấy phần non rừa sạch fcẳng nước cắt, thắm

khô; (2) Cân 500 mg mẫu chuyển vào cối sứ, bổ sung 500 111 dung dịch đệm nghiền thu dung dịch huyền phù đồng nhất (quá trình nghiền giữ đá lạnh); (3) Thu láy dịch đồng nhất chuyển vào ống eppendorf, ly tâm lạnh (4°C) 14.000 vòng/phủt, vòng phút; (4) Thu phần dịch phía trên để tiến hảnh phân tích hệ izozym SOD gel điện di polyacrylamid; (5) Điện di được tiến hành gel polyacrylamid gồm hai lớp (gel cô: 4% acrylamid, gel tách: 12% acrylamid); (6) Kết thúc trinh điện di, gel tách khỏi khuôn tiến hành nhuộm phân tích hệ izozym SOD.

Phân tích kết nghiên cứu

Tính đa hình hệ izozym SOD mẫu quần thể thuộc hai loài Phyllanthus amarus p urinaria biểu hiện thông qua khác biệt về thành phần tốc độ di chuyển tương đối (Rf) các bảng điện di trẽn gel phân tích Để phân biệt các băng đa hình, độ di chuyển tượng đối Rf xác định tỳ lệ khọảng

cách từ đầu gel tách đên vị

B ả n g D a n h s c h v đ ịa đ iể m t h u th ậ p c c m ẫ u q u ầ n

P h y lla n th u s a m a ru s v p u r in a ria

Ký hiệu Loài Địa điểm thu mẫu

t h ể h a i lo i

Thời gian Ahk Phyllanthus amarus Hoàn Kiếm, Hà Nội Đợt1 Utx P urinaria Thanh Xuân, Hà Nội Đ ọi

Uto P urinaria Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội Đợt

Ant Phyllanthus amarus Ngọc Trực, Từ Liêm, Hà Nội Đ ọi

Abđ Phyllarìthus amarus Ba Đinh, Hà Nội Đợt

Ubo P urinaria Đợt

Anb Phyllanthus amarus Nội Bài, Sóc Sơn, Hà Mội Đợt

Unb P urinaria Đợt

Ada Phyllanthus amarus Thị trấn Đông Anh, Hà Nội Đợt

Uđa P urinaria Đợt

Acl Phyllanthus amarus Cổ Loa, Đỏng Anh, Hà Nội Đ ợ t3

UcL P urinaria Đợt

Ahb Phyllanthus amarus Hài Bối, Đông Anh, Hà Nội Đợt

UhB P urinaria Đ ợ t3

Apt Phyllanthus amarus Phú Thị, Đông Anh, Hà Nội Đợt

Upt P urinaria Đợt

Upl P urinaria Phú Lỗ, Sóc Sơn, Hà Nội Đợt

Ath Phyllanthus amarus Tây Hồ, Hà Nội Đ ọi

Aođ Phyllanthus amarus Đống Đa, Hà Nội Đợt

Anh Phyllanthus amarus Ngũ Hiệp, Thanh Trì, Hà Nội Đợt

Amd Phyllanthus amarus Mao Điền, cẩm Giàng, Đợi 2

Umo P urinaria Hải Dương Đ ợ t2

Ahd Phyllanthus amarus Thành Hải Dương, Đ ợ t2

Uho P urinaria Hải Dương Đợt

Utk P urinaria Tứ Kỳ, Hải Dương Đợt

Avy Phyllanthus amarus Việt Yên, Bắc Giang Đợt

UvY P urinaria Đợt

Aln Phyllanthus amarus Lục Ngạn, Bầc Giang Đợt

Asđ Phyllanthus amarus Sơn Đông, Bắc Giang Đợt

Utt P urinaria Thuận Thành, Băc Ninh Đợt

Uw P urinaria Nghĩa Trai, Văn Lãm, Hưng Yên Đợt

UphL P urinaria Phú Lãm, Hà Đông, Hà Tây Đợt UlhT P urinaria Thường Tín, Hà Tây Đợt Ùls P urinaria Lương Sơn, Hịa Bình Đợt

Ayđ Phyllanthus amarus Yên Định, Thanh Hóa Đọt

Urn P urinaria Tam Đảo, Vĩnh Phúc Đợt

Đợt 1: ngày 7-8/12/2004; Đợt 2: ngày 2-3/3/2005; Đợt 3: ngáy 7-8/3/2005; Đợt 4: ngày 24-29/3/2005

0,63 p7 71 75 í ' K ĩẹ.

‘# •

i t - ị

f

1240

S IN H H Ọ C P H Â N TỬ, T Ế BÀO VÀ CÁC Đ ỈN H HƯ Ớ NG ỨNG DỤNG trí băng điện di so với chiều dải gel tách.

Các băng đa hinh ghi nhận dựa có mặt vắng mặt cua chúng Các số liệu được

- _ dựng sơ đõ hinh quan hệ di truyền mẫu quần thẻ thu được.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Phổ izozym SOD hai loài thuốc Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria Kết phận tích băng điện di hệ izozym SOD CÙ3 quằn thể p amarus p urinaria được thu thập địa điểm khác ca 4 đợt thu mẫu cho thấy có khác biệt rõ rẹt va kiểu hinh hệ izozym SOD hai loài thuoc này Mặc dù mâu hai loài thu thập từ các địa phương cách biệt mặt đja lý vào thời điểm khác (từ tháng 12/2004 đến tháng 3/2005), nhìn chung phổ điện cùa quằn thể phạm vi lồi có tính đồng hình r a n r t r h i õ t l rĩAi \ir>í\ m l Ằ n 1UẲ ì : r \

urinaria (ký hiệu U) chĩ cho các băng mờ không phát thấy bảng điện đi (Hình 1),

Khi phân tích 17 mẫu lồi p amarus, chủng tơi thu tổng cộng băng đa hình khác tương ứng với giá trị Rf 0,22; 0,40; 0,43; 0,52; 0,60; 0,63; 0,67; 0,71 0,75 Trong số đáng ý hợn có băng đồng hinh rõ nét xuất tât 17 mẫu quần thẻ loài p amarus (Rf = 0,63; Rf = 0,71 vá Rf = 0,75, xem Hinh 1) Trong đó, việc phân tích 19 mẫu quần thẻ cùa lồi P urinaria thấy xuát băng điện di 4/19 mẫu (chiếm ss 20%) Đó mẫu

Uvy, Unb, Utht, Uls với tồng sổ băng đa hình

(Rf = 0,45; Rf = 0,48; Rf = 0,63; Rf = 0;71 Rf = 0,75) Đối với 15/19 mẫu p urinaria cịn lại khơng quan sát thấy băng điện di Một điềm đáng ý

' «■ l i _ l í A V X » L X , _ +

Hệ số tư n g đ ò n g di tru yền

Hinh Sơ đồ quan hệ di truyền 36 quần thể mâu thuộc hại loài p amarus p, urinaria được xác định kỹ thuật phân tích chi thị izozym SOD (địa điem thu thập mẫu nêu bảng 1)

g a i II i a j r u a i i y u i y i I U I i v i y i U I W I I I u a n y V * I I U y

lữa lả số mẫu kẻ (đặc biết rõ hai mẫu Uvy Unb), băng điện di xuát vị :ri Rf 0,63; 0,71 0,75, vậ^ giống với băng đồng hình rõ nét quần thể lồi p amarus ^hưng, có khác biệt đoi với mẫu p, urinaria nảy, băng điện di chì biểu mờ với :ường độ sáng Ví so với mẫu p amarus Ngoài ra, quan sát thực tế, chúng tỏi thấy hai mẫu Jvy va Unb thu thập từ khu vực có phân bổ cùa cà hai loài p amarus p urinaria

>hạm vi hẹp Điều dẫn chúng tơi đến giả thiêt răng: mẫu Uvy Unb lã “con lai” hai

aài p a m a ru s p urin a ria , m ặ c dù hìn h thá i chúng m ang đ ặ c điểm giống với lồi p uríanaría (vì

fược xếp vào nhóm U) Đây tượng đáng quan tâm, chưa ghi nhận ighiên cứu phân loại loài Phyllanthus Mặc dù trước có số báo cáo cho thấy có ton

ủa d n g tru n g g ia n h in h thá i giữ a loài th u ộ c chi P hylla nthus (Taylor, 2003)

'iệ c tấ t cà c c m ẫu qu ần th ể loài p am a rus biểu băng đồ ng hinh rõ nét vị trí R f bang ,63; 0,71 vá ,7 tro n g c c bả ng khống xuất phằn lớn m ẵu loài p

rin aria , h o ặ c ch ì x u ả t m tro n g m ột s ố m âu quần thể đư ợ c nghi ngờ lả c c dạng trung gian, cho

lấ y có th ể sử dụ ng c h ỉ thị S O D đ ẻ ph ân loại nhanh hai loài p am a ru s p urinaria.

'ựa trẽn bảng đồng hinh đa hình phân tích hệ izozym SOD từ 17 mẫu quần thể loái p marus 19 mẫu quần thể lồi p urianaria, chúng tơi xác định hệ số đông dạng di truyền

n h ữ n g v ấ nđ ển g h i ê nc ứ u c ơb ả n t r o n gk h o a h ọ c s ự s ố n g 1241

urinaria việc sử dụng phần mềm NTSys 2.02h Kết trình bày Hình Từ kết phân tích, có thẻ chia quần thể hai loài p amarus vả p urinaria sử dụng nghiên cứu làm nhỏm Nhóm thứ nhắt bao gồm tồn 17 quần thẻ p amarus với hệ số tương đồng di truyền giao động khoảng từ 0,63 đến 1,00 Nhóm thứ hai gồm 14 quần thể p urinaria (bao gồm quần thẻ Ubđ Utx, Uđa, Ucli Uhb, Upt Utq, Uphi, Umđ, Uhdi Utk Uvl, U tt, Upl) có hệ số tương đồng truyền 1,00 (do hoàn toàn khỏnạ xuất băng điện di hệ izozym SOD) Nhóm cịn lại có thẻ dạng trung gian <Jũa hai nhóm gom mẫu quần thể Uw Unb, ƯThT,

Uls-KẾT LUẬN

Có thẻ sử dụng kỹ thuật phân tích hệ izozym SOD đẻ góp phần phân loại hai lồi thuốc Phyllarìthus amarus Schum Et Thonn vả Phyllarỉthus urinaria L., Trong băng điện di đặc trưng quẩn

thẻ p amarus thu nghiên cứu có Rf 0,63; 0,71 0,75 Phát thay số quần

thể có kiểu hỉnh loài p urinaria, băng điện di hệ izozym SOD cho thấy chúng dạng trung gian hai loài p amarus p urinaria Rất xảy tượng lai hai loài thuốc nảy tự nhiên Tuy vậy, để khăng định cần phải có nghiên cứu tiếp theo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Calixto JB, Santos AR, Cechinel FV, Yunes RA, 1998 A review of the plants of the genus Phyllanthus: their chemistry, pharmacology, and therapeutic potential Med Res Rev, 18(4): 225 - 258.

2 Chan HL, Sung JJ, Fong WF, Chim AM, Yung pp, Hui AY, Fung KP, Leung PC, 2003 Double-blinded placebo- controlled study of P urinaris for the treatment of chronic hepatitis B Ailment Pharmacol Ther 18: 339 - 345. 3 Rohlf FJ 1993 NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable analysis system version 1.80 Exeter software

Applied Biostatistics Ins., New York

4 Tanksles SD and Orton TJ, 1983 Isozymes in plant genetics and breeding Elsevier Science Publ., Amsterdam. Taylor L, 2003 Chanca piedra “stone breaker” (Phyllanthus (liruri) Sage Press Inc

6 Thyagarajan SP, Subramanian s, Thirunalasundari T, Venkateswaran PS, Blumberg BS, 1988 Effect of

Phyllanthus amarus on chronic carriers of hepatitis B virus Lancet, (8614): 764 -766.

7 Venkateswaran PS, Millman I, and Blumberg BS, 1987 Effects of an extract from p niruri on hepatitis and woodchuck hepatitis viruses: invivo and invitro studies Proceedings o f National Academy o f Science USA, 84: 274 -2

8 Zimmerman w s , Lumpkin TA, Watanable I, 1989 Isozyme differentiation of Azolla Euphytica 42: 163 - 170. ‘ Cơng trình tài trợ cùa Đại hpc Quốc gia Hà nội Các tác giả xin chân thánh cảm ơn PGS.TS Trịnh Đinh Đạt độc góp ỷ cho thào

SUMMARY

Assessment of genetic polymorphism and rapid

identification of the two medicinal plant species -

Phyllanthus amarus and p urinaria - by using

superoxide dismutase (SOD) isozyme markers

Hoang Thi Hoa, Dinh Doan Long, Cao Le Quyen, Tran Thi Nhuan

University of Science, VNU Hanoi

Pham Thanh Huyen

Department of Medicinal Plants Resource, National Institute of Medicinal Materials In Vietnam Phvllanthus amarus Schum Et Thonn and Phyllanthus urinaria L are the two most well-known medicinal plants among the species belonging to the genus Phyllanthus, family Euphobiaceae These medicinal plants have been used for centuries in the traditional medicine for treatment of sore throat, furunculosis, eczema, hematometra, hepatitis, ophtalmia, arthralgia, snake-bite

In o rd e r to a s s e s s th e g e n e tic d iv e rs ity o f th e s e m e d icin a l p la n ts and to e s ta b lis h a m e th o d fo r rapid id e n tifica tio n of

these two plant species, we performed the analysis of SOD isozyme markers The study revealed that the SOD isozyme orofifes of the two specks are obviously distinct All collected samples of p amarus accessions were specified by e S ro p h o re tfc markers of SOD isozym eat R f^ h a ta r e e q u a l ^ :0 71 and 0.75 Whereas, these markers were absent from most of p urinaria samples, except for some seemingly interspecific forms.

In conclusion our study indicated that the analysis of SOD isozyme markers might be used as a simple and cost- effective technique for assessment of genetic polymorphism and rapid distinction of the two medicinal plant species -

Phyllanthusamarus Schum Et Thonn and Phyllanthus urinaria L.

DANH SÁCH BÁO CÁO CÔNG Bố TẠI PHỤ TRƯƠNG TẠP CHÍ KHOA HỌC THÁNG 11-2005

Doan Huong Mai, Nguyen Xuan Huan, Pham Thi Lan

ESTABLISHING THE STATUS MAP OF ECOSYSTEMS IN KIM BOI DISTRICT HOA BINH PROVINCE

Nguyen Due Hong, Phung Thi Ngoc, Nguyen Huu Nhan

ENVIRONMENTAL AND LABOR CONDITIONS OF SEVERAL CRAFT VILLAGES IN HATAY AND NAMDINH

Nguyen Huu Nhan, Nguyen Due Hong

SOME ANTHROPOMETRICAL SIZES IN FACE, HEAD REGION AND THEIR APPLICATIONS IN DESIGNING MEANS OF PERSONAL PROTECTION

Nguyen Huy Chien, Nguyen Xuan Quynh

PRIMARY INVESTIGATING RESULT OF MACROINVERTEBRATE RESOURCE A T CA ESTUARY

Nguyen Nghia Thin, Ho Thi Tuyet Suong, Nguyen Manh Cuong

DIVERSITY OF LIANAS A T THE c u c PHUONG NATIONAL PARK

Nguyen Thi Kim Thanh, Nguyen Nghia Thin

MEDICINAL PLANTS OF CUC PHUONG NATIONAL PARK, VIETNAM

Nguyen Thuy Lien, Dang Thi Sy

GENUS COSMARIUM A T BA HAO LAKE, MA DA FORESTATION, DONG NAI PROVINCE

Nguyen Van Quang

BIODIVERSITY OF TERMITE (ISOPTERA) AND THEIR DISTRIBUTION IN HUONG SON DISTRICT, HATINH PROVINCE

Nguyen Van Vinh, Bae Yeon Jae

TWO NEW RECORDS OF HEPTAGENIIDAE (EPHEMEROPTERA, INSECTA) IN VIETNAM

Nguyen Xuan Huan, Doan Huong Mai

THE ORIENTATION OF ECOLOGICAL PLANNING IN KIM BOI DISTRICT TO THE YEAR 2010 SERVING SUSTAINABLE DEVELOPMENT

Thach Mai Hoang, Nguyen Manh Ha, Nguyen Thanh Tra

SURVEY ON WILD BOVINES (BOVIDAE SPP.) IN BU GIA MAP NATIONAL PARK (BINH PHUOC PROVINCE) AND NAM NUNG NATURE RESERVES (DAK NONG PROVINCE) IN 2005

Trinh Van Hanh, Dinh Xuan Tuan, Nguyen Minh Due, Nguyen Thi My, Nguyen Van Quang

TESTING RESULTS OF METARHIZIUM OUTPUT USING FOR CONTROLLING ODONTOTERMES HAINANESIS ON THE DIKES

Truong Quang Hoc, Pham Binh Quyen, Hoang Van Thang

BIODIVERSITY OF THE TYPICAL ECOLOGICAL REGION, QUANG BINH & QUANG TRI

Vu Trung Tsng, Chu Tien Vinh, Chea Phala

AGE AND GROWTH OF GREATER LIZARDFISH (SAURIDA TUMBIL, BLOCH 1785) IN THE GULF OF TONKIN OF VIETNAM

Bui Thi Viet Ha, Pham Van Ty, Tu Minh Koong, Le Gia Hy

NEW I SOLA TED STRAIN OF STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS TC54 AND THE USE ITS CULTURAL BROTH AS C R U D E ANTIBIOTIC FOR CONTROL OF PHYTOPHATHOGENIC FUNGI

Ha Thi Thanh Binh, Nguyen Quoc Khang _ _ _

ANTI-OXIDATION OF FLAVONOIDS FROM CAMELLIA SINENSIS (CAMELLIA SINENSIS LINDL o KUNTZE)

Hoana Thi Hoa, Dinh Doan Long, Le Duy Thanh

DISCRIMINATION OF THE TWO MEDICINAL PLANTS - PHYLLANTHUS AMARUS AND PHYLLANTHUS URINARIA - REVEALED BY ISOZYME MARKERS

Ngo Giang Lien, Pham Due Ngoc, Truong Dinh Co, Ngo Thi Huong.

USE OF THE SINGLE COCKTAIL POLYMERASE CHAIN REACTION TO IDENTIFY MEMBERS OF

a n o p h e l e sm in im u s g r o u pb e l o n g in g t o THEMYZOMYIA s e r ie s in VIETNAM

Nguyen Quoc Khang, Yves Engelborghs, Johan Hoebeke

KINETIC AND EQUILIBRIUM STUDIES ON THE INTERACTION OF ARTOCARPUS INTEGRIFOLIA LECTIN WITH GALACTOSE AND GALACTOSE ANALOGUES

Nguyen Thi Van Anh, Nguyen Thi Thao, Nguyen Mong Hung, Phan Tuan Nghia

EARLY INDENTIFICATION OF SEX IN CHICKEN EMBRYO USING MULTIPLEX PCR OF CHD GENE

Nguyen Trung Thanh, Niranjana H Murthy, Yu Kee Won, Hahn Eun Jun, Paek Kee Yoeup

LARGE-SCALE CULTIVATION OF PANAX GINSENG c A MEYER CELL SUSPENSION FOR GINSENOSIDES PRODUCTION: EFFECT OF INOCULUM SIZE

Pham Thi Kim Trang, Nguyen Van Mui, Phạm Hung Viet, Michael Berg, Shinsuke Tanabe

APPLICATION OF BIOMARKERS FOR ASSESSMENT OF ARSENIC EXPOSURE FROM GROUNDWATER IN VIETNAM

Trinh Dinh Dat, Hoang Kim Phuc, Dinh Nho Thai, Nguyen Van Quang, Dinh Doan Long

ĐẠI HỌC Q UỐC GIA HÀ NỘI

TRUỒNG Đ Ạ I HỌC KHOA HỌC T ự N H IÊ N K H O A SINH HỌC

Cao Lệ Q uyên

s DỤNG MỘT SÔ HỆ IZOZYM TRONG NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH DI TRUYỂN v g ó p p h ầ n p h â n

LOẠI HAI LOÀI CÂY THUỐC PHYLLANTHUS

AMARUS VÀ PHYLLANTHUS URINARIA L

THU THẬP Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY Ngành: Sinh học

C án hướng d ẫn : Th.s Hoàng Thị Hoà TS Đinh Đoàn Long

PHIẾU ĐÃNG KÝ

KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u KH-CN

T ên đề tà i : Sử dụng số hệ izozym để nghiên cứu đa dạng di truyền sơ lồi dược liệu địa Việt nam

Mã số: QT-04-15

Cơ quan chủ trì đề t i : Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Tel: 8584287

Tổng kinh phí thực thỉ: 16.000.000 VNĐ

Trong đó: - Từ kinh phí nhà nước: khơng

- Kinh phí trường: : 16.000.000 VNĐ - Vay tín dụng: khơng

- Vốn tự có: khơng - Thu hồi: khồng Thời gian nghiên cứu: năm

Thời gian bắt đầu: 4/2004 Thời gian kết thức: 12/2005

Tên cán phối hợp nghiên cứu:

TS Đinh Đoàn Long KTV Trần Thị Nhuận ThS Phạm Thanh Huyền

Số đăng ký đề tài:

Ngày:

Số chứng nhận đăng ký kết nghiên cứu:

Bảo mật:

Tom tăt kêt nghiên cứu:

Vj ,Kêt cho thấy sử dụng kỹ thuật phân tích izozym SOD, EST PO

P // giá mức đa dạng, khoảng cách di truyền phân loại nhanh loài

m tjtyuanthus amarus Phylỉanthus urinaria từ nhỏ (đăc biêt

hệ izozym SOD)

- Các băng điện di phổ izozym SOD đặc trưng riêng quần thể loài p

amarus nghiên cứu có Rf= 0,63; Rf= 0,71 va Rf= 0,75 Các băng điện

di phổ izozym EST đặc trưng riêng quần thể lồi p amarus có Rf=0 09 Rf=0,42 Các băng điện di phổ izozym PO đặc trưng riêng quần thể lồi p amarus có Rf= 0,85 Rf= 0,87.

Phát quẩn thể Phyllanthus urinaria L Nội Bài, Sóc Sơn có phổ izozym SOD mang băng đặc trưng lồi Phyllanthus amarus Có thể lai giữa loài Phyllanthus amarus Phyllanthus urinaria L.

- Đã đăng báo khoa học (1 tiếng Việt tiếng Anh) - Đào tạo cử nhân Sinh học: Sinh viên Cao Lệ Quyên lớp Sinh K46A

Kiến nghị quy mô đối tượng áp dụng nghiên cứu:

1 Tiếp rục nghiên cứu, hoàn thiện kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền loài Phyllanthus spp đối tượng khác, nhằm góp phần vào việc phân loại kiểm định dược liệu

2 Có nghiên cứu sâu quần thể Phyllanthus urinaria L Nội Bài, Sóc Sơn để khẳng định xem có lai lồi hay khơng?

Chủ nhiệm đề tài Thủ trưởng

quan chủ trì để tài

Chủ tịch Hội đồng

đánh giá

thức

T h ủ trư n g q u a n q u ả n lý đề tài

Họ tên Hoàng Thị Hồ $U) h ù ị C dfy UỉUh TitảítyẹL

T Ị

Học hàm

Học vị ThS GVC

ụ

PCrí r< K n n m U ẸM y/

: ■ :.?H

.L i ,ti\ ^ỗ4Ì&

Ký tên

Đóng dấu

' Á y /

l \ - \

V V

5 '■ cX b / ^ ụ ■r? ■ /

1 - J ) ị

s *

N