Nghiên cứu đa dạng di truyền các xuất xứ xá xị cinnamomum parthenoxylon jack meisn tại tỉnh quảng ninh và tỉnh hòa bình sử dụng chỉ thị DNA mã vạch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP o0o KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC XUẤT XỨ XÁ XỊ (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) TẠI TỈNH QUẢNG NINH VÀ TỈNH HỊA BÌNH SỬ DỤNG CHỈ THỊ DNA MÃ VẠCH NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Lý Thị Thương Lớp : K61 – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, với biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ bảo tận tình em trình thực khóa luận trường, đặc biệt giúp đỡ thầy cô bên môn Công nghệ gen Di truyền phân tử Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Hà Bích Hồng trực tiếp hướng dẫn, truyề n đa ̣t kiế n thức và kinh nghiê ̣m để em thực và hoàn thành đề tài tốt nghiệp Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ, gia đình, bạn bè - người động viên, khích lệ em suốt trình học tập, rèn luyện thực khóa luận tốt nghiệp Do q trình thực nhiều hạn chế mặt thời gian, kiến thức kinh nghiệm khơng tránh khỏi thiếu sót định Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn để khóa luận tốt nghiệp em hồn thành Kinh phí thực hiê ̣n đề tài đươ ̣c hỗ trơ ̣ bởi đề tài cấ p Nhà nước “Khai thác phát triển nguồn gen Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) số tỉnh miền Bắc” Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2020 Sinh viên thực Lý Thị Thương i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Xá xị 1.1.2 Đặc điểm hình thái chung Xá xị 1.1.3 Thành phần hóa học tinh dầ u Xá xị 1.1.4 Các công dụng gỗ Xá xị 1.2 Tổng quan nghiên cứu phân loại họ Long não (Cinnamomum) giới 1.3 Nghiên cứu ho ̣ Long naõ ta ̣i Viêṭ Nam 1.3.1 Nghiên cứu phân loại họ Long não 1.3.2 Nghiên cứu giá trị nguồn gen loài họ Long não 1.4 Tổng quan mã vạch DNA (DNA barcode) 1.4.1 Giới thiệu mã vạch DNA 1.4.2 Các đặc điểm trình tự DNA mã va ̣ch 1.4.3 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 1.4.4 Ứng dụng DNA mã va ̣ch 12 1.5 Một số nghiên cứu sử dụng DNA mã vạch thực vật 14 1.5.1 Một số nghiên cứu sử dụng DNA mã vạch giới 14 1.5.2 Một số nghiên cứu sử dụng DNA mã vạch Việt Nam 15 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 ii 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 17 2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.3.2 Hóa chất 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu 18 2.4.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 18 2.4.3 Kiểm tra sản phẩm DNA sau tách chiết 20 2.4.4 Phương pháp PCR với mồi đặc hiệu 21 2.4.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 22 2.4.6 Phương pháp phân tích số liệu 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Tách chiết DNA tổng số 24 3.2 Kết nhân các đoa ̣n triǹ h tự DNA mã va ̣ch kỹ thuật PCR 24 3.2.1 Kết nhân đoạn trình tự matK 24 3.2.2 Kết nhân đoạn trình tự rbcL 26 3.2.3 Kết nhân đoạn trình tự trnH-psbA 27 3.3 Kết giải trình tự nucleotide đoa ̣n DNA mã vạch của các mẫu Xá xi ̣ 28 3.3.1 Kết giải trin ̀ h tự nucleotide đoạn gen matK 28 3.3.2 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen rbcL 33 3.3.3 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA 37 3.4 So sánh hiêụ quả giám đinh ̣ loài và nghiên cứu đa hiǹ h di truyề n của trình tự DNA mã va ̣ch 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 43 ̣ 4.1 Kế t luâ ̣n 43 4.2 Kiế n nghi 43 ̣ TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt ATP bp cpDNA CTAB CBOL DNA dNTP Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Adenosin triphosphat Base pair Chloroplast DNA Cetyl trimethylammonium bromide Consortium for the Barcode of Life Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphosphate Adenosin triphosphat Cặp base gen lục lạp Cetyl trimethylammonium bromide Consortium for the Barcode of Life Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleotid triphosphate axit ethylenediamine tetraacetic Mồi xuôi vùng liên gen vùng DNA nằm gen 1000 cặp base DNA ty thể Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Trung tâm Quốc gia Thông tin Công nghệ sinh học Phản ứng chuỗi polymerase EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid F-Primer IGS ITS kb mtDNA Foward-Primer Intergenic Spacer Internal Transcribed Spacer Kilobase (1000 base) Mitochondrial DNA Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate National Center for Biotechnology Information Polymerase Chain Reaction Restriction fragment length polymorphism Ribonucleic acid Ribosomal RNA Reverse primer Tris-Acetate-EDTA Transfer RNA Untraviolet v/p NAD(P)H NCBI PCR RFLP RNA rRNA R-Primer TAE tRNA UV V/p iv Phân tích đa hình trình tự DNA Axit ribonucleic ARN ribosome Mồi ngược Tris-Acetate-EDTA ARN vận chuyển Tia cực tím Vòng / phút DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng PCR 21 Bảng 2.2 Trình tự thơng tin cặp mồi 21 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt độ cho phẩn ứng PCR mồi matK, rbcL, trnH-psbA 22 Bảng 3.1 Một số lồi ngân hàng gen có trình tự gen matK tương đồng với trình tự đoạn gen matK mẫu Xá xị HB01 Tỉnh Hịa Bình 31 Bảng 3.2 Một số loài ngân hàng gen có trình tự gen matK tương đồng với trình tự đoạn gen matK mẫu Xá xị QN02 Tỉnh tỉnh Quảng Ninh 31 Bảng 3.3 Một số lồi ngân hàng gen có trình tự đoạn gen rbcL tương đồng với đoạn gen rbcL nhân mẫu HB01 Tỉnh Hịa Bình 35 Bảng 3.4 Một số loài ngân hàng gen có trình tự đoạn gen rbcL tương đồng với đoạn gen rbcL nhân mẫu QN02 Tỉnh tỉnh Quảng Ninh 35 Bảng 3.5 Vị trí nucleotide sai khác 04 mẫu Xá xị Tỉnh Hịa Bình 38 Bảng 3.6 Một số lồi ngân hàng gen có trình tự đoạn gen trnH-psbA tương đồng với đoạn gen trnH-psbA nhân 05 mẫu Xá xị 39 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây, lá, hoa Xá xị Hình 3.1 Kết nhân trình tự đoạn matK 07 mẫu Xá xị Tỉnh tỉnh Quảng Ninh Tỉnh Hịa Bình 25 Hình 3.2 Kết nhân trình tự đoạn rbcL 07 mẫu Xá xị Tỉnh tỉnh Quảng Ninh Tỉnh Hịa Bình 26 Hình 3.3 Kết nhân trình tự đoạn trnH-psbA 07 mẫu Xá xị Tỉnh tỉnh Quảng Ninh Tỉnh Hịa Bình 27 Hình 3.4 So sánh trình tự nucleotide trình tự gen matK mẫu Xá xị HB01 HB04 30 Hình 3.5 Cây quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị với 03 lồi có trình tự gen matK tương đồng ngân hàng gen quốc tế 33 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide trình tự gen rbcL mẫu Xá xị HB01 HB03 34 Hình 3.7 Cây quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị HB01 QN02 với 03 lồi có trình tự rbcL tương đồng ngân hàng gen quốc tế 36 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide trình tự gen trnH-psbA mẫu Xá xị HB01, HB02, HB03 HB04 37 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide đoa ̣n DNA mã va ̣ch trnH-psbA 04 mẫu Xá xị ta ̣i Hòa Bin ̀ h với mẫu Xá xị ta ̣i Quảng Ninh 39 Hình 3.10 Cây quan hệ di truyền 05 mẫu Xá xị với 03 lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng ngân hàng gen quốc tế 40 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước nhiệt đới nằm vùng Đơng Nam Á, có tổng diện tích tự nhiên 331.700km2, kéo dài từ vĩ độ 90 Bắc tới 230 Bắc, diện tích rừng đất rừng 20 triệu ha, chiếm khoảng 60% diện tích tồn quốc Hệ thực vật rừng Việt Nam phong phú đa dạng, có khoảng 11.000 lồi thuộc 2.500 chi Hiện nay, có nhiều loài bị khai thác mức và đứng trước nguy tuyệt chủng Theo Sách đỏ năm 1996 có 356 lồi thực vật bị đe mức độ khác nhau, sau 11 năm (2007) danh sách tăng lên 100 lồi bị đe doạ, có 462 lồi thực vật bị đe ̣a mức độ khác sách đỏ năm 2007 [9] Những lồi có giá trị kinh tế phục vụ trồng rừng có khả cung cấp giống hạn chế Xá xị (Cinnamomum parthenoxylum) loại gỗ cao cấp, có gen xếp nhóm IIA thuộc Nghị định 06/2019/NĐ-CP Chính phủ năm 2019, nhóm CR nguy cấp Sách Đỏ Việt Nam năm 2007 Xá xị loại đa tác dụng phân bố số tỉnh miền Bắc Việt Nam Cao Bằng, Quảng Ninh, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, v.v Ngoài có giá trị gỗ cao xây dựng, làm đồ thủ công mĩ nghệ, phận khác dùng để chưng cất tinh dầu dùng công nghiệp y dược, đánh giá loại có giá trị kinh tế cao Xá xị cho gỗ tốt, có ván đẹp, khơ bị nứt nẻ hay biến dạng, không bị mối mọt, dễ gia công chế biến Quả dùng chữa cảm, sốt, lỵ, ho gà Tinh dầu Xá xị chứa hầu hết phận (lá, vỏ, thân rễ), sử dụng rộng rãi công nghệ hoá mỹ phẩm, thực phẩm dược phẩm Tinh dầu cịn dùng làm thuốc xoa bóp, chữa thấp khớp, đau nhức Lá dùng làm thuốc cầm máu, chữa đau dày, phong thấp, mẩn ngứa da Mặc dù có giá trị kinh tế cao, nghiên cứu loài này Việt Nam cịn hạn chế Do đó, em thực đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) tỉnh Quảng Ninh tỉnh Hịa Bình sử dụng thị DNA mã vạch” nhằm xây dựng sở liệu DNA mã vạch, phục vụ cho giám định loài quản lý nguồn tài nguyên sinh vật CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀ I LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố Xá xị Cây Xá xị có tên khoa học Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn thuộc họ Long não ( Lauraceae), chi Long não (Cinnamomun) Tên đồng nghĩa: Laurus parthenoxylon Jack, 1820; Laurus porrecte Roxb 1832; Sassafras parthenoxylon (Jack) Nees, 1836; Cinnamomum simondii Lecomte, 1913; Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm 1952 Tên khác: Co chấu, Re dầu, Re hương Cây Xá xị thường mọc vươn cao đón ánh nắng mặt trời nên phù hợp với khí hậu nóng ẩm nhiệt đới gió mùa Cây tìm thấy nhiều vùng rừng nhiệt đới Việt Nam, Malaysia, Thái Lan quốc gia thuộc bán đảo Ấn Độ Ở Việt Nam Xá xị mọc tỉnh phía Bắc nhiều Tây Nguyên, tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Quảng Ninh,Vĩnh Phúc, mọc chủ yếu từ Bắc Trung Bộ trở vào Nam [10] 1.1.2 Đặc điểm hình thái chung Xá xị Trong dân dan Xá xị cịn có tên gọi khác Gù Lương, Re Dầu, Re Hương, Vù Hương Chưa có lý giải có tên Xá xị, mùi hương thơm dịu nhẹ tạo cảm giác thư thái giống nước giải khát Xá xị Cây Xá xị lâu năm trưởng thành đạt chiều cao từ 12m đến 20m, gỗ với đường kính thân 50cm đến 60cm Thân có vỏ màu xám nâu cho mùi thơm đặc trưng Lá Xá xị rộng khoảng 6cm dài từ 11cm đến 18cm Có hai kiểu lá: có gân lơng chim có gân, thấy hai loại cành Hai mặt có màu xanh lục, nhẵn Gân rõ mặt, thường phẳng theo mặt Lá non thường có màu đỏ, nhẵn hai mặt Chồi hoa thường mập, mang nhiều vảy chồi Cây Xá xị hoa có mùi thơm dịu, màu trắng Cụm hoa dạng chùy hay tán, mọc đầu cành hay nách lá, dài từ 6-12 cm, cụm mang khoảng 15 hoa Hoa lưỡng tính: bao hoa thuỳ, màu trắng vàng, nhị 9, bao phấn ơ, nhị có lơng, nhị vịng có tuyến mật, nhị lép Quả hạch, hình cầu, đường kính 0,8-1,2 cm, đế hình chén, có khía răng, chín màu tím đen Mùa hoa tháng 3-7, mùa chín tháng 10 -11 [10] (agarwood.org.vn) Hình 1.1 Cây, lá, hoa Xá xị 1.1.3 Thành phần hóa học tinh dầ u Xá xị Các nghiên cứu cho biết vỏ Xá xị có hàm lượng tinh dầu cao lên đến 6%, hàm lượng tinh dầu gỗ khoảng 2% Tinh dầu Xá xị có đặc điểm lỏng nặng nước với tỉ trọng khoảng 1,070 – 1,076 so với nước Trong tinh dầu Xá xị có 80% chất safrol ete metylenic allylpyrocatechin, cịn có chất pinen, eugenol, phellandren, eugenol long não Trong công nghiệp chất safrol oxi hóa Kali permanganat thu ete metylic andenhit protpcatechic có mùi heliotrope dùng hương liệu với tên heliotropin hay piperonal [5], [27]  Công dụng tinh dầu Xá xị Tinh dầu Xá xị có đặc điểm lỏng nặng nước sử dụng nhiều mục đích khác Ngồi việc tỏa mùi hương mang lại thư thái, tinh dầu Xá xị cịn giúp xua đuổi trùng, làm đẹp, chữa bệnh Trong y học dân gian tinh dầu Xá xị tin dùng để điều trị chứng bệnh hen xuyễn, tiểu khó, đau bụng, nơn mửa Ngày chiết xuất từ Xá xị kết hợp với tây y hỗ trợ điều trị bệnh hơ hấp, tim mạch, tiêu hóa hay bệnh hơ hấp, tim mạch, tiêu hóa hay bệnh đường tiết niệu nhờ khả 3 Cinnamomum aromaticum NC_046019.1 99,87% Qua bảng 3.1 3.2 cho thấy 02 mẫu Xá xị HB01 QN02 đề u có tỷ lê ̣ tương đồ ng 100% với loài Cinnamomum parthenoxylon Điề u này khẳ ng đinh ̣ đoa ̣n trình tự matK có khả giám đinh ̣ chính xác loài Xá xi ̣ ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh Các mẫu thu thâ ̣p ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh đã đươ ̣c xác đinh ̣ là loài Cinnamomum parthenoxylon dựa các điề u tra về đă ̣c điể m hình thái (Phùng Văn Phê, 2019, trao đổ i cá nhân) Với kế t quả giám đinh ̣ sử du ̣ng đoa ̣n trình tự DNA mã va ̣ch matK đã góp phầ n khẳ ng đinh ̣ kế t quả nhâ ̣n diê ̣n bằ ng hiǹ h thái là chiń h xác Điề u này cho thấ y viê ̣c sử du ̣ng DNA mã va ̣ch để giám đinh ̣ loài là hoàn toàn đáng tin câ ̣y và trình tự matK là mô ̣t chỉ thi ̣ có đô ̣ chiń h xác cao đố i với loài Xá xi.̣ Thêm vào đó, loài C parthenoxylon với mã số MH050971.1 và mã số KJ510895.1 đề u có xuấ t xứ ta ̣i Trung Quố c nên có thể giả thuyế t rằ ng loài Xá xi ̣ ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh có chung nguồ n gố c phát sinh với loài C parthenoxylon ta ̣i Trung Quố c Ngoài loài Cinnamomum parthenoxylon có đô ̣ tương đồ ng 100%, thì hai loài khác có đô ̣ tương đồ ng thấ p với cả mẫu HB01 và QN02 cũng đề u là loài thuô ̣c chi Long naõ (Cinnamomum) Cây quan ̣ di truyền 02 mẫu Xá xị 03 loài tương đồng cao nhấ t ngân hàng gen quốc tế đươ ̣c thể hiêṇ hiǹ h 3.5 Sử du ̣ng phần mềm Mega7, chúng xác định khoảng cách di truyền 02 mẫu Xá xị với 03 lồi có độ tương đồng cao nhấ t ngân hàng gen quốc tế Qua quan hệ di truyề n ta nhận thấy cả hai mẫu HB01 và QN03 là loài Xá xi ̣ (Cinnamomum parthenoxylon) và có quan ̣ ho ̣ hàng gầ n với hai loài Cinnamomum yabunikkei loài Cinnamomum aromaticum Kế t quả này đươ ̣c thể hiêṇ với đô ̣ tin câ ̣y 100% (chỉ số bootstrap 100%) 32 Hình 3.5 Cây quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị với 03 lồi có trin ̀ h tư ̣ gen matK tương đồng ngân hàng gen quốc tế Qua kết so sánh phân tích đoa ̣n trình tự matK ở các mẫu Xá xi ̣ ta ̣i tỉnh Hòa Biǹ h và tỉnh Quảng Ninh, nhận thấy trình tự gen matK khơng thích hợp cho việc xác định đa dạng di truyền xuấ t xứ lại trình tự mã va ̣ch định danh loài Xá xi ̣với đô ̣ tin câ ̣y rấ t cao 3.3.2 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen rbcL Trình tự đoạn gen rbcL 07 mẫu Xá xị sau nhân có đoạn trình tự có kích thước khoảng 573bp, sau phân tích cơng cụ BioEdit chúng tơi thu đoạn đoạn trình tự có kích thước 531bp cho chất lượng tốt Do đó, chúng tơi dụng trình tự có kích thước tốt để tiến hành so sánh phân tích  So sánh trình tự gen rbcL nhân 04 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình Sử dụng kết đoạn gen có chất lượng tốt để so sánh 04 mẫu Xá xị với công cụ BLAST, sau so sánh chúng tơi nhận thấy có tương đồng 100% mẫu HB01 với mẫu HB02 mẫu HB03 tương đồng 100% với mẫu HB04 Sự sai khác hai nhóm trình tự HB01, HB02 HB03, HB04 thể hình 3.6 Trong đó, trình tự nucleotide mẫu 33 HB01 đại diện cho nhóm HB01 HB02, trình tự nucleotide mẫu HB03 đại diện cho nhóm HB03 HB04 Hình 3.6 So sánh trình tự nucleotide trình tự gen rbcL mẫu Xá xị HB01 HB03 Qua hình 3.6 ta nhận thấy có 04 vị trí sai khác 02 mẫu Xá xị HB01 HB03 vị trí cụ thể sau: vị trí 47, 60, 61 234 mẫu Xá xị HB01 nucleotide loại A, A, G G mẫu Xá xị HB03 nucleotide loại C, G, A C  So sánh trình tự gen rbcL nhân 03 mẫu Xá xị tỉnh Quảng Ninh Sử dụng kết phân tích trình tự gen rbcL có chất lượng tốt BioEdit để so sánh 03 mẫu Xá xị với công cụ BLAST, thu kết có tương đồng 100% 03 mẫu QN02, QN03 QN04 Điều cho thấy trình tự gen rbcL nhân 03 mẫu Xá xị tỉnh Quảng Ninh có bảo thủ so với trình tự nucleotide 04 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình Từ so sánh riêng biệt trình tự 02 vùng trên, để thấy đa dạng di truyền giữ vùng tiến hành lấy đại diện mẫu Xá xị QN02 tỉnh Quảng Ninh (do tương đồng mẫu 100%) để so sánh 34 với 04 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình chúng tơi nhận kết mẫu Xá xị HB03 HB04 tỉnh Hịa Bình có tương đồng 100% với 03 mẫu Xá xị QN02, QN03, QN04 tỉnh Quảng Ninh Do đó, sai khác xuất xử thể giống với sai khác đoạn trình tự nucleotide mẫu HB01 HB03 hình 3.6 Sau có tất đoạn trình tự gen rbcL so sánh với nhau, nhận thấy có sai khác 04 vị trí nucleotide nhóm mẫu HB01, HB02 với nhóm mẫu HB03, HB04, bên cạnh mẫu HB03 HB04 lại có tương đồng 100% với 03 mẫu Xá xị tỉnh Quảng Ninh Do đó, để tiến hành tìm kiếm lồi có tỷ lệ tương đồng với trình tự đoạn gen nhân 07 mẫu Xá xị ngân hàng NCBI Lấy đại diện mẫu HB01 QN02 để phân tích tìm kiếm lồi tương đồng công cụ BLAST, chúng cho ̣n đươ ̣c 03 trình tự tương ứng với 03 loài có mức đô ̣ tương đồ ng cao nhấ t với mỗi mẫu để thực hiêṇ xây dựng quan ̣ di truyề n (Bảng 3.3 và 3.4) Bảng 3.3 Một số lồi ngân hàng gen có trình tự đoạn gen rbcL tương đồng với đoạn gen rbcL nhân mẫu QN02 tỉnh Hịa Bình STT Tên loài Mã số Tỷ lệ tương đồng Cinnamomum parthenoxylon MH050971.1 99,81% Cinnamomum camphora MH050970.1 99,81% Cinnamomum bodinieri MH270455.1 99,81% Bảng 3.4 Một số loài ngân hàng gen có trình tự đoạn gen rbcL tương đồng với đoạn gen rbcL nhân mẫu QN02 tỉnh Quảng Ninh STT Tên loài Mã số 35 Tỷ lệ tương đồng Cinnamomum parthenxylon KX546848.1 99,81% Cinnamomum camphora MG021326.1 99,81% Cinnamomum longipaniculatum KX546846.1 99,81% Qua bảng thống kê 3.3 3.4 ta thấy 02 mẫu Xá xị HB01 QN03 có sai khác nhỏ với 04 loài Cinnamomum parthenxylon, loài Cinnamomum camphora, loài Cinnamomum bodinieri lồi Cinnamomum longipaniculatum tìm thấy ngân hàng gen NCBI Dựa vào bảng thống kê, sử dụng phần mềm Mega7 xây dựng quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị với 03 lồi với đoạn trình tự tương đồng tìm thấy ngân hàng gen quốc tế hình 3.7 C cam(MH050970.1) C bod(MH270455.1) 100% C par(MH050971.1) HB01 rbcL QN02 rbcL C par(KX546848.1) 99% C lon(KX546846.1) C cam(KX546832.1) Hình 3.7 Cây quan hệ di truyền 02 mẫu Xá xị HB01 QN02 với 03 lồi có trình tự rbcL tương đồng ngân hàng gen quốc tế Qua hình 3.7 quan hệ di truyền, nhận thấy 02 mẫu HB01 QN02 có di truyền gần với lồi Cinnamomum parthenoxylon có quan hệ xa loài Cinnamomum camphora Kết thể với độ tin cao (chỉ số boostrap tới 99-100%), bên cạnh trình tự gen rbcL 36 phần đa dạng di truyền mẫu vùng với nhau, để định danh loài chưa có biểu rõ ràng qua đoạn trình tự gen rbcL nhân 07 mẫu Xá xị 3.3.3 Kết giải trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA Trình tự gen trnH-psbA sau nhân đem giải trình tự thu đoạn trình tự có kích thước 476bp sau q trình phân tích cơng cụ BioEdit chúng tơi thu đoạn trình tự trnH-psbA có kích thước 250bp có trình tự tốt Do đó, chúng tơi sử dụng kích thước đem so sánh phân tích với mẫu ngân hàng gen quốc tế NCBI cơng cụ BLAST  So sánh trình tự gen trnH-psbA nhân 04 mẫu Xá xị Tỉnh Hịa Bình Sử dụng kích thước có chất lượng tốt trình tự đoạn gen trnHpsbA 04 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình để tiến hành so sánh trình tự với ngân hàng gen quốc tế, chúng tơi nhận thấy có sai khác đoạn trình tự Do đó, chúng tơi sử dụng cơng cụ BioEdit để tiến hành phân tích đoạn trình tự nucleotide để thấy rõ sai khác nucleotide trình tự gen nhân 04 mẫu Xá xị, kết so sánh đoạn trình tự nucleotide thể hình 3.8 Hình 3.8 So sánh trình tự nucleotide trình tự gen trnH-psbA mẫu Xá xị HB01, HB02, HB03 HB04 37 Các vị trí sai khác nucleotide trình tự gen trnH-psbA 04 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình thể cụ thể bảng thống kê 3.5 có đến 11 vị trí sai khác nucleoide mẫu Xá xị với không theo quy luật định Bảng 3.5 Vị trí nucleotide sai khác 04 mẫu Xá xị tỉnh Hòa Bình 28 85 120 141 142 154 162 168 170 179 252 HB01 T A G C C C A G G T G HB02 T A G C C C G A G T A HB03 G G A A A A A A A A G HB04 G G G A A A G G A A G Vị trí Mẫu Qua bảng thống kê vị trí sai khác 04 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình, chúng tơi phần thấy đa dạng di truyền thể rõ ràng khẳng định trình tự gen trnH-psbA sử dụng để xác định đa hình Xá xị  So sánh trình tự gen trnH-psbA nhân 03 mẫu Xá xị tỉnh Quảng Ninh Sử dụng đoạn trình tự có kích thước tốt trình tự đoạn gen trnHpsbA 03 mẫu Xá xị tỉnh Quảng Ninh để tiến hành so sánh đoạn trình tự cơng cụ BLAST Qua chúng tơi nhận thấy có tương đồng 100% 03 mẫu QN02, QN03 QN04 với Từ kết so sánh đoạn trình tự gen trnH-psbA nhân mẫu Xá xị, ta nhận thấy chưa chưa có đa dạng mẫu tỉnh Quảng Ninh Để thấy rõ đa dạng di truyền mẫu vùng khác nhau, chúng tơi lấy đoạn trình tự đại diện mẫu QN02 tỉnh Quảng Ninh (do có tương đồng 100% mẫu) để so sánh với 04 mẫu tỉnh Hịa Bình cơng cụ BLAST nhận thấy khơng có tương đồng mẫu Do đó, chúng tơi tiến hành so sánh đoạn trình tự BioEdit để thấy rõ sai khác nucleotide đoạn trình tự mẫu, kết hình 3.9 38 Hình 3.9 So sánh trình tự nucleotide đoa ̣n DNA mã va ̣ch trnHpsbA 04 mẫu Xá xị ta ̣i tỉnh Hòa Bin ̀ h với mẫu Xá xị ta ̣i tỉnh Quảng Ninh Sau có tất đoạn trình tự gen trnH-psbA so sánh với nhau, tiến hành tìm kiếm lồi có tỷ lệ tương đồng với trình tự đoạn gen nhân 07 mẫu Xá xị để thấy rõ di truyền mẫu với lồi có tương đồng cao ngân hàng NCBI Lấy đại diện mẫu QN02 (do có tương đồng 100%) tỉnh Quảng Ninh 04 mẫu tỉnh Hịa Bình để phân tích tìm kiếm lồi tương đồng công cụ BLAST, kết bảng 3.6 Bảng 3.6 Một số lồi ngân hàng gen có trình tự đoạn gen trnH-psbA tương đồng với đoạn gen trnH-psbA nhân 05 mẫu Xá xị STT Tên loài Mã số Cinnamomum KP09538.1 Tỷ lệ tương đồng HB01 HB02 99,61% 99,22% parthenoxylon KX546119.1 Cinnamomum MH050965.1 99,22% glanduliferum KX546110.1 39 HB03 HB04 QN02 98,80% 100% 99,60% 98,80% 100% 99,60% 98,82% Cinnamomum MF137970.1 camphora KX546103.1 99,22% 98,82% 98,80% 100% 99,60% Qua bảng thống kê 3.6 ta nhận thấy 04 mẫu Xá xị HB01, HB02, HB03, QN02 có tương đồng sai khác nhỏ với 03 loài Cinnamomum parthenoxylon, loài Cinnamomum glanduliferum loài Cinnamomum camphora Nhưng với mẫu Xá xị HB04 lại có tương đồng 100% Dựa vào bảng thống kê, sử dụng phần mềm Maga7 để xây dựng quan hệ di truyền 05 mẫu Xá xị tỉnh Hịa Bình tỉnh Quảng Ninh với 03 triǹ h tự tương đồ ng (tương ứng với 03 loài) ngân hàng gen, kết đươ ̣c thể hiêṇ ở hình 3.10 Hình 3.10 Cây quan hệ di truyền 05 mẫu Xá xị với 03 lồi có trình tự gen trnH-psbA tương đồng ngân hàng gen quốc tế Qua hình 3.10 ta nhận thấy quan hệ di truyền rẽ làm hai nhóm lớn với độ tin cậy cao (chỉ số boostrap 98-100%) Bên cạnh có phân chia 40 04 mẫu tỉnh Hịa Bình nhóm lớn Ta nhận thấy nhóm lớn thứ nhất, lại chia làm phân nhóm nhỏ khác, phân nhóm 01: mẫu Xá xị HB04 có quan hệ di truyền gần với loài Cinnamomum parthenoxylon với số hiệu KX546119.1, loài Cinnamomum camphora với số hiệu KX546103.1 loài Cinnamomum glanduliferum với số hiệu KX546110.1, phân nhóm 02 mẫu HB03 QN02 có quan hệ di truyền gần với đồng thời gần với phân nhóm 01 mẫu HB04 03 lồi tương đồng Bên cạnh đó, nhóm lớn thứ 02 chia thành 02 phân nhóm riêng rẽ khác, phân nhóm 01 mẫu HB01 có di truyền gần với lồi Cinnamomum parthenoxylon với số hiệu KP095538.1, loài Cinnamomum camphora với số hiệu MK050970.1 loài Cinnamomum glanduliferum với số hiệu MF137965.1 phân nhóm 02 chỉ gồ m có mẫu HB02 Nhưng điểm đáng ý mẫu Xá xị HB03 HB04 tỉnh Hịa Bình lại th ̣c hai phân nhóm khác nhóm Mẫu HB03 có quan hệ di truyền gầ n với mẫu QN02 tỉnh Quảng Ninh (bảng 3.6 hình 3.10), còn mẫu HB04 la ̣i có quan ̣ di truyề n gầ n với 03 loài tương đồng cao với mẫu HB01 HB02 nhóm 01 Kế t quả này cho thấ y trình tự đoa ̣n trnH-psbA ở các mẫu Xá xi ̣tương đố i đa da ̣ng, cùng mô ̣t xuấ t xứ và giữa các xuấ t xứ với Dự án “Xây dựng bô ̣ sở dữ liêụ DNA mã va ̣ch phu ̣c vu ̣ công tác quản lý giố ng lâm nghiê ̣p đã đươ ̣c công nhân là giố ng Quố c gia” PGS TS Hà Vă Huân chủ nhiê ̣m đã khẳ ng đinh ̣ đoa ̣n trình tự trnH-psbA là trình tự hiêụ quả nhấ t nghiên cứu đa da ̣ng di truyề n ở mức dưới loài Kế t quả này cũng tương tự nghiên cứu đố i với loài Xá xi đề tài này ̣ 3.4 So sánh hiêụ quả giám đinh ̣ loài và nghiên cứu đa hin ̀ h di truyề n của trin ̀ h tư ̣ DNA mã va ̣ch Từ kết so sánh mẫu Xá xi ̣ vùng với so sánh mẫu Xá xi ̣ vùng sử du ̣ng 03 đoạn trình tự gen matK, rbcL trnH-psbA cho thấy để định danh cho loài Xá xị thì hiêụ quả của các trin ̀ h tự DNA mã va ̣ch xắp xếp sau: matK > rbcL > trnH-psbA Do đó, để xác định định danh cho Xá xị ta nên sử dụng trình tự gen matK cho kết xác hai trình tự còn la ̣i là gen rbcL trnH-psbA cho hiêụ quả định danh loài Xá xị thấp 41 Để đánh giá đa hình di truyền của loài Xá xi ̣thì hiêụ quả của các trình tự DNA mã va ̣ch lại xắp xếp theo thứ tự sau: matK < rbcL < trnH-psbA Đúng theo trình tự xắp xếp, trình tự gen trnH-psbA sau nhân mẫu Xá xi ̣đã cho kết đa dạng di truyền tốt so với đoạn trình tự gen matK rbcL Qua kết phân tích tơi nhận thấy mối tương quan di truyền 07 mẫu Xá xị nghiên cứu tương đối cao, số tương đồng di truyền khoảng 99,25-100% Các mẫu Xá xị có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều chứng minh rõ ràng tiến hành nghiên cứu số thị hệ gen lục lạp 42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 4.1 Kết luâ ̣n - Tách chiế t thành công DNA tổ ng số từ 07 mẫu lá Xá xi ̣ sử du ̣ng bô ̣ kit tách chiế t DNA thực vâ ̣t của hañ g Qiagen Hàm lươ ̣ng DNA tổ ng số không cao đủ tiêu chuẩ n để thực hiêṇ phản ứng PCR - Nhân bản thành công 03 đoa ̣n trình tự DNA mã va ̣ch là matK, rbcL, trnH-psbA ở 07 mẫu Xá xi ̣có xuấ t xứ ta ̣i tỉnh Hòa Biǹ h và tỉnh Quảng Ninh - Giải triǹ h tự nucleotide của các đoa ̣n trình tự DNA mã va ̣ch ở 07 mẫu Xá xi phu ̣ ̣c vu ̣ đăng ký bản quyề n ngân hàng gen quố c tế - Giám đinh ̣ đươ ̣c loài Xá xi ̣có xuấ t xứ ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh sử du ̣ng các trin ̀ h tự DNA mã va ̣ch matK, rbcL, trnH-psbA Trong đó, đoa ̣n trin ̣ loài hiê ̣u quả nhấ t so với 02 đoa ̣n ̀ h tự matK có hiê ̣u quả giám đinh triǹ h tự DNA mã va ̣ch còn la ̣i - Đánh giá đươ ̣c đa da ̣ng di truyề n của các mẫu Xá xi ̣ ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh Cả 03 mẫu Xá xi ̣ta ̣i tỉnh Quảng Ninh không thể hiêṇ sự đa hình di truyề n đố i với cả chỉ thi ̣ DNA mã va ̣ch là matK, rbcL, trnH-psbA Mẫu Xá xi ̣ ta ̣i tỉnh Hòa Biǹ h có sự đa da ̣ng di truyề n đố i với cả chỉ thi ̣ DNA mã va ̣ch, đó chỉ thi ̣trnH-psbA cho thấ y là chỉ thi ̣có khả phân biêṭ sự đa hiǹ h di truyề n giữa các cá thể cùng mô ̣t xuấ t xứ tố t nhấ t 4.2 Kiến nghi ̣ Do thời gian thực hiêṇ đề tài bi ̣ ̣n chế nên chưa nghiên cứu đươ ̣c nhiề u mẫu Xá xi ̣ ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh Cầ n tiế p tu ̣c phân tích thêm các mẫu ta ̣i xuấ t xứ để khẳ ng đinh ̣ về sự đa da ̣ng di truyề n giữa các cá thể cùng mô ̣t xuấ t xứ và giữa các xuấ t xứ với Từ đó có sở khoa ho ̣c cho sự bảo tồ n và phát triể n nguồ n gen Xá xi ta ̣ ̣i miề n Bắ c, Viê ̣t Nam 43 TÀ I LIỆU THAM KHẢO TÀ I LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Khoa học Công nghệ (2007), sách Đỏ Việt Nam (phần thực vật), Nxb Khoa học tự nhiên & Công nghệ, Hà Nội Bùi Văn Thắng cộng (2017), Giám định số lồi Nưa Thanh Hóa dẫn liệu hình thái phân tử Hà Văn Huân (2015), Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử DNA mã vạch phân tích đa dạng di truyền giám định sinh vật Việt Nam Ngân hàng liệu DNA Việt Nam Hà Văn Huân cộng (2015), Xác định đoạn mã vạch DNA cho Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis): loài đặc hữu Việt Nam Lã Đinh Mỡi (2001), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam, tập I, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Lê Công Mạnh (2019), Nghiên cứu xác định DNA mã vạch cho loài Lan kim tuyến Nguyễn Cẩm Dương (2010), Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài nguyên số dược liệu Việt Nam thị DNA Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh mục loài thực vật Việt Nam, tâp II, nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Tiến Bân cà cộng (1996, 2007), Những lồi thực vật có nguy bị đe dọa tuyệt chủng thiên nhiên Việt Nam biện pháp bảo tồn, Trang Web Trung tâm liệu thực vật Việt Nam, cấp ngày 20/10/2013 10 Phạm Hoàng Hộ (1999-2003), Cây cỏ Việt Nam, Quyển 1-3, Nxb Trẻ, Tp Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 CBOL plant working group (2009) A ADN mã vạch for land plants, 106: 12794-12797 12 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and ADN mã vạchs: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 13 Costion C M, Kress W J, Crayn D M (2016), “DNA barcodes confirm the taxonomic and conservation status of a species of tree on the brink of extinction in the Pacific 14 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Gens, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 15 Liu, Z F , Ci, X.Q, Li, L , Li, H.W , Conran, J G anh Li, J (2016), “DNA barcoding evaluation and imlication for phylogenetic relationships in Lauraceae from China” 16 Storchova H., M S Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbA-trnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 17 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007), “Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 18 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources(9), pp.1086-1091 19 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 20 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 21 Xiaohui Pang, Jingyuan Song, Yingjie Zhu, Hongxi Xu, Linfang Huang, Shilin Chen (8 March 2011), “Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification 22 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 23 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 WEBSITE 24 http://iasvn.org/homepage/Ma-vach-DNA-(DNA-BARCODE)-va-huongnghien-cuu-ung-dung-o-Viet-Nam-5898.html 25 https://doctors24h.vn/cay-xa-xi-la-non-dung-lam-rau-xanh-tinh-dau-dunglam-nuoc-giai-khat-giup-tieu-com.html 26 https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_barcoding 27 https://trungtamduoclieu.vn/cay-xa-xi-id487.html ... ? ?Nghiên cứu đa dạng di truyền xuất xứ Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn) tỉnh Quảng Ninh tỉnh Hịa Bình sử dụng thị DNA mã vạch? ?? nhằm xây dựng sở liệu DNA mã vạch, phục vụ cho giám... Ứng dụng DNA mã va ̣ch 12 1.5 Một số nghiên cứu sử dụng DNA mã vạch thực vật 14 1.5.1 Một số nghiên cứu sử dụng DNA mã vạch giới 14 1.5.2 Một số nghiên cứu sử dụng DNA mã vạch Việt... xi.̣ - Xác định sự đa da ̣ng di truyền loài Xá xị ta ̣i tỉnh Hòa Bình và tỉnh Quảng Ninh dựa trình tự nucleotide của thị mã vạch DNA 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng nghiên cứu 2.3.1