nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn s7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen

I HC QUC GIA HÀ NI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUC Hà Ni   2013 I HC QUC GIA HÀ NI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Chuyên ngành: Di truyn hc Mã s: 60420121 LUC NG DN KHOA HC: PGS.TS. Phm Xuân Hi PGS.TS. Nguyn Th Hng Vân Hà Ni   2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gi li cc ti PGS.TS. Phạm Xuân Hội và PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân n tình ch bng d tôi trong sut quá trình hc tp và nghiên c hoàn thành lu này. Tôi xin bày t lòng bi  ti ThS. Nguyễn Duy Phƣơng, CN. Nguyễn Hoàng Quang cùng các cán b, anh ch em trong B môn Bnh hc Phân t Thc vt, Vin Di truyn Nông nghing d tôi rt nhiu trong thi gian thc tp ti B môn. i li ci toàn th các thy cô giáo trong b môn Di truyn hc, khoa Sinh hi hc Khoa hc T i hc Quc gia Hà No u kic hc tp và nghiên cu trong mng hc tp khoa hc, giúp cho tôi có nhng kin thc b ích trong suc. Cui li bi n bè,nhng  và tu ki tôi hoàn thành lut nghip. Tôi xin chân thành c Hà Ni, ngày 10 tháng 12  Hc viên thc hin L ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bo v thc vt bp Base pair (C) cDNA complementary (DNA b sung) ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate DNA Axit deoxy ribonucleic dNTP Deoxynucleotidetriphosphates dsRNA Double stranded RNA (ARN s) FDV Fiji disease virus (Virus bnh Fiji) EDTA Axit Ethylenediaminetetra acetic ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (xét nghim hp th min dch liên kt vi enzyme) EtBr Ethidium Bromide IRRI International Rice Research Institute (Vin nghiên cu lúa quc t) Kb Kilobase LB ng Luria Bertani  Lùn s MRCV Mal de Río Cuarto virus (Virus Mal de Rio Cuarto) MRDV Maize rough dwarf virus (Virus lùn ngô) NLRV Nilaparvata lugens virus (Virus nilaparvata lugens) NN&PTNT Nông nghip và phát trin nông thôn OD Optical Density (m quang hc) ORF Open reading frame (c m) OSDV Oat Sterile-Dwarf Virus (Virus lùn yn mch) PCR Polymerase chain reaction (Phn ng chui trùng hp) RBSDV Rice black streaked dwarf virus (Virus lùn s RGSV Rice grassy stunt virus (Virus lúa c) RNA Axit ribonucleic RRSV Rice ragged stunt virus (Virus lùn xon lá) iii RSV Rice stripe virus (Virus lúa sc) RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction       RTSV Rice tungro spherical virus (Virus Tungro hình cu) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virus Tungro dng thng) RDV Rice dwarf virus (Virus bnh lúa lùn) RGDV Rice gall dwarf virus (Virus vt u lùn lúa) SRBSDV Southern rice black-streaked dwarf virus (Virus lùn s TAE Tris base  Acetic - EDTA iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bng 1 Các cp oligo nucleotide s dng trong nghiên cu. 22 Bng 2 Các biu hin ca bnh lùn s 35 Bng 3 Kt qu sàng lc mu bnh b-ELISA và RT-PCR mc 40 Bng 4 Trình t các mc hic thit k phc v cho phn ng RT-PCR 42 Bng 5 So sánh mng nht trình t n S7 phân lp ca các mu Vit Nam và Trung Quc 54 v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1 Cây lúa b nhim bnh lùn s 8 Hình 2 Rng Sogatella furcifera truyn virus SRBSDV 9 Hình 3 Cu trúc phân t các Fijivirus 11 Hình 4 T chc b gen ca các Fijivirus 11  12 Hình 6 n RNA sa virus SRBSDV trên gel polyacrylamide 12,5%. 14 Hình 7 S xut hin ca protein P7-1 trong t bào vector truyn bnh (ry Sogatella furciferai kính hin t 16 Hình 8 Xét nghim virus SRBSDV b-ELISA 17 Hình 9 Vector nhân dòng pGEM-T và mt s v trí ct ca các enzyme ct gii hn trên vector pGEM-T 32 Hình 10 Triu chng mt s mu lúa thu thp ti các tnh Vit Nam 37 Hình 11 Mt s kt qu kim tra ELISA vi các mu thu thp  các tnh Vit Nam 38 Hình 12 Mt phn kt qu n di kim tra sn phm RT-PCR mt c ca các mu lúa 39 Hình 13 Hình n di genome ca SRBSDV phân lp t 12 mu lúa 40 Hình 14 Kt qu n S7 phân lc ca SRBSDV trên gel agarose 1% (chng Thái Bình-2) 42 Hình 15 Kt qu n di sn phm PCR vi cp mc hiu ca phân n S7 43 Hình 16 Kt qu n di sn phm DNA tinh sch bng b kit GenJET TM Gel Extraction trên gel agarose 1% 45 Hình 17  minh ha quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T 46 Hình 18 Kt qu bin np sn phm phn ng gn vào E.coli chng 46 vi DH5 Hình 19 Kt qu n di kim tra sn phm plasmid tinh sch trên gel agarose 1% 47 Hình 20 Kt qu n di sn phm PCR t plasmid tinh sch S dng cp mi S7-Fw/S7-Rv 48 Hình 21 Kt qu n di sn phm PCR t plasmid tinh sch s dng cp mi T7-Fw/SP6-Rv 49 Hình 22 Kt qu n di sn phm ct gii hn vector tái t hp pGEM-T/S7 bng enzyme EcoRI 50 Hình 23 Mt phn kt qu gii trình t  n S7 ca virus SRBSDV (mu Ngh An) 50 Hình 24 Trình t amino acid suy din cc m nm trên n S7 (mu Ngh An) 51 Hình 25 Mt phn kt qu so sánh trình t n S7 ca các mc ti Vit Nam và trên th gii 53 Hình 26 Mt phn kt qu so sánh trình t n S7 ca các mc ti Vit Nam và trên th gii 53 Hình 27 Hai cây ph h da trên toàn b trình t S7 (A) và trình t gen P7-1 (B) 55 vii MỤC LỤC M U 1 - TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. GII THIU CHUNG V CÁC VIRUS HI LÚA  VIT NAM 3 1.1.1. Các virus gây bnh trên lúa 3 1.1.2. Tình hình nghiên cu virus hi lúa  Vit Nam 3 1.2. BNH LÙN S 5 1.2.1. Gii thiu chung v bnh lùn s 5 1.2.1.1. Ngun gc phát sinh bnh lùn s 5 1.2.1.2. Din bin bnh lúa lùn si Vit Nam 6 m bnh hc ca bnh lùn s 7 1.2.2.1.Du hiu nhn bit 7 1.2.2.2. Vector truyn bnh 8 m sinh hc ca virus SRBSDV 10 1.2.3.1. Phân loi 10 m hình thái ca SRBSDV 12 m di truyn ca virus SRBSDV 12 1.2.3.4. n S7 và kh n hóa ca SRBSDV 14 1.2.3.5. Chu 16 1.2.4. Tình hình nghiên cu bnh lùn s Vit Nam 17 1.2.4.1. Các nghiên cnh virus SRBSDV 17 1.2.4.2. Các nghiên cu v quy trình ch 19 - VT LIU 21 2.1. VT LIU 21 2.1.1. ng nghiên cu 21 2.1.2. Hóa cht 21 2.1.3. Thit b 22 viii 2.2.  22 2.2.1. Thu mu 22 2.2.2. Xét nghim mu 22 c ELISA gc hiu - "Sandwich ELISA" 23 2.2.2.2. RT-PCR mc 25 n di DNA trên gel agarose 1% 26 2.2.3. Tinh sch dsRNA ca SRBSDV bng ct CF-11 26 2.2.4. Tng hp cDNA t dsRNA 28 2.2.4.1 Thit k cp mi 28 2.2.4.2. Tng hp cDNA si 1 28 2.2.4.3. Tng hp cDNA st PCR 29 2.2.4.4. Tinh sch sn phm PCR t gel agarose bng b kit Fermentas 30 2.2.5. Nhân dòng sn phm PCR bng b kit pGEM®-T Easy Cloning 31 2.2.5.1. Phn ng gn sn phm PCR vào vector pGEM-T 31 2.2.5.2. Bin np DNA vào t bo kh bin E.colich 32 2.2.6. Tinh sch plasmid t vi khun E.coli bng b kit GenJET TM Plasmid Miniprep 33 2.2.7. Ct enzyme gii hn 33 2.2.8. Gii trình t  34 ng di truyn S7 35  KT QU VÀ THO LUN 36 3.1. Thu thp và bo qun mu 36 3.2. Kt qu sàng lc mu bnh b-ELISA và RT-PCR mc 38 3.2.1. Kt qu xét nghim mu bnh s d- ELISA 38 3.2.2. Sàng lc mu bnh b-c 39 3.3. Phân lp h gen ca các mu SRBSDV 39 3.4. Phân ln S7 ca SRBSDV thu thp t mu lúa bnh 41 3.5. Nhân bn S7 b-PCR 43 3.5.1. Thit k n mc hiu cho phn ng RT-PCR phc v nhân bn S7 43 3.5.2. Nhân bn S7 b-PCR 43 [...]... truyền bệnh là rầy lƣng trắng (Sogatella furcifera), do đó có vai trò quan trọng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền và sự tiến hóa của virus Dựa vào thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây bệnh lúa lùn sọc đen với những mục tiêu chính nhƣ sau: - Phân lập và giải trình tự phân đoạn S7 của vius SRBSDV trên các mẫu lúa. .. loại bệnh virus gây thành dịch, bao gồm bệnh vàng lá di động, bệnh tungro, bệnh lúa cỏ, bệnh lúa lùn xoắn, bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam [15] Hiện nay, virus gây bệnh vàng lụi lúa (Rice yellow stunt virus – RYSV) đang gây hại tại Bắc giang và đang có nguy cơ thành dịch [14] Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó áp dụng các biện pháp canh tác nhƣ nhổ bỏ cây bệnh, di t... nƣớc trồng lúa châu Á Tuy nhiên có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến nhất là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời.[17,24,26,23,34] 1.1.2 Tình hình nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam Việt Nam hiện có 12/16 loại vius gây hại trên lúa, các bệnh do vius gây ra thành các đợt dịch thƣờng nối tiếp nhau ở các vùng trồng lúa khác... cũng xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) 1.2.4.2 Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình... 13] Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoăn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật [7] Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền Nông Nghiệp và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân. .. sinh bệnh lùn sọc đen phương Nam Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (Oryza sativa) tại một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc Cây lúa nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần nhỏ Ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của virus lùn sọc đen Mãi tới gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về... bệnh lùn sọc đen đã tạm thời lắng xuống, chỉ còn rải rác ở một vài tỉnh thành Tuy nhiên, bệnh vẫn chƣa đƣợc phòng trị hoàn toàn, có nhiều khả năng tái bùng phát thành dịch 1.2.2 Đặc điểm bệnh học của bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.2.1.Dấu hiệu nhận biết Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm virus SRBSDV rất giống với biểu hiện của bệnh lùn sọc đen do virus RBSDV gây ra Triệu chứng chung của lúa nhiễm bệnh. .. không ổn định và gây tình trạng mất an ninh lƣơng thực Trong số các tác nhân gây bệnh trên lúa, virus là mầm bệnh nguy hiểm nhất do khả năng phát tán rất rộng, đồng thời rất khó kiểm soát Ở Việt Nam, virus gây ra một số bệnh rất nguy hiểm, ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sản lƣợng lúa nhƣ bệnh vàng lùn, bệnh lùn xoắn lá, bệnh lùn sọc đen Trong các năm từ 2009 đến 2010, dịch bệnh lúa lùn sọc đen lần đầu tiên... S7 trong plasmid tái tổ hơ ̣p bằng cách xử lí với enzyme cắt giới hạn EcoRI 49 3.8 Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV .50 3.9 Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV 52 3.9.1 So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV trên thế giới .52 3.9.2 Phân tích đặc điểm di truyền 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN... cả các phân tử RNA đều đƣợc lắp ráp trong cùng một phân tử virus hình cầu Họ Reoviridae là một họ đa dạng về ký chủ Trong số 12 chi của họ, có tới 8 chi hại ngƣời và động vật, một chi hại nấm và 3 chi gây hại thực vật là (1) Phytoreovirus (ví dụ virus lúa lùn RDV (Rice dwarf virus) ), (2) Oryzavirus (ví dụ virus lúa lùn xoắn lá RRSV (Rice ragged stunt virus) , (3) Fijivirus (ví dụ virus lúa lùn sọc đen . KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Chuyên ngành: Di truyn hc Mã s: 60420121 LUC. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lại Phƣơng Liên NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN PHÂN ĐOẠN S7 CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN LUC Hà Ni. trong nghiên c dng di truyn và s tin hóa ca virus. Da vào thc t trên, chúng tôi tin hành thc hi  Nghiên cứu đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các chủng virus gây