Phân đoạn S7 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq DNA polymerase, ngoài hoạt tính tổng hợp ADN còn có hoạt tính terminal transferase do đó có thể gắn thêm một Adenosine 5‟ monophosphate vào đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành gắn sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 bằng enzyme Taq ADN polymerase vào vector pGEM-T mang Thymidine 5‟ monophosphate đầu 3‟. Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector pGEM-T gắn với phân đoạn S7.
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector đầu T pGEM-T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit pGEM®-T Easy Cloning (mục 2.2.5.1) với nguyên tắc
46
đƣợc mô tả nhƣ hình 17. Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn đầu T vào tế bào E. coli cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc nhiều khuẩn lạc (có khả năng mang vector tái tổ hợp) trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/ml, cơ chất X-gal và IPTG là chất cảm ứng (Hình 18).
Hinh 17: Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T
(A) (B)
Hình 18: Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng DH5α A. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli và cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ
sung ampicillin 100 µg/ml (mẫu Ninh Bình-1).
B. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi S7-Fw/S7-Rv.
Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: đối chứng dương ( khuôn là cDNA ); giếng 2-13: khuôn là các khuẩn lạc trắng của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng 14: đối chứng âm (không có DNA khuôn).
Để kiểm tra các khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp chứa phân đoạn S7 hay không, chúng tôi chọn ngẫu nhiên mỗi mẫu một khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy để tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu S7-Fw/S7-Rv. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% của các mẫu cho thấy có tất cả 9 phản ứng PCR sử dụng khuôn là khuẩn lạc trắng đã cho sản phẩm là một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình
47
18B, giếng 2-10), tƣơng tự nhƣ kích thƣớc băng DNA trên đƣờng chạy điện di sản phẩm của phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA làm khuôn (Hình 18B, giếng 1). Ngƣợc lại, với sản phẩm của phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn (Hình 18B, giếng 11), chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào. Kết quả này cho phép chúng tôi bƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc các khuẩn lạc dƣơng tính mang plasmid tái tổ hợp có chứa phân đoạn S7 (pGEM-T/S7).
3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tá i tổ hợp
Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của phân đoạn S7 trong vector pGEM-T, chúng tôichọn 1 khuẩn lạc dƣơng tính để tinh sạch plasmid và kiểm tra plasmid này bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn.
3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S 7 trong plasmid tá i tổ hợp b ằng phản ứng PCR. PCR.
Khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình của bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (mục 2.2.6). Plasmid tinh sạch sau khi đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc plasmid hoàn toàn tinh sạch, không bị lẫn RNA (Hình 19).
Hình 19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel agarose 1%
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-11: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch từ các khuẩn lạc tương ứng với các mẫu; giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Huế-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Lào Cai; giếng 5: Mẫu Thái Bình-1; giếng 6: Mẫu Thái Bình-2; giếng 7: Mẫu Hòa Bình; giếng 8:Mẫu Nghệ An; giếng 9: Mẫu Nam Đinh; giếng 10: Mẫu Quảng Trị-1; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu Huế-1
48
Sản phẩm plasmid tinh sạch đƣợc chúng tôi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7 (S7-Fw/S7-Rv) và cặp mồi đặc hiệu của vector (T7-Fw/SP6-Rv). Trong đó, cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv là hai trình tự nằm trên vector pGEM-T, có khoảng cách 126 bp (Hình 16). Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR từ khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng 2302 bp với cặp mồi vector và 2176 bp với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 20) cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7-Fw/S7-Rv cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 20, giếng 1-12). Đối với sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi vector T7-Fw/ SP6-Rv (Hình 21), chúng tôi thu đƣợc một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,3 kb (Hình 21, giếng 1-12), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính toán lý thuyết, bao gồm 2176 bp của phân đoạn S7 và 126 bp của plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào (Hình 20 và 21, giếng (-)). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định plasmid tinh sạch thu đƣợc là plasmid tái tổ hợp mang trình tự phân đoạn S7 đƣợc phân lập từ RNA genome của virus lùn sọc đen Phƣơng Nam.
Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng cặp mồi S7-Fw/S7-Rv
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng
49
Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng
Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng (+): đối chứng dương; giếng (-): đối chứng âm
3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tá i tổ hợp b ằng cách xử lí với enzyme cắt giới hạn EcoRI enzyme cắt giới hạn EcoRI
Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã đƣợc chèn vào vector pGEM-T là phân đoạn S7, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp đã đƣợc tinh sạch từ khuẩn lạc dƣơng tính (Mục 2.2.6).Theo lý thuyết, trên vector pGEM-T/S7 có hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI nằm trong vùng đa điểm cắt, phân đoạn S7đƣợc chèn vào giữa hai vị trí này, trong khi phân tích bản đồ enzyme giới hạn của phân đoạn S7 không có điểm nhận biết của enzyme này. Nhƣ vậy, khi đƣợc xử lí bằng EcoRI, vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 sẽ bị cắt thành 2 đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 3 kb và 2,1kb.
Sản phẩm phản ứng cắt giới hạn đƣợc chúng tôi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc cho thấy sản phẩm cắt vector tái tổ hợp mang phân đoạn S7 có 2 băng DNA, trong đó băng DNA 3 kb là bộ khung nguyên bản của vector, và đoạn DNA kích thƣớc 2,1 kb là kích thƣớc tƣơng ứng của phân đoạn S7 (Hình 22).
50
Hình 22: Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 bằng enzyme EcoRI
Giếng M: thang DNA chuẩn 1 kb; giếng 1: plasmid pGEM-T/S7 (đối chứng âm); giếng 2-13: sản phẩm cắt giới hạn pGEM-T/S7 bằng EcoRI của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình- 2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng
Trị-2, Huế-1, Huế-2.
Kết quả thu đƣợc ở trên cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành công phân đoạn S7 phân lập đƣợc từ RNA hệ gen SRBSDV.
3.8. Giải trình tự phân đoạn S7 của SRBSDV
Hình 23: Một phần kết quả giải trình tự phân đoạn S7 của virus SRBSDV (mẫu Nghệ An)
A. Kết quả đọc trình tự sử dụng mồi S7-Fw; B. Kết quả đọc trình tự sử dụng mồi S7-Rv.
Để khẳng định chính xác đoạn gen đƣợc nhân bản và nhân dòng vào vector pGEM-T có đúng là trình tự phân đoạn S7 của virus lùn sọc đen Phƣơng Nam hay không, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong vector tái tổ hợp pGEM-
51
T/S7 theo phƣơng pháp của Sanger và cộng sự và đọc bằng hệ thống máy giải trình tự ABI 3100 (Mục 2.2.8)
A
B
Hình 24: Trình tự amino acid suy diễn của 2 khung đọc mở nằm trên phân đoạn S7 (mẫu Nghệ An)
A: Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của ORF 1 trên phân đoạn S7. B: Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của ORF 2 trên phân đoạn S7.
Trong thành phần phản ứng, mỗi loại ddNMP đƣợc đánh dấu bằng một loại chất phát huỳnh quang khác nhau. Đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến
52
chúng hấp thụ và phát ra các màu. Nhƣ vậy, mỗi màu ứng với một nucleotide và đƣợc biểu thị bằng một đỉnh (Hình 23).
Kết quả giải trình tự phân đoạn S7 virus SRBSDV có chiều dài 2176 bp. Trình tự phân đoạn S7 đƣợc phân tích bằng phần mềm Genetyx 6.0 cho thấy phân đoạn S7 chứa 2 khung đọc mở (ORF) có độ dài 1071 và 927 bp, mã hóa cho 2 chuỗi amino acid nhƣ hình 24.
3.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV
3.9.1. So sánh trình tự phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV Việt Nam với các mẫu SRBSDV trên thế giới SRBSDV trên thế giới
Các mẫu plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch đƣợc gửi tới hãng Macrogene cho việc giải trình tự. Kết quả giải trình tự cho thấy cả 12 plasmid tái tổ hợp đều mang phân đoạn S7 của SRBSDV thu thập tại các vùng sinh thái khác nhau ở Việt Nam.
Sử dụng công cụ tìm kiếm trực tuyến BLAST trên NCBI cho thấy tất cả các mẫu S7 Việt Nam đều trùng khớp với các mẫu S7 tƣơng ứng sẵn có trên GenBank (Hình 25,26). Mƣời hai mẫu S7 Việt Nam và 8 mẫu S7 sẵn có của Trung Quốc đƣợc căn trình tự đa chuỗi bằng phần mềm MEGA5. Kết quả phân tích cho thấy, trình tự nucleotide phân đoạn S7 của các mẫu virus Việt Nam có mức đồng nhất r ất cao so với nhau và so với các mẫu củaTrung Quốc, đạt từ 99-100% (Bảng 5).
Trình tự nucleotide phân đoạn S7 giữa các chủng virus có độ tƣơng đồng cao phản ánh đúng thực tế virus SRBSDV mới xuất hiện ở Việt Nam trong thời gian chƣa lâu, từ năm 2009 nên chƣa có khả năng phân ly hình thành chủng mới. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây về phân đoạn S10 của SRBSDV [12]. Tuy nhiên, mức độ tƣơng đồng phân đoạn S7 cao hơn phân đoạn S10 chứng tỏ phân đoạn này có vai trò quan trọng trong tiến hóa của vius SRBSDV. Vì vậy, sự thay đổi trình tự nucleotide của phân đoạn S7 chỉ xảy ra mạnh khi có áp lực tiến hóa cao và một khoảng thời gian nhất định.
53
Hình 25 : Một phần kết quả so sánh trình tự nucleotide phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới
Hình 26 : Một phần kết quả so sánh trình tự amino acid phân đoạn S7 của các mẫu SRBSDV thu đƣợc tại Việt Nam và trên thế giới
54
Bảng 5: So sánh mức đồng nhất trình tự phân đoạn S7 phân lập của các mẫu Việt Nam và Trung Quốc
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 ID 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.95 0.97 0.94 0.94 0.94 0.94 0.94 0.95 0.95 0.95 0.95 0.94 0.94 0.94 2 0.95 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 1.00 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 3 0.95 1.00 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 4 0.95 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 5 0.95 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 6 0.94 0.99 1.00 1.00 1.00 ID 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 7 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 8 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 ID 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 0.98 0.98 0.97 0.97 0.97 0.97 0.97 9 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 ID 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 10 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 1.00 ID 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 11 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 ID 0.99 0.99 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 12 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 1.00 1.00 0.99 ID 0.99 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 0.99 0.99 13 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 14 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 15 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 ID 1.00 1.00 0.99 0.99 0.99 16 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 1.00 ID 1.00 0.99 0.99 0.99 17 0.95 1.00 0.99 0.99 0.99 0.99 1.00 0.97 1.00 1.00 0.99 1.00 0.99 1.00 1.00 1.00 ID 0.99 0.99 0.99 18 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.99 0.99 19 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID 0.99 20 0.94 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.97 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 ID
1 (Huế-2), 2 (SRBSDV-HM998850), 3 (Lào Cai), 4 (Ninh Bình-1), 5 (Sơn La-1), 6 (Nghệ An), 7 (SRBSDV-HM585273), 8 (Thái Bình-2), 9 (SRBSDV-JQ692578), 10 (Nam Định), 11 (Ninh Bình-2), 12 (SRBSDV-JN388912), 13 (Huế-1), 14 (SRBSDV-EU784841), 15 (SRBSDV-FN563995), 16 (SRBSDV-HQ731498), 17 (SRBSDV-JQ034354), 18 (Quảng Trị- 1), 19 (Quảng Trị-2), 20 (Thái Bình-1)
55
3.9.2. Phân tích đặc điểm di truyền
Vì hiện nay, virus SRBSDV mới chỉ phát hiện tại Việt Nam và Trung Quốc nên chúng tôi đã phân tích mối quan hệ của các mẫu virus Việt Nam với các mẫu virus Trung Quốc. Hai cây phả hê ̣ đã đƣợc xây dƣ̣ng dƣ̣a trên toàn b ộ trình tự phân đoạn S7 và gen mã hóa protein P7-1 của 12 mẫu virus Việt Nam trong nghiên cứu này và 8 mẫu virus Trung Quốc sẵn có trên GenBank (Hình 27). NinhBinh-2 SRBSDV-JN388912 NamDinh SRBSDV-JQ692578 ThaiBinh-2 SRBSDV-FN563995 SRBSDV-EU784841 Hue-1 SRBSDV-HQ731498 SRBSDV-JQ034354 SonLa-1 NinhBinh-1 LaoCai NgheAn SRBSDV-HM998850 Hue-2 SRBSDV-HM585273 ThaiBinh-1 QuangTri-1 QuangTri-2 100 95 99 50 64 50 2 NinhBinh-2 SRBSDV-JN388912 NamDinh SRBSDV-JQ692578 ThaiBinh-2 SRBSDV-HQ731498 SRBSDV-FN563995 SRBSDV-EU784841 Hue-1 SRBSDV-JQ034354 SonLa-1 NinhBinh-1 LaoCai NgheAn SRBSDV-HM998850 Hue-2 SRBSDV-HM585273 ThaiBinh-1 QuangTri-1 QuangTri-2 71 95 76 97 66 71 1 (A) (B)
Hình 27: Hai cây phả hệ dựa trêntoàn bộ trình tự S7 (A) và trình tự gen P7-1 (B) cho thấy mối quan hê ̣ của các mẫu virus phân lập từ Viê ̣t Nam và Trung Qu ốc. Cây được xây dựng bằng phương pháp MP (maximum parsimony) dùng phần mềm MEGA 5. Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp) và chỉ trình bày các giá trị > 50%. Mẫu Việt Nam được chỉ rõ bằng chấm đen. Thanh bar là số thay thế nucleotide.
56
Phân tích phả hê ̣ cho thấy khó đánh giá m ối quan hệ phả hệ của chúng do mức độ đồng nhất trình tự khá cao nhƣ trình bày ở trên. Tuy nhiên, có thể nhận thấy:
(i) Quan hệ của các mẫu virus dựa trên toàn bộ phân đoạn S7 tƣơng tự nhƣ dựa trên gen P7-1.
(ii) Trên cả 2 cây, có 7 mẫu Việt Nam hình thành 2 cụm rõ rệt với giá tri ̣ thống kê boostrap rất cao (95 - 100 %). Cụm 1 gồm 2 mẫu Quảng Trị (Quảng Trị -, Quảng Trị -2) và 1 mẫu thu tại Thái Bình (Thái Bình-2). Cụm 2 gồm 4 mẫu thu tại miền Tây Bắc kể cả Nghệ An (Sơn La-1, Lào Cai, Ninh Bình -1 và Nghệ An).
(iii) Các mẫu còn lại không hình thành các cụm phân biệt mà xuất hiện rải rác thành các