Phân đoạn S7 đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq polymerase, do đó sản phẩm tạo ra là các đoạn DNA có sẵn đầu A. Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector pGEMT có đầu T nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEMT đầu T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit, với các thành phần nhƣ sau:
Thành phần Thể tích (µl)
Đệm phản ứng 2X 10 µl
Sản phẩm PCR 3 µl
Vector đầu T pGEMT-T 1 µl
T4 DNA ligase (5 u/µl) 1 µl
H2O cất khử ion vô trùng 5 µl
Tổng thể tích 20 µl
Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc ủ trong bể ổn nhiệt 16°C qua đêm.
Plasmid pGEM-T có kích thƣớc khoảng 3kb có chứa trình tự mã hóa của gen kháng chất kháng sinh ampicillin (Hình 9), nhờ đó các tế bào mang vector có thể sinh trƣởng bình thƣờng ở môi trƣờng có chứa ampicillin với nồng độ ức chế tối thiểu.
32
Hình 9: Vector nhân dòng pGEM-T và một số vị trí cắt của các enzyme cắt giới hạn trên vector pGEM-T
Ngoài ra, vector này đƣợc thiết kế có gắn operon Lac chuyển hóa đƣờng lactose. Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này và gen cấu trúc lacZ mã hóa cho enzyme -galactosidase có vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (Hình 9).
Thiết kế này cho phép phân biệt đƣợc tế bào nào mang plasmid nguyên bản (không gắn thêm sản phẩm PCR) và tế bào nào mang plasmid tái tổ hợp có gắn thêm sản phẩm PCR. Đối với tế bào mang plasmid nguyên bản, gen lacZ hoạt động bình thƣờng để tổng hợp enzyme -galactosidase nên khi bổ sung cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG vào môi trƣờng, enzyme sẽ chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm màu xanh trong môi trƣờng có oxy. Đối với tế bào mang plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA lạ xen vào giữa Lac-promoter và gen lacZ làm cho enzyme -galactosidase không đƣợc tổng hợp nên khi có mặt X-gal và IPTG, quá trình chuyển hóa cơ chất không xảy ra và không tạo ra sản phẩm màu xanh.
2.2.5.2. Biến nạp DNA vào tế bảo khả biến E.coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E.coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, 10 µl hỗn hợp phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. Tiếp theo, 450µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C
33
trong vòng 20 phút trƣớc khi đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml và ủ ở 37°C qua đêm.
2.2.6. Tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep Miniprep
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lắc trong 5ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4o
C. Tế bào đƣợc hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNase . Sau đó, 250 µl đệm P2 (lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. Tiếp theo, 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung và ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút.
Lƣợng plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.7. Cắt enzyme giới hạn
Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính sẽ đƣợc nuôi cấy để tách chiết plasmid và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn.
34
Enzym cắt giới hạn sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử là những enzyme endonuclease có khả năng nhận biết vị trí đặc hiệu trên DNA và phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi tại đó mà không gây tổn hại đến bazơ nucleotide. Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn đƣợc cấu tạo từ 4 đến 6 đôi bazơ và có cấu trúc đối xứng nghịch đảo. Enzym cắt giới hạn có thể cắt ngay chính giữa trình tự nhận biết để tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng hoặc có thể cắt lệch tâm để tạo ra hai đoạn DNA có kiểu đầu dính.
Phản ứng cắt giới hạn với EcoRI để kiểm tra sự có mặt của phân đoạn S7 trong plasmid tái tổ hợp có thành phần nhƣ sau:
Thành phần Thể tích
pGEM-T/S7 3,0 µl
Đệm Fast Digest 10X 0,5 µl
Enzyme EcoRI (10u/µl) 0,5 µl
H2O khử ion vô trùng 1,0 µl
Tổng thể tích 5,0 µl
2.2.8. Giải trình tự nucleotide đoạn gen đã nhân dòng
Nguyên tắc:Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T sẽ đƣợc đọc trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Cụ thể, phản ứng PCR đƣợc tiến hành qua 2 bƣớc: bƣớc PCR thông thƣờng để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc và bƣớc PCR cho xác định trình tự. Trong đó, phản ứng PCR thông thƣờng sử dụng khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T mang đoạn gene đặc hiệu với cặp mồi T7- Fw/SP6-Rv của vector. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch, pha loãng ở nồng độ thích hợp và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự. Về cơ bản, phản ứng PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác biệt là sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc). Các ddNTP khác với các dNTP là thiếu một nhóm 3‟-OH nên khi đƣợc enzyme DNA polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide đƣợc đƣa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dài
35
chuỗi bị ngừng lại. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc.Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với các đoạn gene tƣơng ứng đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng gen để biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa chúng.
2.2.9. Phân tích đa dạng di truyền phân đoạn S7
Từ các trình tự thu đƣợc của các phân đoạn S7 của các mẫu bệnh thu đƣợc tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng với các trình tự tƣơng ứng của các chủng SRBSDV khác trên GeneBank. Từ đó, chúng tôi xây dựng cây phân loại và phân tích các đặc điểm di truyền học cũng nhƣ mối quan hệ của chủng virus thu đƣợc tại mẫu bệnh ở Việt Nam với các chủng gây bệnh lúa lùn sọc đen trên thế giới (hiện nay bệnh mới chỉ đƣợc phát hiện tại Trung Quốc và Việt Nam). Qua đó, mức độ tiến hóa của phân đoạn S7 của các chủng thu đƣợc và mức độ ảnh hƣởng của protein mã hóa bởi phân đoạn này đến khả năng lây lan của bệnh đƣợc đánh giá. Từ đó, chúng tôi có thể đƣa ra phƣơng án phòng bệnh hoặc dập dịch thích hợp.
36
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và bảo quản mẫu
Các mẫu lúa bệnh đƣợc thu trực tiếp tại đồng ruộng, với những cây lúa có triệu chứng điển hình: thân cây thấp, lá xanh đậm, xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân... (Bảng 2 và Hình 10). Trong đó, triệu chứng lớp u sáp trên thân hay sọc phồng ở gân thân cây lúa (bên trong bẹ) là triệu chứng đặc trƣng duy nhất của bệnh
lùn sọc đen. Các mẫu sau khi thu thập sẽ đƣợc rửa sạch, loại bỏ phần héo úa, cắt nhỏ và sử dụng ngay hoặc bảo quản khô trong các bình kín nhờ hạt hút ẩm silicagel.
Kết quả chúng tôi đã thu đƣợc 51 mẫu bệnh thuộc các tỉnh Ninh Bình, Sơn La, Hải Phòng, Thái Bình, Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Huế. Các mẫu đều đƣợc đánh số thứ tự theo từng tỉnh.
Bảng 2: Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa
STT Triệu chứng
1 Cây thấp lùn 2 Xoắn chót lá
3 Có nhiều vết nhăn ngang trên lá 4 Lá bị xoắn
5 Xoắn lá nõn
6 Sọc phồng ở gân phiến lá 7 Sọc phồng ở gân bẹ lá
8 Sọc phồng ở gân thân cây (bên trong bẹ) hay lớp u sáp trên thân
9 Bộ lá xanh đậm 10 Cây cứng 11 Trắng mép lá 12 Rách mép lá 13 Nhánh phụ 14 Đen hạt
37
ĐH (Đen hạt) GL (Gấp lá) L (lùn) NG (nhăn giữa lá) N (nghẹn lá) NP (Nhánh phụ)
NC (Nhăn chót lá) RN (rễ ngƣợc) RM (rách mép lá) SP (Sọc phiến) SB (Sọc bẹ) ST (Sọc thân)
PTH (Phồng tràng hạt) TM (trắng mép lá) VLX (Vàng lá xoắn) X (xoắn lá) XLN (Xoắn lá nõn) XC (Xoắn chót lá) Hình 10. Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam
38
3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bƣớc bƣớc
3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phương pháp Sandwich- ELISA
Sử dụng phƣơng pháp Sandwich-ELISA với quy trình và kit (IgG và conjugate) do Tiến sỹ Omura tại Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản cung cấp chúng tôi đã tiến hành kiểm tra mẫu bệnh với lần lƣợt từng loại virus RRSV, RGSV, RTBV, RTSV, RGDV, RRBV và RBSDV. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Kết quả bƣớc đầu cho thấy số lƣợng mẫu nhiễm RTSV là 11/51 mẫu, số lƣợng mẫu nhiễm RGSV là 6/51 mẫu, nhiễm RGDV là 4/ 51 mẫu, nhiễm RRSV là 4/51 mẫu, lƣợng mẫu nhiễm RTBV là 3/51 mẫu, nhiễm RRBV rất ít, chiếm 1/51 mẫu, 5/51 mẫu nhiễm RBSDV, ngoài ra còn có 5/51 mẫu nghi nhiễm RBSDV với phản ứng dƣơng tính không rõ ràng (Hình 11). Sau kiểm nghiệm chỉ có 12 mẫu không có bất kỳ phản ứng dƣơng tính nào với kiểm nghiệm ELISA, các mẫu này sau đó đƣợc chúng tôi kiểm nghiệm tiếp bằng phƣơng pháp RT-PCR một bƣớc cùng với các mẫu có phản ứng dƣơng tính không rõ ràng để khẳng định sự có mặt của SRBSDV với cặp mồi đặc hiệu cho virus này.
39
3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp RT-PCR 1 bước
Tất cả 17 mẫu sau khi đã đƣợc kiểm tra bằng kit ELISA không có phản ứng dƣơng tính hoặc dƣơng tính không rõ ràng với bất kỳ kit phát hiện virus nào đã đƣợc chúng tôi đi kiểm nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu virus lùn sọc đen phƣơng Nam là SRBSDVS10F3/R3 (725bp). Kết quả điện di kiểm tra cho thấy phản ứng RT-PCR 1 bƣớc với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 có 12 mẫu có phản ứng dƣơng tính với cặp mồi này (Hình 12A,B) . Sơ bộ chúng tôi cho rằng 12 mẫu bệnh này có thể đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu phân lập hệ gen virus lùn sọc đen phƣơng nam SRBSDV ở Việt Nam (Hình 12A&B).
Kết quả toàn bộ quy trình xét nghiệm đƣợc thể hiện trong bảng 3.
Hình 12. Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bƣớc của các mẫu lúa
A, B. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bước với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 Giếng M: Marker; giếng 1: Mẫu Hải Phòng-3; giếng 2: Mẫu Huế-1; giếng 3: Mẫu Huế-2; giếng 4: Mẫu Hòa Bình-2; giếng 5: Mẫu Nam Định-2; giếng 6: Mẫu Nam Định-1; giếng 8: Mẫu Nghệ An-1; giếng 9: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 10: Mẫu Ninh Bình-3; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu Thái Bình-4; giếng 13: Mẫu Thái Bình-1; giếng 14: Mẫu Thái Bình-2
3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV
12 mẫu lúa bệnh thu đƣợc từ các vùng dịch, sau khi sàng lọc để chọn ra các mẫu dƣơng tính với SRBSDV, đƣợc chúng tôi sử dụng để phân lập hệ gen của SRBSDV, sử dụng phƣơng pháp tách bằng cột CF11.
40
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA sợi đôi tinh sạch trên gel agrose 1% (chạy 100V trong 1 giờ) trong hình 13 cho thấy, hệ gen của các mẫu virus thu đƣợc gồm 7 băng, trong đó băng thứ 3 (tính theo kích thƣớc giảm dần) bao gồm ba phân đoạn S3, S4, S5 có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau ( lần lƣợt là 3618bp, 3571bp và 3167bp) và băng thứ 6 bao gồm hai phân đoạn S8 và S9 (1928bp và 1900bp) (Hình 13). So sánh với hình ảnh điện di hệ gen SRBSDV trên agarose của Zhou et al. (2008) [23] có thể thấy chúng tôi đã phân lập thành công hệ gen của SRBSDV. Đây chính là nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu RNA đƣợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các mục đích tiếp theo.
Hình 13: Hình ảnh điện di hệ gen của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu lúa
Giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Ninh Bình-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Thái Bình-1; giếng 5: Mẫu Thái Bình-2; giếng 6: Mẫu Nghệ An; giếng 7: Mẫu Nam Định; giếng 8: Mẫu Lào Cai; giếng 9:
41 STT Mẫu Địa điểm lấy mẫu Kết quả ELISA Kết quả RT-PCR với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 Kết luận 1 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 2 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 3 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 4 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 5 Hải Phòng Nhiễm RGDV 6 Hải Phòng Nhiễm RGDV
7 Hải Phòng Nhiễm RBSDV Ghi chú
8 Hải Phòng (*) (-) Nhiễm RBSDV
9 Hòa Bình Nhiễm RGSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTSV
10 Hòa Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
11 Hòa Bình Nhiễm RRSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGSV
12 Hòa Bình Nhiễm RRSV
13 Huế (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGDV
14 Huế (+) Nhiễm SRBSDV
15 Huế Nhiễm RBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRSV
16 Huế Nhiễm RTSV
17 Lào Cai (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RBSDV
18 Lào Cai Nhiễm RTBV
19 Lào Cai Nhiễm RTBV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTBV
20 Lào Cai Nhiễm RBSDV
21 Nam Định (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRBV
22 Nam Định (*) (-) Nhiễm RBSDV
23 Nam Định Nhiễm RGSV (*) Dƣơng tính không rõ ràng
với kháng nguyên RBSDV
24 Nam Định Nhiễm RRBV
25 Nghệ An (+) Nhiễm SRBSDV Âm tính
26 Nghệ An Nhiễm RTSV
27 Nghệ An Nhiễm RTSV (+) Dƣơng tính với cặp mồi
tƣơng ứng
28 Nghệ An Nhiễm RBSDV
29 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV (-) Âm tính với cặp mồi tƣơng
ứng 30 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV 31 Ninh Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV 32 Ninh Bình Nhiễm RRSV 33 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV 34 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV 35 Quảng Trị Nhiễm RGSV 36 Quảng Trị Nhiễm RGSV 37 Sơn La (+) Nhiễm SRBSDV 38 Sơn La Nhiễm RGDV 39 Sơn La Nhiễm RTBV 40 Sơn La Nhiễm RGSV 41 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV 42 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV 43 Thái Bình Nhiễm RGDV 44 Thái Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
45 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
Bảng 3: Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bước
46 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
47 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
48 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
49 Vĩnh Phúc Nhiễm RBSDV
50 Vĩnh Phúc Nhiễm RGSV