Nguyên tắc:Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi đƣợc nhân dòng vào vector pGEM-T sẽ đƣợc đọc trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Cụ thể, phản ứng PCR đƣợc tiến hành qua 2 bƣớc: bƣớc PCR thông thƣờng để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc và bƣớc PCR cho xác định trình tự. Trong đó, phản ứng PCR thông thƣờng sử dụng khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T mang đoạn gene đặc hiệu với cặp mồi T7- Fw/SP6-Rv của vector. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch, pha loãng ở nồng độ thích hợp và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự. Về cơ bản, phản ứng PCR này có các thành phần giống nhƣ PCR thông thƣờng nhƣng có một số khác biệt là sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngƣợc). Các ddNTP khác với các dNTP là thiếu một nhóm 3‟-OH nên khi đƣợc enzyme DNA polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide đƣợc đƣa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dài
35
chuỗi bị ngừng lại. Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các sợi này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc.Mẫu sau khi xử lý đƣợc giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự ABI 3100. Kết quả đọc trình tự đƣợc so sánh với các đoạn gene tƣơng ứng đã đƣợc đăng ký trong ngân hàng gen để biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa chúng.