12 mẫu lúa bệnh thu đƣợc từ các vùng dịch, sau khi sàng lọc để chọn ra các mẫu dƣơng tính với SRBSDV, đƣợc chúng tôi sử dụng để phân lập hệ gen của SRBSDV, sử dụng phƣơng pháp tách bằng cột CF11.
40
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA sợi đôi tinh sạch trên gel agrose 1% (chạy 100V trong 1 giờ) trong hình 13 cho thấy, hệ gen của các mẫu virus thu đƣợc gồm 7 băng, trong đó băng thứ 3 (tính theo kích thƣớc giảm dần) bao gồm ba phân đoạn S3, S4, S5 có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau ( lần lƣợt là 3618bp, 3571bp và 3167bp) và băng thứ 6 bao gồm hai phân đoạn S8 và S9 (1928bp và 1900bp) (Hình 13). So sánh với hình ảnh điện di hệ gen SRBSDV trên agarose của Zhou et al. (2008) [23] có thể thấy chúng tôi đã phân lập thành công hệ gen của SRBSDV. Đây chính là nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu RNA đƣợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các mục đích tiếp theo.
Hình 13: Hình ảnh điện di hệ gen của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu lúa
Giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Ninh Bình-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Thái Bình-1; giếng 5: Mẫu Thái Bình-2; giếng 6: Mẫu Nghệ An; giếng 7: Mẫu Nam Định; giếng 8: Mẫu Lào Cai; giếng 9:
41 STT Mẫu Địa điểm lấy mẫu Kết quả ELISA Kết quả RT-PCR với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 Kết luận 1 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 2 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 3 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 4 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 5 Hải Phòng Nhiễm RGDV 6 Hải Phòng Nhiễm RGDV
7 Hải Phòng Nhiễm RBSDV Ghi chú
8 Hải Phòng (*) (-) Nhiễm RBSDV
9 Hòa Bình Nhiễm RGSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTSV
10 Hòa Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
11 Hòa Bình Nhiễm RRSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGSV
12 Hòa Bình Nhiễm RRSV
13 Huế (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGDV
14 Huế (+) Nhiễm SRBSDV
15 Huế Nhiễm RBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRSV
16 Huế Nhiễm RTSV
17 Lào Cai (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RBSDV
18 Lào Cai Nhiễm RTBV
19 Lào Cai Nhiễm RTBV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTBV
20 Lào Cai Nhiễm RBSDV
21 Nam Định (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRBV
22 Nam Định (*) (-) Nhiễm RBSDV
23 Nam Định Nhiễm RGSV (*) Dƣơng tính không rõ ràng
với kháng nguyên RBSDV
24 Nam Định Nhiễm RRBV
25 Nghệ An (+) Nhiễm SRBSDV Âm tính
26 Nghệ An Nhiễm RTSV
27 Nghệ An Nhiễm RTSV (+) Dƣơng tính với cặp mồi
tƣơng ứng
28 Nghệ An Nhiễm RBSDV
29 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV (-) Âm tính với cặp mồi tƣơng
ứng 30 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV 31 Ninh Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV 32 Ninh Bình Nhiễm RRSV 33 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV 34 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV 35 Quảng Trị Nhiễm RGSV 36 Quảng Trị Nhiễm RGSV 37 Sơn La (+) Nhiễm SRBSDV 38 Sơn La Nhiễm RGDV 39 Sơn La Nhiễm RTBV 40 Sơn La Nhiễm RGSV 41 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV 42 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV 43 Thái Bình Nhiễm RGDV 44 Thái Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
45 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
Bảng 3: Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bước
46 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
47 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
48 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
49 Vĩnh Phúc Nhiễm RBSDV
50 Vĩnh Phúc Nhiễm RGSV
42
3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV từ các mẫu lúa bệnh
Sau khi thu đƣợc RNA hệ gen SRBSDV tinh sạch, chúng tôi điện di các mẫu RNA sợi đôi trên gel agarose 1% để các băng RNA phân tách hoàn toàn. Chúng tôi cắt chính xác băng RNA có kích thƣớc 2176 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết của phân đoạn S7. Các phân mảnh này sau đó đƣợc chúng tôi tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình của nhà sản xuất để loại hoàn toàn agarose. Sản phẩm RNA tinh sạch đƣợc chúng tôi tiếp tục điện di kiểm tra trên gel agarose 1% .
Kết quả thu đƣợc cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc băng RNA có kích thƣớc khoảng 2176 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết của phân đoạn S7 (Hình 14). Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã phân lập thành công phân đoạn S7 của SRBSDV từ các mẫu lúa dƣơng tính với bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam thu thập từ các vùng dịch.
Hình 14: Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập được của SRBSDV trên gel agarose 1%
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; ; Giếng 1: Đối chứng âm; Giếng 2-13: Phân đoạn S7 của SRBSDV của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam
43
3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR
3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7 đoạn S7
Dựa trên các trình tự của phân đoạn S7 của SRBSDV đã công bố trên Genebank, chúng tôi đã phân tích mức độ tƣơng đồng, so sánh và chọn lựa vùng bảo thủ trong hệ gen của virus này, từ đó thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7 (bao gồm cả khung đọc mở và vùng không dịch mã). Các cặp oligo nucleotide có kích thƣớc 25 nucleotit, nằm trên vùng bảo thủ của phân đoạn S7, có hàm lƣợng GC cao đƣợc chúng tôi đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma. Trình tự của các cặp oligo nucleotide đƣợc trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng RT-PCR Tên mồi Trình tự
S7-Fw 5‟-AAGTTTTTTTCGACCTGTCTGGACC-3‟
S7-Rv 5‟-GTCAAGGTCGAAATGCAGCTGATGTC-3‟
3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phương pháp RT-PCR
Sử dụng các cặp oligo nucleotide đã thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7, chúng tôi đã tiến hành sinh tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen của 12 mẫu virus LSĐPN thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng bộ kit Revert Aid First strand cDNA Synthesis của hãng Fermentas. Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc chúng tôi thực hiện theo quy trình hƣớng dẫn kèm theo của bộ kit nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.4.2.
Do sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA có nồng độ rất thấp, nên không thể kiểm tra kết quả bằng phƣơng pháp điện di sản phẩm trên gel agarose đƣợc. Chính vì vậy chúng tôi đã sử dụng trực tiếp sản phẩm này làm khuôn cho phản ứng nhân bản phân đoạn S7 bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế (Bảng 3). Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các thành phần và chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.4.3.
44
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy với phản ứng PCR sử dụng 1µl sản phẩm phản ứng tổng hợp cDNA làm khuôn, chúng tôi đã thu đƣợc một băng DNA đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 15). Kích thƣớc này hoàn toàn tƣơng tự với kích thƣớc tính toán lí thuyết đã công bố trên Ngân hàng Gen Thế giới của phân đoạn S7. Ngƣợc lại, đối với phản ứng đối chứng âm sử dụng H2O làm khuôn thay cho DNA, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA có kích thƣớc 2,1 kb này.
Hình 15: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn S7 của 12 chủng vius với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7
Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: Đối chứng dương; giếng 2-13: Sản phẩm PCR phân đoạn S7 của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng 14: đối chứng âm (không có khuôn DNA)
Kết quả thu đƣợc chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công phân đoạn S7 của 12 mẫu virus SRBSDV tách chiết từ các mẫu lúa nhiễm bệnh thu đƣợc tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế dựa trên trình tự đã công bố của phân đoạn S7. Sản phẩm nhân bản này sẽ đƣợc chúng tôi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV.
Sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 sau khi điện di trên gel agarose 1% đƣợc chúng tôi nhuộm bằng Ethidium bromide và kiểm tra sự có mặt của băng DNA kích thƣớc 2,1 kb dƣới tia UV. Băng DNA này đƣợc chúng tôi cắt chính xác khỏi bản gel agarose và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình
45
của nhà sản xuất (mục 2.2.4.4) nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch tiếp tục đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thu đƣợc cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm DNA hoàn toàn tinh sạch, có kích thƣớc đúng với kích thƣớc tính toán lí thuyết của phân đoạn S7 (Hình 16).
Sản phẩm PCR tinh sạch nhân bản phân đoạn S7 đƣợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho thí nghiệm nhân dòng tiếp theo.
Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction trên gel agarose 1%
Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: Sản phẩm DNA tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; Giếng 13: Đối chứng âm
3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T
3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α.
Phân đoạn S7 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq DNA polymerase, ngoài hoạt tính tổng hợp ADN còn có hoạt tính terminal transferase do đó có thể gắn thêm một Adenosine 5‟ monophosphate vào đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành gắn sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 bằng enzyme Taq ADN polymerase vào vector pGEM-T mang Thymidine 5‟ monophosphate đầu 3‟. Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector pGEM-T gắn với phân đoạn S7.
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector đầu T pGEM-T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit pGEM®-T Easy Cloning (mục 2.2.5.1) với nguyên tắc
46
đƣợc mô tả nhƣ hình 17. Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn đầu T vào tế bào E. coli cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc nhiều khuẩn lạc (có khả năng mang vector tái tổ hợp) trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/ml, cơ chất X-gal và IPTG là chất cảm ứng (Hình 18).
Hinh 17: Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T
(A) (B)
Hình 18: Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng DH5α A. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli và cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ
sung ampicillin 100 µg/ml (mẫu Ninh Bình-1).
B. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi S7-Fw/S7-Rv.
Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: đối chứng dương ( khuôn là cDNA ); giếng 2-13: khuôn là các khuẩn lạc trắng của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng 14: đối chứng âm (không có DNA khuôn).
Để kiểm tra các khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp chứa phân đoạn S7 hay không, chúng tôi chọn ngẫu nhiên mỗi mẫu một khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy để tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu S7-Fw/S7-Rv. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% của các mẫu cho thấy có tất cả 9 phản ứng PCR sử dụng khuôn là khuẩn lạc trắng đã cho sản phẩm là một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình
47
18B, giếng 2-10), tƣơng tự nhƣ kích thƣớc băng DNA trên đƣờng chạy điện di sản phẩm của phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA làm khuôn (Hình 18B, giếng 1). Ngƣợc lại, với sản phẩm của phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn (Hình 18B, giếng 11), chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào. Kết quả này cho phép chúng tôi bƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc các khuẩn lạc dƣơng tính mang plasmid tái tổ hợp có chứa phân đoạn S7 (pGEM-T/S7).
3.7.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tá i tổ hợp
Để tiếp tục khẳng định sự có mặt của phân đoạn S7 trong vector pGEM-T, chúng tôichọn 1 khuẩn lạc dƣơng tính để tinh sạch plasmid và kiểm tra plasmid này bằng PCR và phản ứng cắt enzyme giới hạn.
3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S 7 trong plasmid tá i tổ hợp b ằng phản ứng PCR. PCR.
Khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình của bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (mục 2.2.6). Plasmid tinh sạch sau khi đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc plasmid hoàn toàn tinh sạch, không bị lẫn RNA (Hình 19).
Hình 19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel agarose 1%
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-11: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch từ các khuẩn lạc tương ứng với các mẫu; giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Huế-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Lào Cai; giếng 5: Mẫu Thái Bình-1; giếng 6: Mẫu Thái Bình-2; giếng 7: Mẫu Hòa Bình; giếng 8:Mẫu Nghệ An; giếng 9: Mẫu Nam Đinh; giếng 10: Mẫu Quảng Trị-1; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu Huế-1
48
Sản phẩm plasmid tinh sạch đƣợc chúng tôi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7 (S7-Fw/S7-Rv) và cặp mồi đặc hiệu của vector (T7-Fw/SP6-Rv). Trong đó, cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv là hai trình tự nằm trên vector pGEM-T, có khoảng cách 126 bp (Hình 16). Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR từ khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng 2302 bp với cặp mồi vector và 2176 bp với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 20) cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7-Fw/S7-Rv cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 20, giếng 1-12). Đối với sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi vector T7-Fw/ SP6-Rv (Hình 21), chúng tôi thu đƣợc một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,3 kb (Hình 21, giếng 1-12), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính toán lý thuyết, bao gồm 2176 bp của phân đoạn S7 và 126 bp của plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào (Hình 20 và 21, giếng (-)). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định plasmid tinh sạch thu đƣợc là plasmid tái tổ hợp mang trình tự phân đoạn S7 đƣợc phân lập từ RNA genome của virus lùn sọc đen Phƣơng Nam.
Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng cặp mồi S7-Fw/S7-Rv
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng
49
Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng
Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng (+): đối chứng dương; giếng (-): đối chứng âm
3.7.2.2. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S7 trong plasmid tá i tổ hợp b ằng cách xử lí với enzyme cắt giới hạn EcoRI enzyme cắt giới hạn EcoRI
Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã đƣợc chèn vào vector pGEM-T là phân đoạn S7, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cắt giới hạn plasmid tái tổ hợp đã đƣợc tinh