Miniprep
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (Fermentas). Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lắc trong 5ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4o
C. Tế bào đƣợc hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNase . Sau đó, 250 µl đệm P2 (lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (neutralization solution), đảo đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. Tiếp theo, 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung và ly tâm 30- 60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút.
Lƣợng plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.