Ngày 27/9/2009, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (ĐH Nông Nghiệp Hà Nội) đã nhâ ̣n đƣợc yêu cầu của Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu 2 (thuô ̣c Cu ̣c BVTV) yêu cầu thƣ̉ các mẫu lúa thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An (60 mẫu). Các thử nghiệm ELISA với kháng
18
huyết thanh do Trung tâm sản xuất cũng nhƣ RT -PCR với mồi đă ̣c hiê ̣u do Trung tâm thiết kế đã cho thấy các mẫu lúa bệnh thu tại Nghệ An không bị nhiễm 2 virus gây bê ̣nh VL/LXL nhƣ ở miền Nam.
Tuy nhiên khi chuẩn bi ̣ mẫu bê ̣nh cho kiểm tra ELISA , nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy 2 đă ̣c điểm không bình thƣờng (ngoài các đặc điểm giống nhƣ cây bi ̣ bê ̣nh lùn xoắn lá lá bi ̣ nhiễm bởi virus Rice ragged stunt virus (RRSV) ở miền Nam nhƣ cây lùn, lá xanh đậm, ngọn lá xoắn vặn):
(1) Cây bệnh không biểu hiê ̣n triê ̣u chƣ́ng táp và biến vàng ta ̣i mô ̣t bên của mép lá ở các lá bi ̣ xoắn vă ̣n . Đây là mô ̣t triê ̣u chƣ́ng luôn đƣợc quan sát thấy trên cây bi ̣ bê ̣nh lùn xoắn lá bị nhiễm bởi virus RRSV.
(2) Có nhiều nốt phồng nhỏ màu trắng tới nâu chạy dọc gân của thân cây lúa sau khi bóc lớp bẹ bên ngoài. Các nốt phồng này đặc biệt nhiều ở phần lóng sát gốc .
Các mẫu đƣợc thu thập tiếp theo tại Nam Định , Thanh Hóa, Sơn La cũng đều có triê ̣u chƣ́ng tƣơng tƣ̣ mẫu Nghê ̣ An.
Dƣ̣a trên 2 triê ̣u chƣ́ng trên , đă ̣c biê ̣t là triê ̣u chƣ́ng thƣ́ 2, tác nhân gây bệnh đã đƣơ ̣c dƣ̣ đoán là do mô ̣t reovirus (họ Reoviridae) gây ra . Các triệu chứng này khá giống với 2 reovirus là Rice black streaked dwarf virus (RBSDV) và Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) = Rice black streaked dwarf virus 2 (RBSDV2). Để kiểm tra liê ̣u mẫu lúa bê ̣nh miền Bắc có bi ̣ nhiễm RBSDV và SRBSDV hay không , mô ̣t că ̣p mồi cho phép phát hi ện đồng thời cả 2 virus này đã đƣợc thiết kế dƣ̣a trên vùng bảo thủ gene S10 của tất cả các chủng sẵn có của 2 virus trên Ngân hàng gen.
Kết quả kiểm tra RT -PCR cho thấy các mẫu bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An và mô ̣t số đi ̣a phƣơng miền Bắc nhƣ Thanh Hóa , Nam Đi ̣nh, Sơn La đều cho phản ƣ́ng RT -PCR dƣơng đối với mồi đă ̣c hiê ̣u RBSDV và SRBSDV nhƣng không phản ƣ́ng với mồi đă ̣c hiê ̣u virus lùn xoắn lá (RRSV).
Bốn sản phẩm RT -PCR đa ̣i diê ̣n cho Nghê ̣ An , Nam Đi ̣nh, Thanh Hóa và Sơn La đã đƣợc giải trình tƣ̣ trƣ̣c tiếp . Kết quả phân tích trình tƣ̣ và ph ả hệ cho thấy cả 4 mẫu này đều là virus lùn s ọc đen phƣơng Nam (SRBSDV). Ngoài ra, nghiên cứu hiển
19
vi điện tử cũng phát hiện thấy phân tử virus và thể vùi của virus trong mô cây lúa bị bệnh.Dƣ̣a trên kết quả nghiên cứu này, Trung tâm đã bƣớc đầu kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i tại miền Bắc là do virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) gây ra [18,25,19,17].
Trong cùng thời gian, các nghiên cứu tƣơng tự cũng đƣợc tích cực thực hiện tại Viện Bảo Vệ thực vật (BVTV). Nhóm nghiên cứu Viện Bảo Vệ thực vật cũng hợp tác chặt chẽ với chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trên RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và hiển vi điện tử .
Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái, kích thƣớc tiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử và kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng định nguyên tắc Koch, cũng nhƣ giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của hệ gene virus, nhóm nghiên cứu Viện BVTV cũng xác định tác nhân gây bệnh là virus
lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV)[10].
Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ Thực vật cũng xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc.
Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV).
1.2.4.2. Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV
Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình chẩn đoán SRBSDV bằng phƣơng pháp PCR/RT-PCR. Quy trình bao gồm các bƣớc: Giải trình tự sản phẩm PCR vùng gen bảo thủ có chiều dài 600 bp và phân tích trình tự gen sử dụng chức năng BLAST trong ngân hàng gen để xác định độ tƣơng đồng với tất cả các trình tự nucleic acid hiện có trong ngân hàng gen. Sau đó, gia phả trình tự gene thu đƣợc đƣợc phân tích bằng phần mềm MEGA-4.1 với trình tự gen tƣơng ứng của các virus có độ tƣơng đồng cao nhất cũng nhƣ các virus có cùng nhóm hoặc cùng phân nhóm và các virus thuộc nhóm hay phân nhóm khác cùng họ[6].
20
Từ năm 2012 đến nay, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp và Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã phân lập và giải trình tự toàn bộ phân đoạn S7, S9 và S10 của 13 chủng SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa từ miền Trung trở ra. Trên cơ sở phân tích trình tự hệ gene phân đoạn S10 của các chủng vius đã thiến kế cặp mồi đặc hiệu cho chủng SRBSDV ở Việt nam và phát triển quy trình chẩn đoán dựa trên kỹ thuật RT-PCR. Nghiên cứu đã tối ƣu hóa đƣợc phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số, thiết kế đƣợc cặp mồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán SRBSDV, tối ƣu đƣợc loại mẫu và vị trí xét nghiệm, tối ƣu loại phản ứng RT-PCR dùng trong xét nghiệm SRBSDV và thời gian RT-PCR tƣơng ứng [5,12]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu cơ sở khoa học của việc chẩn đoán SRBSDV bằng kỹ thuật kháng nghuyên kháng thể và đã (1) tạo mẫu nhiễm bệnh, tinh sạch phân tử virus từ mẫu nhiễm bệnh và tạo thành công kháng thể đa dòng SRBSDV và (2) tinh sạch và biểu hiện thành công protein vỏ P10, 2 polypeptide P1 và P2 trên protein P10 phục vụ cho việc tạo kháng thể đặc hiệu [5].
21
CHƢƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Mẫu lúa
Tổng số 51 mẫu lúa bệnh có những đặc điểm nhiễm bệnh điển hình của bệnh lúa lùn sọc đen nhƣ cây lúa lùn, lá vặn xoắn, gốc thân có nốt, vết sần mầu trắng đến đen... đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau của Việt Nam nhƣ: (1) đồng bằng Bắc bộ, (2) Hà Nội và các tỉnh vùng ven, (3) Trung du và miền núi phía Bắc, (4) các tỉnh Bắc Trung bộ và (5) các tỉnh Duyên hải Miền Trung đƣợc thu thậpphục vun cho nghiên cứu.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu gồm có:
- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản trình tự S7 của SRBSDV do Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) thiết kế dựa trên trình tự S7 đã đƣợc công bố trên Ngân hàng gen Thế giới (mã số EU 784841).
- Các cặp oligo nucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng RT-PCR một bƣớc nhằm xét nghiệm sự có mặt của SRBSDV đƣợc thiết kế theo nghiên cứu của Zhou và cs (2008) là SRBSDVS10F3/R3 (525bp) [39].
- Các bộ kít dùng trong nghiên cứu gồm: pGEM®-T Easy Vector (Promega); GenJETTM Gel Extraction (Thermo Scientific); RevertAidTM First Strand cDNA Synthessis (Thermo Scientific); kít ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RTBV, RTSV, RGDV và RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao; kit Read-to-go của GE healthcare cho phản ứng RT-PCR 1 bƣớc; pJet1.2 cloning kit và first strand cDNA kit của Fermentas...
- Các enzyme dùng trong nghiên cứu gồm: Dream Taq DNA polymerase, T4 DNA ligase (Thermo Scientific)…
22
Bảng 1:Trình tự các cặp oligo nucleotide sử dụng trong nghiên cứu.
Tên mồi Trình tự mồi
T7-Fw 5‟-AATACGACTCACTATAG-3‟
SP6-Rv 5‟-TATTTAGGTGACACTATAG-3‟
SRBSDVS10F3 5-TATTCAAAGTTATTTCCGT-3‟
SRBSDVS10R3 5-ACATGAATAGTTTCAAGT-3′
- Các hóa chất và d ụng cụ tiêu hao khác dùng trong nghiên cứu: bột cellulose CF11, SDS , Phenol, ống PCR 0,2 ml, đầu tip 2, 20, 200 và 1000 µl, chày cối sứ ... đạt tiêu chuẩn cho Sinh học Phân tử.
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu gồm: Máy PCR 9700 của hãng Applied Biosystem, hệ thống điện di DNA của hãng Biorad, máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus, máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec, máy giải trình tự ABI 3100, .
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.1. Thu mẫu
Những mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh đặc trƣng (nhƣ cây lùn, lá xanh đậm, xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân) đƣợc thu thập trên đồng ruộng tại các tỉnh thành miền Bắc và miền Trung.
2.2.2. Xét nghiệm mẫu
2.2.2.1. Phương pháp Sandwich ELISA Nguyên tắc:
Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa
23
trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.
Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. ELISA đƣợc dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh...
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc:
- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể
- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm.
Tiến hành:
- Mẫu khi lấy về trữ ở -20oC, chọn những lá vừa không non cũng không già, phiến lá lớn, cân 0,5g cho vào cối, thêm 2,5ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn chỉ thấy dạng dung dịch. Sau đó đổ vào eppendoff gần đầy và ghi ký hiệu thật cẩn thận.
- Mẫu sau đó đƣợc đem ly tâm tốc độ 5000vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 4o
C, dùng Micropipette P1000 hút phần dịch nỗi sang một eppendoff 1.5ml mới và cũng ghi nhãn cẩn thận (loại bỏ cặn lắng) và giữ ở 4oC.
Sử dụng bộ kit ELISA (IgG & conjugate) để phát hiện virus RRSV, RGSV, RBTV, RBSDV do TS. Omura, Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản chuyển giao, quy trình ELISA đƣợc tiến hành nhƣ sau:
24
- Đĩa và sơ đồ bố trí đƣợc chuẩn bị. Mỗi đĩa đƣợc bố trí 2 đối chứng âm và 2 đối chứng dƣơng. Pha loãng kháng thể 1/250 trong dung dịch đệm (coating buffer). Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100µl, chạy trên 5 đĩa, nhƣ vậy tổng cộng là 30ml, do đó phải pha dung dịch đệm là khoảng 35ml: pha loãng 140µl kháng thể vào trong 35ml dung dịch đệm kháng thể, trộn thật kỹ trƣớc khi dùng. Hút 100µl dung dịch vừa pha vào mỗi giếng, dùng băng keo dán kín lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC trong 2 giờ.
- Hỗn hợp đƣợc rửa với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa, rửa 3 lần mỗi lần 3 phút. Sau đó, mỗi đối chứng âm và dƣơng đƣợc hoà tan với 1ml nƣớc cất, hút 100µl mỗi loại đối chứng vào các giếng đối chứng, tiếp theo hút 100µl mẫu vào các giếng đã đƣợc bố trí. Đem ủ ở 4oC qua đêm.
- Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần mỗi lần 3 phút. Sau đó, pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm (tƣơng tự nhƣ pha kháng thể ở bƣớc 2). Hút 100µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 37o
C trong 2 giờ.
- Hỗn hợp đƣợc rửa lại với PBS – T 3 lần, mỗi lần 3 phút. Sau đó, hoà tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1mg/ml của pNPP, chờ 5 phút để pNPP tan hoàn toàn trong dung dịch đệm. Hút 100µl hỗn hợp cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 30 phút.
- Kết quả đƣợc đọc bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ
+ Những giếng xuất hiện màu vàng: giếng chứa mẫu dƣơng tính với kháng nguyên.
+ Những giếng không màu: giếng chứa mẫu âm tính với kháng nguyên. Các mẫu cho kết quả âm tính với kháng nguyên của RRSV, RGSV, RBTV, RBSDV sẽ đƣợc phân loại riêng để tiếp tục phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.
25
2.2.2.2. RT-PCR một bước Nguyên tắc
cDNA đƣợc tổng hợp từ RNA dƣới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn mRNA. Sợi kép RNA/DNA sẽ tách nhau ra dƣới tác động của nhiệt độ cao, giải phóng sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, enzyme Taq polymerase tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh.
Tiến hành:
Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành tổng hợp cDNA sợi đôi từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:
Thành phần phản ứng:
Mồi xuôi 10 pmol : 1 µl
Mồi ngƣợc 10 pmol : 1 µl
RNA sợi đôi : 0.3 µl
Đệm 10X : 1.5 µl
dNTP 10 mM : 1.5 µl
Reverse transcriptase (200u/µl) : 0.5 µl
Taq DNA polymerase (5u/ µl) : 0.2 µl RiboLockTM RNase Inhibitor (20u/µl) : 0.3 µl
ddH2O : 8.7 µl
Tổng thể tích : 15µl
26
Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC cho đến phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 1% Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Điện di là một quá trình chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dƣới tác dụng của điện trƣờng. DNA là phân tử tích điện âm nên trong môi trƣờng trung tính hoặc kiềm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển theo chiều từ cực âm sang cực dƣơng. Các phân tử DNA sẽ chuyển động với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thƣớc của chúng. Do vậy phƣơng pháp điện di đƣợc sử dụng để phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc, hình dạng khác nhau.
Tiến hành:
Sau khi gel agarose 1% đƣợc chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l loading dye 6X có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 g/ml và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau đó, gel đƣợc lấy ra và soi dƣới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel (Firereader-UVITEC), các đoạn DNA gắn với EtBr đƣợc biểu hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
Các mẫu điện di lên băng dƣơng tính với SRBSDV đƣợc giữ lại để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.3. Tinh sạch dsRNA của SRBSDV bằng cột CF-11
Nguyên lý:
Các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) có đặc tính bám vào cột CF-11 trong điều