Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phương Nam và virus SRBSDV ở Việt Nam

1.2. BỆNH LÙN SỌC ĐEN PHƯƠNG NAM VÀ VIRUS SRBSDV

1.2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lùn sọc đen phương Nam và virus SRBSDV ở Việt Nam

1.2.4.1. Các nghiên cứu xác định virus SRBSDV

Ngày 27/9/2009, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (ĐH Nông Nghiệp Hà Nội) đã

nhâ ̣n được yêu cầu của Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu 2 (thuô ̣c Cu ̣c BVTV) yêu cầu thƣ̉ các mẫu lúa thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An (60 mẫu). Các thử nghiệm ELISA với kháng

18

huyết thanh do Trung tâm sản xuất cũng nhƣ RT -PCR với mồi đă ̣c hiê ̣u do Trung tâm thiết kế đã cho thấy các mẫu lúa bệnh thu tại Nghệ An không bị nhiễm 2 virus gây bê ̣nh VL/LXL nhƣ ở miền Nam.

Tuy nhiên khi chuẩn bi ̣ mẫu bê ̣nh cho kiểm tra ELISA , nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy 2 đă ̣c điểm không bình thường (ngoài các đặc điểm giống như cây bi ̣ bê ̣nh lùn xoắn lá lá bi ̣ nhiễm bởi virus Rice ragged stunt virus (RRSV) ở miền Nam nhƣ cây lùn, lá xanh đậm, ngọn lá xoắn vặn):

(1) Cây bệnh không biểu hiê ̣n triê ̣u chƣ́ng táp và biến vàng ta ̣i mô ̣t bên của mép lá

ở các lá bi ̣ xoắn vă ̣n . Đây là mô ̣t triê ̣u chứng luôn được quan sát thấy trên cây bi ̣ bê ̣nh lùn xoắn lá bị nhiễm bởi virus RRSV.

(2) Có nhiều nốt phồng nhỏ màu trắng tới nâu chạy dọc gân của thân cây lúa sau khi bóc lớp bẹ bên ngoài. Các nốt phồng này đặc biệt nhiều ở phần lóng sát gốc .

Các mẫu đƣợc thu thập tiếp theo tại Nam Định , Thanh Hóa, Sơn La cũng đều có

triê ̣u chứng tương tự mẫu Nghê ̣ An.

Dƣ̣a trên 2 triê ̣u chƣ́ng trên , đă ̣c biê ̣t là triê ̣u chƣ́ng thƣ́ 2, tác nhân gây bệnh đã đươ ̣c dự đoán là do mô ̣t reovirus (họ Reoviridae) gây ra . Các triệu chứng này khá giống với 2 reovirus là Rice black streaked dwarf virus (RBSDV) và Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) = Rice black streaked dwarf virus 2 (RBSDV2).

Để kiểm tra liê ̣u mẫu lúa bê ̣nh miền Bắc có bi ̣ nhiễm RBSDV và SRBSDV hay không , mô ̣t că ̣p mồi cho phép phát hi ện đồng thời cả 2 virus này đã được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ gene S10 của tất cả các chủng sẵn có của 2 virus trên Ngân hàng gen.

Kết quả kiểm tra RT -PCR cho thấy các mẫu bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An và mô ̣t số

đi ̣a phương miền Bắc như Thanh Hóa , Nam Đi ̣nh, Sơn La đều cho phản ứng RT -PCR dương đối với mồi đă ̣c hiê ̣u RBSDV và SRBSDV nhưng không phản ứng với mồi đă ̣c hiê ̣u virus lùn xoắn lá (RRSV).

Bốn sản phẩm RT -PCR đa ̣i diê ̣n cho Nghê ̣ An , Nam Đi ̣nh, Thanh Hóa và Sơn La đã được giải trình tự trực tiếp . Kết quả phân tích trình tự và ph ả hệ cho thấy cả 4 mẫu này đều là virus lùn s ọc đen phương Nam (SRBSDV). Ngoài ra, nghiên cứu hiển

19

vi điện tử cũng phát hiện thấy phân tử virus và thể vùi của virus trong mô cây lúa bị bệnh.Dựa trên kết quả nghiên cứu này, Trung tâm đã bước đầu kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i tại miền Bắc là do virus lùn sọc đen phương Nam (SRBSDV) gây ra [18,25,19,17].

Trong cùng thời gian, các nghiên cứu tương tự cũng được tích cực thực hiện tại Viện Bảo Vệ thực vật (BVTV). Nhóm nghiên cứu Viện Bảo Vệ thực vật cũng hợp tác chặt chẽ với chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trên RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và hiển vi điện tử .

Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái, kích thước tiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử và kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng định nguyên tắc Koch, cũng nhƣ giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của hệ gene virus, nhóm nghiên cứu Viện BVTV cũng xác định tác nhân gây bệnh là virus lùn sọc đen phương Nam (SRBSDV)[10].

Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ Thực vật cũng xác định đƣợc môi giới truyền bệnh là rầy lƣng trắng giống nhƣ nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc.

Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại Việt Nam là bệnh lùn sọc đen (LSĐ) và virus gây bệnh là virus lùn sọc đen phương Nam (SRBSDV).

1.2.4.2. Các nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán virus SRBSDV

Năm 2010, Viện Bảo vệ Thực vật đã nghiên cứu phát triển quy trình chẩn đoán SRBSDV bằng phương pháp PCR/RT-PCR. Quy trình bao gồm các bước: Giải trình tự sản phẩm PCR vùng gen bảo thủ có chiều dài 600 bp và phân tích trình tự gen sử dụng chức năng BLAST trong ngân hàng gen để xác định độ tương đồng với tất cả các trình tự nucleic acid hiện có trong ngân hàng gen. Sau đó, gia phả trình tự gene thu đƣợc được phân tích bằng phần mềm MEGA-4.1 với trình tự gen tương ứng của các virus có độ tương đồng cao nhất cũng như các virus có cùng nhóm hoặc cùng phân nhóm và các virus thuộc nhóm hay phân nhóm khác cùng họ[6].

20

Từ năm 2012 đến nay, Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp và Trung tâm bệnh cây nhiệt đới - Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã phân lập và giải trình tự toàn bộ phân đoạn S7, S9 và S10 của 13 chủng SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa từ miền Trung trở ra. Trên cơ sở phân tích trình tự hệ gene phân đoạn S10 của các chủng vius đã thiến kế cặp mồi đặc hiệu cho chủng SRBSDV ở Việt nam và phát triển quy trình chẩn đoán dựa trên kỹ thuật RT-PCR.

Nghiên cứu đã tối ưu hóa được phương pháp tách chiết RNA tổng số, thiết kế được cặp mồi đặc hiệu dùng trong chẩn đoán SRBSDV, tối ƣu đƣợc loại mẫu và vị trí xét nghiệm, tối ƣu loại phản ứng RT-PCR dùng trong xét nghiệm SRBSDV và thời gian RT-PCR tương ứng [5,12]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã nghiên cứu cơ sở khoa học của việc chẩn đoán SRBSDV bằng kỹ thuật kháng nghuyên kháng thể và đã (1) tạo mẫu nhiễm bệnh, tinh sạch phân tử virus từ mẫu nhiễm bệnh và tạo thành công kháng thể đa dòng SRBSDV và (2) tinh sạch và biểu hiện thành công protein vỏ P10, 2 polypeptide P1 và P2 trên protein P10 phục vụ cho việc tạo kháng thể đặc hiệu [5].

21

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU