CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Tổng hợp cDNA từ dsRNA
2.2.4.1 Thiết kế cặp mồi
Các phân đoạn S7 của các chủng SRBSDV trên thế giới có trên GeneBank đƣợc tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tương đồng bằng phần mềm MEGA5. Vùng bảo thủ của các phân đoạn này sẽ đƣợc lựa chọn và sử dụng để thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7. Các cặp mồi có sẵn trình tự sẽ đƣợc chúng tôi đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma.
2.2.4.2. Tổng hợp cDNA sợi 1 Nguyên tắc:
cDNA được tổng hợp từ RNA dưới sự xúc tác của enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase). Enzyme này tổng hợp sợi đơn DNA bổ sung dựa vào sợi khuôn mRNA. Sợi kép RNA/DNA đƣợc xử lý với kiềm hoặc ribonuclease (phân hủy sợi khuôn RNA) để tạo thành sợi đơn cDNA. Tiếp sau đó, DNA polymerase I tổng hợp sợi đơn cDNA thứ hai để có đƣợc sợi đôi cDNA hoàn chỉnh.
Tiến hành:
Các cặp oligo thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7 đƣợc sử dụng để tiến hành tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen virus SRBSDV phân lập từ mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen. Quy trình phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau:
Thành phần phản ứng:
Mồi xuụi 10 pmol : 1 àl Mồi ngƣợc 10 pmol: 1 àl
RNA sợi đụi : 1 àl
Đệm 5X : 4 àl
dNTP 10 mM : 2 àl
Reverse transcriptase (200u/àl): 1 àl
H2O : 10 àl
Tổng thể tớch : 20àl
29
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 42oC trong 60 phút. Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc sử dụng trực tiếp để làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại các đoạn trình tự đặc hiệu.
2.2.4.3. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng kĩ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Karl Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985 và đƣợc tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số loài vi khuẩn khác.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase trong môi trường thích hợp có dư các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều triệu lần so với ban đầu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản:
Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn.
Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống khoảng 30-65°C.
Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA polymerase các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ 68-72°C. Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thước đoạn gen cần nhân bản.
Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.
30
Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi nhân trình tự phân đoạn S7 nhƣ sau:
Thành phần Thể tích
dd H2O 9,8 l
Đệm Taq DNA polymerase 10X 1,5 l Taq DNA polymerase (5u/ àl) 0,5 l
dNTPs 2mM 1,5 l
Mồi xuôi 10 pmol 0,6 l
Mồi ngƣợc 10 pmol 0,6l
cDNA khuôn 0,5 l
Tổng thể tích 15 l
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau:
2.2.4.4. Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit Fermentas
Bộ kit GenJETTM Gel Extraction đƣợc thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn.
Bộ kít sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng nhƣ sau:
Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác bằng lƣỡi dao sạch từ gel agaros và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (binding buffer) đƣợc bổ sung vào với 1 thể tớch bằng khối lƣợng miếng gel (1 àl:1 mg) và ủ ở 0° trong 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng đƣợc
31
gạn bỏ. 500 à đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung vào cột và ly tõm 1 phỳt với vận tốc 10.000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ. Lặp lại bước này một lần nữa. Cột tinh sạch có chứa DNA đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới và bổ sung 100 àl Elution buffer vào chớnh giữa lớp màng silica của cột. Ly tõm 1 phỳt với tốc độ 10.000 vòng phút để thu DNA. Mẫu DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20° để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.5. Nhân dòng sản phẩm PCR bằng bộ kit pGEM®-T Easy Cloning