Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Karl Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985 và đƣợc tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số loài vi khuẩn khác.
Nguyên tắc của kỹ thuật này là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in vitro của DNA polymerase trong môi trƣờng thích hợp có dƣ các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều triệu lần so với ban đầu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản: Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn.
Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống khoảng 30-65°C.
Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA polymerase các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với mạch DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ 68-72°C. Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thƣớc đoạn gen cần nhân bản.
Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 7 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC cho đến khi phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng Ethidium bromide.
30
Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi nhân trình tự phân đoạn S7 nhƣ sau:
Thành phần Thể tích
dd H2O 9,8 l
Đệm Taq DNA polymerase 10X 1,5 l
Taq DNA polymerase (5u/ µl) 0,5 l
dNTPs 2mM 1,5 l
Mồi xuôi 10 pmol 0,6 l
Mồi ngƣợc 10 pmol 0,6l
cDNA khuôn 0,5 l
Tổng thể tích 15 l
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt nhƣ sau: