Nguyên lý:
Các phân tử RNA sợi đôi (dsRNA) có đặc tính bám vào cột CF-11 trong điều kiện môi trƣờng đệm STE có chứa 16.5% EtOH và mất khả năng bám cột trong môi
27
trƣờng đệm STE không chứa EtOH. Vì vậy hệ gen virus đƣợc tách ra khỏi hệ gen và RNA của lúa bằng phƣơng pháp chạy qua cột CF-11.
Tiến hành:
Quy trình phân lập hệ gen của SRBSDV đƣợc thực hiện theo những bƣớc sau: - Nghiền nhỏ khoảng 1g mẫu lúa, chuyển mẫu đã đƣợc nghiền sang ống falcol sạch, bổ sung 10-20ml STE 2X vào mẫu để làm đệm cho phản ứng. Tiếp tục bổ sung vào hỗn hợp 2ml SDS 10% và lắc đều. Sau đó, bổ sung vào hỗn hợp 10ml phenol đã bão hòa, lắc nhẹ trong khoảng 45 phút.
- Ly tâm hỗn hợp trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, chuyển dịch nổi sang ống mới, thêm vào H2O đến thể tích 20ml. Sau đó, bổ sung 4ml EtOH tuyệt đối vào dung dịch, tạo điều kiện để phân tử dsRNA bám vào cột (~16.5%EtOH)
- Cân 2g bột CF-11 vào cốc đong, bổ sung 10ml dung dịch STE 1X chứa 16.5% EtOH. Sau đó, đƣa hỗn hợp lên cột và tiếp tục bão hòa cột bằng 10x10ml STE1X chứa 16.5% EtOH. Quá trình gắn cột xảy ra khi hỗn hợp mẫu (đã chuẩn bị) chảy từ từ qua cột đã đƣợc bão hòa.
- Sau khi gắn cột, rửa cột bằng cách cho chảy từ từ qua cột 10x10ml STE 1X chứa 16.5% EtOH
- Cột sau khi rửa, đẩy cột bằng cách cho chảy từ từ 10ml STE 1X không chứa EtOH qua cột, làm mất khả năng bám cột của các phân tử dsRNA, thu dịch đẩy vào ống Falcol sạch. Sau đó, tách hoàn toàn dsRNA bằng cách thêm 0,6V Isopropanol vào dịch đẩy cột, lắc đều hỗn hợp, ủ ở -20oC ít nhất 4h.
- Ly tâm dịch trong 10 phút ở tốc độ 12000v/p, loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Rửa cặn 2 lần bằng EtOh 70% để làm tan các muối. Sau đó, cặn đƣợc phơi trong không khí đến khi khô và tiếp tục đƣợc hòa tan bằng 50µl H2O (cất 2 lần). Sản phẩm thu đƣợc đƣợc giữ ở -20°C để phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo.
28