Từ các trình tự thu đƣợc của các phân đoạn S7 của các mẫu bệnh thu đƣợc tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành tổng hợp, so sánh và phân tích mức độ tƣơng đồng với các trình tự tƣơng ứng của các chủng SRBSDV khác trên GeneBank. Từ đó, chúng tôi xây dựng cây phân loại và phân tích các đặc điểm di truyền học cũng nhƣ mối quan hệ của chủng virus thu đƣợc tại mẫu bệnh ở Việt Nam với các chủng gây bệnh lúa lùn sọc đen trên thế giới (hiện nay bệnh mới chỉ đƣợc phát hiện tại Trung Quốc và Việt Nam). Qua đó, mức độ tiến hóa của phân đoạn S7 của các chủng thu đƣợc và mức độ ảnh hƣởng của protein mã hóa bởi phân đoạn này đến khả năng lây lan của bệnh đƣợc đánh giá. Từ đó, chúng tôi có thể đƣa ra phƣơng án phòng bệnh hoặc dập dịch thích hợp.
36
CHƢƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập và bảo quản mẫu
Các mẫu lúa bệnh đƣợc thu trực tiếp tại đồng ruộng, với những cây lúa có triệu chứng điển hình: thân cây thấp, lá xanh đậm, xoắn đầu lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đƣờng gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân... (Bảng 2 và Hình 10). Trong đó, triệu chứng lớp u sáp trên thân hay sọc phồng ở gân thân cây lúa (bên trong bẹ) là triệu chứng đặc trƣng duy nhất của bệnh
lùn sọc đen. Các mẫu sau khi thu thập sẽ đƣợc rửa sạch, loại bỏ phần héo úa, cắt nhỏ và sử dụng ngay hoặc bảo quản khô trong các bình kín nhờ hạt hút ẩm silicagel.
Kết quả chúng tôi đã thu đƣợc 51 mẫu bệnh thuộc các tỉnh Ninh Bình, Sơn La, Hải Phòng, Thái Bình, Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Huế. Các mẫu đều đƣợc đánh số thứ tự theo từng tỉnh.
Bảng 2: Các biểu hiện của bệnh lùn sọc đen trên lúa
STT Triệu chứng
1 Cây thấp lùn 2 Xoắn chót lá
3 Có nhiều vết nhăn ngang trên lá 4 Lá bị xoắn
5 Xoắn lá nõn
6 Sọc phồng ở gân phiến lá 7 Sọc phồng ở gân bẹ lá
8 Sọc phồng ở gân thân cây (bên trong bẹ) hay lớp u sáp trên thân
9 Bộ lá xanh đậm 10 Cây cứng 11 Trắng mép lá 12 Rách mép lá 13 Nhánh phụ 14 Đen hạt
37
ĐH (Đen hạt) GL (Gấp lá) L (lùn) NG (nhăn giữa lá) N (nghẹn lá) NP (Nhánh phụ)
NC (Nhăn chót lá) RN (rễ ngƣợc) RM (rách mép lá) SP (Sọc phiến) SB (Sọc bẹ) ST (Sọc thân)
PTH (Phồng tràng hạt) TM (trắng mép lá) VLX (Vàng lá xoắn) X (xoắn lá) XLN (Xoắn lá nõn) XC (Xoắn chót lá) Hình 10. Triệu chứng một số mẫu lúa thu thập tại các tỉnh Việt Nam
38
3.2. Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phƣơng pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bƣớc bƣớc
3.2.1. Kết quả xét nghiệm mẫu bệnh sử dụng phương pháp Sandwich- ELISA
Sử dụng phƣơng pháp Sandwich-ELISA với quy trình và kit (IgG và conjugate) do Tiến sỹ Omura tại Trung tâm Khoa học Nông nghiệp Nhật Bản cung cấp chúng tôi đã tiến hành kiểm tra mẫu bệnh với lần lƣợt từng loại virus RRSV, RGSV, RTBV, RTSV, RGDV, RRBV và RBSDV. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Kết quả bƣớc đầu cho thấy số lƣợng mẫu nhiễm RTSV là 11/51 mẫu, số lƣợng mẫu nhiễm RGSV là 6/51 mẫu, nhiễm RGDV là 4/ 51 mẫu, nhiễm RRSV là 4/51 mẫu, lƣợng mẫu nhiễm RTBV là 3/51 mẫu, nhiễm RRBV rất ít, chiếm 1/51 mẫu, 5/51 mẫu nhiễm RBSDV, ngoài ra còn có 5/51 mẫu nghi nhiễm RBSDV với phản ứng dƣơng tính không rõ ràng (Hình 11). Sau kiểm nghiệm chỉ có 12 mẫu không có bất kỳ phản ứng dƣơng tính nào với kiểm nghiệm ELISA, các mẫu này sau đó đƣợc chúng tôi kiểm nghiệm tiếp bằng phƣơng pháp RT-PCR một bƣớc cùng với các mẫu có phản ứng dƣơng tính không rõ ràng để khẳng định sự có mặt của SRBSDV với cặp mồi đặc hiệu cho virus này.
39
3.2.2. Sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp RT-PCR 1 bước
Tất cả 17 mẫu sau khi đã đƣợc kiểm tra bằng kit ELISA không có phản ứng dƣơng tính hoặc dƣơng tính không rõ ràng với bất kỳ kit phát hiện virus nào đã đƣợc chúng tôi đi kiểm nghiệm bằng phƣơng pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu virus lùn sọc đen phƣơng Nam là SRBSDVS10F3/R3 (725bp). Kết quả điện di kiểm tra cho thấy phản ứng RT-PCR 1 bƣớc với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 có 12 mẫu có phản ứng dƣơng tính với cặp mồi này (Hình 12A,B) . Sơ bộ chúng tôi cho rằng 12 mẫu bệnh này có thể đƣợc sử dụng làm nguồn vật liệu phân lập hệ gen virus lùn sọc đen phƣơng nam SRBSDV ở Việt Nam (Hình 12A&B).
Kết quả toàn bộ quy trình xét nghiệm đƣợc thể hiện trong bảng 3.
Hình 12. Một phần kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bƣớc của các mẫu lúa
A, B. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR một bước với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 Giếng M: Marker; giếng 1: Mẫu Hải Phòng-3; giếng 2: Mẫu Huế-1; giếng 3: Mẫu Huế-2; giếng 4: Mẫu Hòa Bình-2; giếng 5: Mẫu Nam Định-2; giếng 6: Mẫu Nam Định-1; giếng 8: Mẫu Nghệ An-1; giếng 9: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 10: Mẫu Ninh Bình-3; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu Thái Bình-4; giếng 13: Mẫu Thái Bình-1; giếng 14: Mẫu Thái Bình-2
3.3. Phân lập hệ gen của các mẫu SRBSDV
12 mẫu lúa bệnh thu đƣợc từ các vùng dịch, sau khi sàng lọc để chọn ra các mẫu dƣơng tính với SRBSDV, đƣợc chúng tôi sử dụng để phân lập hệ gen của SRBSDV, sử dụng phƣơng pháp tách bằng cột CF11.
40
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RNA sợi đôi tinh sạch trên gel agrose 1% (chạy 100V trong 1 giờ) trong hình 13 cho thấy, hệ gen của các mẫu virus thu đƣợc gồm 7 băng, trong đó băng thứ 3 (tính theo kích thƣớc giảm dần) bao gồm ba phân đoạn S3, S4, S5 có kích thƣớc tƣơng đƣơng nhau ( lần lƣợt là 3618bp, 3571bp và 3167bp) và băng thứ 6 bao gồm hai phân đoạn S8 và S9 (1928bp và 1900bp) (Hình 13). So sánh với hình ảnh điện di hệ gen SRBSDV trên agarose của Zhou et al. (2008) [23] có thể thấy chúng tôi đã phân lập thành công hệ gen của SRBSDV. Đây chính là nguyên liệu ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu RNA đƣợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các mục đích tiếp theo.
Hình 13: Hình ảnh điện di hệ gen của SRBSDV phân lập từ 12 mẫu lúa
Giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Ninh Bình-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Thái Bình-1; giếng 5: Mẫu Thái Bình-2; giếng 6: Mẫu Nghệ An; giếng 7: Mẫu Nam Định; giếng 8: Mẫu Lào Cai; giếng 9:
41 STT Mẫu Địa điểm lấy mẫu Kết quả ELISA Kết quả RT-PCR với cặp mồi SRBSDVS10F3/R3 Kết luận 1 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 2 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 3 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 4 Hà Tĩnh Nhiễm RTSV 5 Hải Phòng Nhiễm RGDV 6 Hải Phòng Nhiễm RGDV
7 Hải Phòng Nhiễm RBSDV Ghi chú
8 Hải Phòng (*) (-) Nhiễm RBSDV
9 Hòa Bình Nhiễm RGSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTSV
10 Hòa Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
11 Hòa Bình Nhiễm RRSV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGSV
12 Hòa Bình Nhiễm RRSV
13 Huế (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RGDV
14 Huế (+) Nhiễm SRBSDV
15 Huế Nhiễm RBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRSV
16 Huế Nhiễm RTSV
17 Lào Cai (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RBSDV
18 Lào Cai Nhiễm RTBV
19 Lào Cai Nhiễm RTBV Dƣơng tính với kháng
nguyên RTBV
20 Lào Cai Nhiễm RBSDV
21 Nam Định (+) Nhiễm SRBSDV Dƣơng tính với kháng
nguyên RRBV
22 Nam Định (*) (-) Nhiễm RBSDV
23 Nam Định Nhiễm RGSV (*) Dƣơng tính không rõ ràng
với kháng nguyên RBSDV
24 Nam Định Nhiễm RRBV
25 Nghệ An (+) Nhiễm SRBSDV Âm tính
26 Nghệ An Nhiễm RTSV
27 Nghệ An Nhiễm RTSV (+) Dƣơng tính với cặp mồi
tƣơng ứng
28 Nghệ An Nhiễm RBSDV
29 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV (-) Âm tính với cặp mồi tƣơng
ứng 30 Ninh Bình (+) Nhiễm SRBSDV 31 Ninh Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV 32 Ninh Bình Nhiễm RRSV 33 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV 34 Quảng Trị (+) Nhiễm SRBSDV 35 Quảng Trị Nhiễm RGSV 36 Quảng Trị Nhiễm RGSV 37 Sơn La (+) Nhiễm SRBSDV 38 Sơn La Nhiễm RGDV 39 Sơn La Nhiễm RTBV 40 Sơn La Nhiễm RGSV 41 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV 42 Thái Bình (+) Nhiễm SRBSDV 43 Thái Bình Nhiễm RGDV 44 Thái Bình (*) (-) Nhiễm RBSDV
45 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
Bảng 3: Kết quả sàng lọc mẫu bệnh bằng phương pháp Sandwich-ELISA và RT-PCR một bước
46 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
47 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
48 Thanh Hóa Nhiễm RTSV
49 Vĩnh Phúc Nhiễm RBSDV
50 Vĩnh Phúc Nhiễm RGSV
42
3.4. Phân lập phân đoạn S7 của SRBSDV từ các mẫu lúa bệnh
Sau khi thu đƣợc RNA hệ gen SRBSDV tinh sạch, chúng tôi điện di các mẫu RNA sợi đôi trên gel agarose 1% để các băng RNA phân tách hoàn toàn. Chúng tôi cắt chính xác băng RNA có kích thƣớc 2176 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết của phân đoạn S7. Các phân mảnh này sau đó đƣợc chúng tôi tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình của nhà sản xuất để loại hoàn toàn agarose. Sản phẩm RNA tinh sạch đƣợc chúng tôi tiếp tục điện di kiểm tra trên gel agarose 1% .
Kết quả thu đƣợc cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc băng RNA có kích thƣớc khoảng 2176 bp, tƣơng ứng với kích thƣớc lí thuyết của phân đoạn S7 (Hình 14). Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã phân lập thành công phân đoạn S7 của SRBSDV từ các mẫu lúa dƣơng tính với bệnh lùn sọc đen phƣơng Nam thu thập từ các vùng dịch.
Hình 14: Kết quả điện di phân đoạn S7 phân lập được của SRBSDV trên gel agarose 1%
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; ; Giếng 1: Đối chứng âm; Giếng 2-13: Phân đoạn S7 của SRBSDV của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam
43
3.5. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phƣơng pháp RT-PCR
3.5.1. Thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho phản ứng RT-PCR phục vụ nhân bản phân đoạn S7 đoạn S7
Dựa trên các trình tự của phân đoạn S7 của SRBSDV đã công bố trên Genebank, chúng tôi đã phân tích mức độ tƣơng đồng, so sánh và chọn lựa vùng bảo thủ trong hệ gen của virus này, từ đó thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho phép nhân bản phân đoạn S7 (bao gồm cả khung đọc mở và vùng không dịch mã). Các cặp oligo nucleotide có kích thƣớc 25 nucleotit, nằm trên vùng bảo thủ của phân đoạn S7, có hàm lƣợng GC cao đƣợc chúng tôi đặt sinh tổng hợp tại công ty Sigma. Trình tự của các cặp oligo nucleotide đƣợc trình bày trong bảng 4.
Bảng 4: Trình tự các mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế phục vụ cho phản ứng RT-PCR Tên mồi Trình tự
S7-Fw 5‟-AAGTTTTTTTCGACCTGTCTGGACC-3‟
S7-Rv 5‟-GTCAAGGTCGAAATGCAGCTGATGTC-3‟
3.5.2. Nhân bản phân đoạn S7 bằng phương pháp RT-PCR
Sử dụng các cặp oligo nucleotide đã thiết kế đặc hiệu cho phân đoạn S7, chúng tôi đã tiến hành sinh tổng hợp cDNA sợi 1 từ RNA hệ gen của 12 mẫu virus LSĐPN thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng bộ kit Revert Aid First strand cDNA Synthesis của hãng Fermentas. Phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc chúng tôi thực hiện theo quy trình hƣớng dẫn kèm theo của bộ kit nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.4.2.
Do sản phẩm của phản ứng tổng hợp cDNA có nồng độ rất thấp, nên không thể kiểm tra kết quả bằng phƣơng pháp điện di sản phẩm trên gel agarose đƣợc. Chính vì vậy chúng tôi đã sử dụng trực tiếp sản phẩm này làm khuôn cho phản ứng nhân bản phân đoạn S7 bằng kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế (Bảng 3). Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với các thành phần và chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày ở mục 2.2.4.3.
44
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy với phản ứng PCR sử dụng 1µl sản phẩm phản ứng tổng hợp cDNA làm khuôn, chúng tôi đã thu đƣợc một băng DNA đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 15). Kích thƣớc này hoàn toàn tƣơng tự với kích thƣớc tính toán lí thuyết đã công bố trên Ngân hàng Gen Thế giới của phân đoạn S7. Ngƣợc lại, đối với phản ứng đối chứng âm sử dụng H2O làm khuôn thay cho DNA, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA có kích thƣớc 2,1 kb này.
Hình 15: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân phân đoạn S7 của 12 chủng vius với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7
Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1: Đối chứng dương; giếng 2-13: Sản phẩm PCR phân đoạn S7 của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng 14: đối chứng âm (không có khuôn DNA)
Kết quả thu đƣợc chứng tỏ chúng tôi đã nhân bản thành công phân đoạn S7 của 12 mẫu virus SRBSDV tách chiết từ các mẫu lúa nhiễm bệnh thu đƣợc tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế dựa trên trình tự đã công bố của phân đoạn S7. Sản phẩm nhân bản này sẽ đƣợc chúng tôi sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR phân đoạn S7 của virus SRBSDV.
Sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 sau khi điện di trên gel agarose 1% đƣợc chúng tôi nhuộm bằng Ethidium bromide và kiểm tra sự có mặt của băng DNA kích thƣớc 2,1 kb dƣới tia UV. Băng DNA này đƣợc chúng tôi cắt chính xác khỏi bản gel agarose và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình
45
của nhà sản xuất (mục 2.2.4.4) nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch tiếp tục đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thu đƣợc cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm DNA hoàn toàn tinh sạch, có kích thƣớc đúng với kích thƣớc tính toán lí thuyết của phân đoạn S7 (Hình 16).
Sản phẩm PCR tinh sạch nhân bản phân đoạn S7 đƣợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho thí nghiệm nhân dòng tiếp theo.
Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction trên gel agarose 1%
Giếng M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: Sản phẩm DNA tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình-1, Thái Bình-2, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; Giếng 13: Đối chứng âm
3.7. Nhân dòng phân đoạn S7 vào vector PGEM-T
3.7.1. Tạo plasmid tái tổ hợp PGEM-T/S7 biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α.
Phân đoạn S7 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq DNA polymerase, ngoài hoạt tính tổng hợp ADN còn có hoạt tính terminal transferase do đó có thể gắn thêm một Adenosine 5‟ monophosphate vào đầu 3‟ của sản phẩm PCR. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành gắn sản phẩm PCR nhân bản phân đoạn S7 bằng enzyme Taq ADN polymerase vào vector pGEM-T mang Thymidine 5‟ monophosphate đầu 3‟. Vector tái tổ hợp mong muốn sẽ là vector pGEM-T gắn với phân đoạn S7.
Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector đầu T pGEM-T đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit pGEM®-T Easy Cloning (mục 2.2.5.1) với nguyên tắc
46
đƣợc mô tả nhƣ hình 17. Hỗn hợp phản ứng gắn sau đó đƣợc chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn đầu T vào tế bào E. coli cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc nhiều khuẩn lạc (có khả năng mang vector tái tổ hợp) trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung ampiciline 100 µg/ml, cơ chất X-gal và IPTG là chất cảm ứng (Hình 18).
Hinh 17: Sơ đồ minh họa quá trình dòng hóa S7 vào vector pGEM-T
(A) (B)
Hình 18: Kết quả biến nạp sản phẩm phản ứng gắn vào E.coli chủng DH5α A. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli và cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ