3.7.2.1. Kiểm tra sự có mặt phân đoạn S 7 trong plasmid tá i tổ hợp b ằng phản ứng PCR. PCR.
Khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi cấy và tách chiết plasmid theo quy trình của bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (mục 2.2.6). Plasmid tinh sạch sau khi đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc plasmid hoàn toàn tinh sạch, không bị lẫn RNA (Hình 19).
Hình 19: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm plasmid tinh sạch trên gel agarose 1%
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-11: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch từ các khuẩn lạc tương ứng với các mẫu; giếng 1: Mẫu Ninh Bình-1; giếng 2: Mẫu Huế-2; giếng 3: Mẫu Sơn La-1; giếng 4: Mẫu Lào Cai; giếng 5: Mẫu Thái Bình-1; giếng 6: Mẫu Thái Bình-2; giếng 7: Mẫu Hòa Bình; giếng 8:Mẫu Nghệ An; giếng 9: Mẫu Nam Đinh; giếng 10: Mẫu Quảng Trị-1; giếng 11: Mẫu Quảng Trị-2; giếng 12: Mẫu Huế-1
48
Sản phẩm plasmid tinh sạch đƣợc chúng tôi sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi khác nhau: cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7 (S7-Fw/S7-Rv) và cặp mồi đặc hiệu của vector (T7-Fw/SP6-Rv). Trong đó, cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv là hai trình tự nằm trên vector pGEM-T, có khoảng cách 126 bp (Hình 16). Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm PCR từ khuôn là vector tái tổ hợp pGEM-T/S7 sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng 2302 bp với cặp mồi vector và 2176 bp với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7.
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 20) cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của phân đoạn S7-Fw/S7-Rv cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,1 kb (Hình 20, giếng 1-12). Đối với sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi vector T7-Fw/ SP6-Rv (Hình 21), chúng tôi thu đƣợc một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,3 kb (Hình 21, giếng 1-12), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính toán lý thuyết, bao gồm 2176 bp của phân đoạn S7 và 126 bp của plasmid. Đối với các phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào (Hình 20 và 21, giếng (-)). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định plasmid tinh sạch thu đƣợc là plasmid tái tổ hợp mang trình tự phân đoạn S7 đƣợc phân lập từ RNA genome của virus lùn sọc đen Phƣơng Nam.
Hình 20: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch Sử dụng cặp mồi S7-Fw/S7-Rv
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng
49
Hình 21: Kết quả điện di sản phẩm PCR từ plasmid tinh sạch sử dụng cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv
Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; giếng 1-12: plasmid pGEM-T/S7 tinh sạch của lần lượt các mẫu Ninh Bình-1, Ninh Bình-2, Sơn La-1, Thái Bình, Hòa Bình, Nghệ An, Nam Định, Lào Cai, Quảng
Trị-1, Quảng Trị-2, Huế-1, Huế-2; giếng (+): đối chứng dương; giếng (-): đối chứng âm