Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện tách chiết đến hàm lượng flavoniod, tanin và saponin tổng của lá khôi nhung (ardisia silvestris pitard)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƢỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT ĐẾN HÀM LƢỢNG FLAVONIOD, TANIN VÀ SAPONIN TỔNG CỦA LÁ KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) TRẦN THỊ THANH TÂM Đà Nẵng, năm 2023 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MƠI TRƢỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT ĐẾN HÀM LƢỢNG FLAVONIOD, TANIN VÀ SAPONIN TỔNG CỦA LÁ KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Sinh viên thực : Trần Thị Thanh Tâm Lớp : 18CNSH Giáo viên hƣớng dẫn : ThS Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng, năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu dƣới hƣớng dẫn ThS Vũ Đức Hồng cơng tác khoa Sinh – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng chƣa đƣợc công bố cơng trình khác trƣớc Tơi hồn toàn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả (Ký tên) Trần Thị Thanh Tâm i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp tơi nhận đƣợc nhiều quan tâm giúp đỡ từ cá nhân tập thể suốt thời gian thực Đầu tiên xin chân thành bày tỏ lịng cảm ơn q báu tới ThS Vũ Đức Hồng, ngƣời tận tâm dẫn định hƣớng tận tình dạy kiến thức mặt chuyên môn nhƣ tạo điều kiện hỗ trợ thực hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo khoa Sinh – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Đà Nẵng giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu, xây dựng thành cơng khóa luận Tơi xin cảm ơn tất bạn sinh viên NCKH phịng thí nghiệm động viên giúp đỡ suốt q trình thực đề tài Cuối tơi xin chân thành cảm ơn đến gia đình tơi ln lo lắng, chăm sóc tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 10 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Trần Thị Thanh Tâm ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU vii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài: Mục tiêu: Ý nghĩa đề tài : .2 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cây Khôi nhung .3 1.1 Giới thiệu Khôi nhung 1.2 Đặc điểm sinh học Khôi nhung 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái 1.3 Thành phần hóa học Khơi nhung 1.4 Tác dụng Khôi nhung .4 1.5 Tình hình nghiên cứu 1.5.1 Việt Nam 1.5.2 Thế giới .6 Khái quát hợp chất 2.1 Flavonoid 2.1.1 Khái quát Flavonoid .6 2.1.2 Tác dụng Flavonoid 2.2 Tanin 2.2.1 Khái quát Tanin 2.2.2 Tác dụng Tanin 2.3 Saponin .8 2.3.1 Khái quát saponin 2.3.2 Tác dụng saponin Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 10 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 10 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 10 iii 2.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu 10 2.3.2 Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn flavonoid, tanin va saponin 11 2.3.3 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid, tanin, saponin tổng số 11 2.3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu .13 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .14 3.1 Khảo sát dung môi chiết phƣơng pháp đánh sóng siêu âm 14 3.2.Khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết cao hàm lƣợng hợp chất phƣơng pháp đánh sóng siêu âm 17 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết cao hàm lƣợng hợp chất phƣơng pháp đánh sóng siêu âm 19 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .23 4.1 Kết luận: 23 4.2 Kiến nghị: .23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 PHỤ LỤC 27 iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu bảng Tên bảng Trang Bảng 3.1 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hiệu suất chiết cao 14 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hàm lƣợng Flavonoid tổng số 15 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hàm lƣợng Tanin tổng số 16 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hàm lƣợng hàm lƣợng Saponin tổng số tổng số 16 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết cao 17 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hàm lƣợng flavonoid 18 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hàm lƣợng Tanin 18 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hàm lƣợng saponin 19 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết cao 20 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết cao 20 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hàm lƣợng flavonoid 20 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hàm lƣợng Tanin 21 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hàm lƣợng saponin 22 v DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tên hình ảnh hình ảnh Trang Hình 1.1 Hình ảnh Khơi nhung Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo acid tannic Hình 2.1 Máy quay thu cao dƣợc liệu 10 vi TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU “Khảo sát ảnh hƣởng số điều kiện tách chiết đến hàm lƣợng flavoid, tanin saponin thu đƣợc dịch chiết Khơi nhung (Ardisia silvestris Pitard)” Cây Khơi nhung lồi thảo dƣợc đƣợc dân gian sử dụng chủ yếu chữa bệnh đau dày Nghiên cứu đƣợc thực nhằm đánh giá ảnh hƣởng điều kiện tách chiết đến hàm lƣợng flavonoid, tanin saponin Khôi nhung khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng Trong nghiên cứu này, điều kiện tách chiết đƣợc khảo sát gồm: Nồng độ dung môi chiết, thời gian chiết nhiệt độ chiết Hàm lƣợng flavonoid, tanin saponin đƣợc xác định phƣơng pháp đo quang Kết nghiên cứu cho thấy: - Dung mơi phù hợp để trích ly hợp chất favonoid, Tanin saponin ethanol 70% Hàm lƣợng flavonoid, tanin, saponin chiết đƣợc lần lƣợt 4,0545±0,1468 (mg QE/g bột dƣợc liệu); 3,7855 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 3,1822±0,1398 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) - Thời gian phù hợp để trích ly hợp chất favonoid, Tanin saponin 30 phút Hàm lƣợng flavonoid, tanin, saponin chiết đƣợc lần lƣợt 4,6492±0,1502 (mg QE/g bột dƣợc liệu); 6,3177 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 3,8749±0,1508 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) - Nhiệt độ phù hợp để trích ly hợp chất favonoid, Tanin 50°C với hàm lƣợng lần lƣợt 5,2336±0,1111 (mg QE/g bột dƣợc liệu); 7,5311 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) saponin 30°C với hàm lƣợng 3,7981±0,1453 (mg RG/ g bột dƣợc liệu)  Hàm lƣợng flavonoid, tanin, saponin trích ly đạt giá trị lớn lần lƣợt là: 5,2336 (mg QE/g bột dƣợc liệu), 7,5311 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 3,8749 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) vii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài: Hiện nay, dƣợc liệu đóng vai trị quan trọng ngành y tế Việt Nam, góp phần chăm sóc, bảo vệ sức khỏe cho ngƣời chữa bệnh phƣơng pháp y học cổ truyền, đồng thời dƣợc liệu cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dƣợc để sản xuất thuốc thực phẩm chức Theo tổ chức Y tế giới (WHO) đánh giá, 80% dân số giới dựa vào y học cổ truyền để đáp ứng cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu, chủ yếu thuốc từ cỏ Do đó, nhà khoa học hƣớng đến nghiên cứu tìm phƣơng pháp hỗ điều trị, góp phần cung cấp thêm lựa chọn cho thầy thuốc Một quan tâm hàng đầu nhà khoa học tìm hợp chất, thuốc thay số loại tân dƣợc có nguồn gốc từ thảo dƣợc Cây Khơi nhung lồi thuộc chi Ardisia, họ Myrsinnaceae (Anh thảo) , có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý nhƣ hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm giảm đau, chống oxi hóa, chống đái tháo đừờng, chống lỗng xƣơng, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan hoạt tính chống ung thƣ tốt (Do, 2004) Kobayashi & de Mejia (2005) nhận định: Chi Ardisia – nguồn cung cấp hợp chất tăng cƣờng sức khỏe dƣợc phẩm có nguồn gốc thiên nhiên quý giá Một số nghiên cứu cho thấy Khơi nhung có diện tannin, glucoside, saponin, alkaloid, chất béo, carotene, flavonoid (Nguyen, 1999; Tran, 2002) Lá Khơi nhung (Ardisia silvestris Pitard) có chứa hàm lƣợng lớn hợp chất polyphenolic, tannin flavonoid, hợp chất đƣợc nghiên cứu chứng thể nhiều tác dụng sinh học Lá Khôi nhung thƣờng đƣợc đồng bào miền trung thƣờng sử dụng để chữa bệnh dày; vậy, Khôi nhung đƣợc ngƣời dân miền trung sử dụng chủ yếu dựa kinh nghiệm dân gian, chƣa có sở khoa học rõ ràng cụ thể thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Đồng thời, với giá trị sẵn có Khơi nhung cần có định hƣớng nghiên cứu bảo tồn lồi lồi đƣợc ghi Sách Đỏ Việt Nam (1996, 2007) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (V) khuyến cáo “chỉ khai thác có mức độ giữ lại chƣa đến tuổi thu hái Có thể tổ chức gây trồng để lấy nguyên liệu làm thuốc” Theo PGS TS Nguyễn Tập, ngun Trƣởng phịng Tài ngun Viện Dƣợc liệu, Khơi nhung loài dƣợc liệu quý cần phải nhân giống nghiên cứu Tuy nhiên, Việt Nam dù đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh dân gian nhƣng chƣa có nhiều nghiên cứu thành phần nhƣ điều kiện ảnh hƣởng đến q trình chiết Khơi nhung Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát dung môi chiết phƣơng pháp đánh sóng siêu âm Dung mơi đóng vai trị quan trọng q trình chiết xuất Dung mơi hịa tan tốt hoạt chất nâng cao đƣợc hiệu suất chiết hàm lƣợng chất Tùy vào độ phân cực hợp chất mà lựa chọn đƣợc loại dung mơi thích hợp Các hợp chất đƣợc chiết dung mơi có độ phân cực tăng dần chiết lần lấy tất loại hợp chất dung môi methanol ethanol dung mơi có khả xun thấm qua màng tế bào thực vật, nhƣ tạo nối hydrogen liên phân tử với nhóm phân cực khác, đƣợc xem dung mơi vạn năng, chiết tách đƣợc hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa yếu Tuy nhiên quy mơ lớn, MeOH đƣợc ứng dụng nhiều độc hại EtOH dung môi thông dụng rẻ tiền độc hại nên thƣờng đƣợc sử dụng Trong nghiên cứu để trình thực trở nên đơn giản, tiết kiệm thời gian, dung môi nhƣ giá thành dung môi, dƣợc liệu đƣợc chiết kiệt dung môi ethanol theo phƣơng pháp chiết ngấm kiệt thu cao toàn phần * Hiệu suất chiết cao Các nồng độ ethanol đƣợc lựa chọn khảo sát là: 45%, 70%, 96% Các thí nghiêm đƣợc tiến hành nhiệt độ 30 oC với thời giánh đánh sóng siêu âm 30 phút Kết hiệu suất chiết cao đƣợc thể Bảng 3.4 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hiệu suất chiết cao Dung môi Khối lƣợng dƣợc liệu chiết (g) Khối lƣợng cao chiết (g) Hiệu suất chiết cao (%) Ethanol 45% 0,424 8,63± 0,0151c Ethanol 70% 1,092 22,23±0,0375a Ethanol 96% 0,586 11,94±0,0223b Kết từ bảng 3.1 cho thấy, điều kiện chiết (đánh sóng siêu âm 30 phút, nhiệt độ chiết 30 oC) nồng độ dung môi (Ethanol) có ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết cao Hiệu suất chiết đạt cao nồng độ Ethanol 70% (22,23%) thấp Ethanol 45% (11,94%) * Hàm lƣợng Flavonoid tổng số 14 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hàm lƣợng Flavonoid tổng số Dung môi Hàm lƣợng Flavonoid (mg QE/g bột dƣợc liệu) Ethanol 45% 0,71431±0,1052c Ethanol 70% 4,0545±0,1468a Ethanol 96% 1,642±0,1437b Từ kết bảng 3.2 cho thấy, điều kiện, chiết nồng độ ethanol khác cho hàm lƣợng flavonoid toàn phần khác Cụ thể, hàm lƣợng flavonoid toàn phần bắt đầu tăng lên chiết nồng độ từ 45% đến 70% hàm lƣợng flavonoid toàn phần đạt cao nồng độ ethanol 70% với giá trị thu đƣợc tƣơng ứng 4,0545 (mg QE/g bột dƣợc liệu) ±0,1468 Tiếp tục tăng nồng độ ethanol lên 96% hàm lƣợng flavonoid tồn phần khơng tăng mà có xu hƣớng giảm xuống Điều mức độ phân cực dung môi phụ thuộc vào số điện môi, giá trị liên kết hydro, nƣớc có số điện mơi, giá trị liên kết hydro cao ethanol Do đó, trộn lẫn ethanol nƣớc cho hỗn hợp ethanol nƣớc có mức độ phân cực khác nhau, nồng độ dung mơi có độ phân cực tƣơng đƣơng với hợp chất đƣợc trích ly hịa tan chất tốt Do vậy, nồng độ ethanol 70% thích hợp để thực trình tách chiết flavonoid tồn phần từ Khơi nhung Tƣơng tự, nghiên cứu Đặng Thanh Long cộng (2020) khảo sát ảnh hƣởng nồng độ ethanol khác (40%, 70%, 90%) đến hàm lƣợng flavonoid hạt sen phƣơng pháp đánh sóng siệu âm Kết cho thấy chiết siêu âm dung môi ethanol 70% cho hàm lƣợng flavonoid đạt cao (0,743 mg Catechin/g chiết xuất ± 0,007) (Đặng Thanh Long cs, 2020) * Hàm Lƣợng Tanin tổng số Tanin thuộc nhóm Polyphenol vốn có gốc hydrocarbon kỵ nƣớc, tan tốt dung môi hữu cơ, nhiên lại có nhóm chức polyphenol phân cực tan tốt dung mơi phân cực Do đó, chiết tanin phải dùng hệ dung môi gồm: dung môi hữu chất phân cực (thƣờng nƣớc) Trong nghiên cứu này, dung môi gồm: ethanol 45%, 70%, 96% đƣợc lựa chọn khả sát khả để trích ly tanin Khôi nhung Kết khảo sát đƣợc thể Bảng 3.3 15 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hàm lƣợng Tanin tổng số Hàm lƣợng polyphenol tổng Hàm lƣợng Polyphenol không liên kết casein Hàm lƣợng Tanin tổng số (mg GAE/g (mg GAE/g bột dƣợc liệu) (mg GAE/g bột dƣợc liệu) bột dƣợc liệu) Dung môi Ethanol 45% 3,8956±0,1536 2,5296±0,1165 1,280c Ethanol 70% 10,7258±0,2098 6,9401+0,1296 3,7855a Ethanol 96% 5,4697±0,1973 2,9403±0,1782 2,5293b Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến khả trích ly Tanin có khác biệt có ý nghĩa nồng độ Khi nồng độ ethanol tăng từ 45% đến 70% lƣợng Tanin thu đƣợc tăng từ 1,280 mg GAE/g bột dƣợc liệu đến 3,7855 mg GAE/g bột dƣợc liệu Tuy nhiên, tiếp tục tăng nòng độ ethanol lên 95% lƣợng tanin thu đƣợc giảm dần Kết khảo sát phù hợp với số nghiên cứu trƣớc Theo tác giả Rostango cộng (2004), thêm lƣợng nƣớc định từ 30–40% vào dung mơi cải thiện đƣợc hiệu trích ly polyphenol ngun liệu thực vật có nhiều loại polyphenol, hợp chất chứa nhiều nhóm hydroxyl gốc đƣờng phân tử ƣa nƣớc nên chúng tan tốt nƣớc dung môi hữu nguyên chất, tanin hợp chất (Rostagno cs, 2004) * Hàm lƣợng Saponin tổng số Các nồng độ dung môi ethanol đƣợc khảo sát 45%, 70%, 96% Các thí nghiệm đƣợc tiến hành với thời gian siêu âm cố định 30 phút nhiệt độ cố định 30oC Kết khảo sát ảnh hƣởng nồng độ dung mơi đến khả trích ly saponin đƣợc thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng dung môi chiết đến hàm lƣợng hàm lƣợng Saponin tổng số tổng số Dung môi Hàm lƣợng Saponin tổng số (mg/g bột dƣợc liệu) Ethanol 45% 0,8427±0,1702c Ethanol 70% 3,1822±0,1398a Ethanol 96% 1,1954±0,1653b Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ dung mơi ethanol có ảnh hƣởng đến khả trích ly saponin tổng số Khôi nhung Cụ thể, tăng nồng độ dung môi từ 16 45% lên 70% hàm lƣợng saponin có xu hƣớng tăng mạnh từ 0,8427 mg/g bột dƣợc liệu lên 3,1822 mg/g bột dƣợc liệu Tuy nhiên, tăng nồng độ dung môi lên 96% hàm lƣợng saponin tổng số có xu hƣớng giảm mạnh Từ kết ta thấy Ethanol 70% dung mơi thích hợp để lựa chọn chiết mặt kinh tế, khả thu hồi, tái sử dụng hiệu suất chiết Dung môi đƣợc dùng cho khảo sát 3.2.Khảo sát ảnh hƣởng thời gian chiết đến hiệu suất chiết cao hàm lƣợng hợp chất phƣơng pháp đánh sóng siêu âm Ngồi dung mơi trích ly, thời gian siêu âm ảnh hƣởng lớn đến khả trích ly hợp chất Trên lý thuyết, thời gian siêu âm dài, biến đổi nguyên liệu sâu sắc Kéo dài thời gian xử lý siêu âm đồng nghĩa với việc gia tăng thời gian tác động sóng siêu âm lên ngun liệu đem trích ly Việc kéo dài thời gian làm gia tăng tác động nén dãn lên tế bào chất chiết làm cho biến đổi nguyên liệu diễn mạnh mẽ Các tế bào bị phá vỡ với tỷ lệ cao mà thời gian xử lý siêu âm kéo dài, hiệu suất trích ly tăng (Xiang cs, 2010) Tuy nhiên, thời gian xử lý dài làm biến đổi thành phần chất chiết, làm giảm hàm lƣợng hợp chất tổng thu đƣợc Trên sở xác định dung môi chiết xuất dung môi ethanol 70%, để xác định thời gian chiết xuất thích hợp, mốc thời gian khác đƣợc tiến hành khảo sát * Hiệu suất chiết cao Kết từ bảng 3.5 cho thấy thời gian đánh sóng siêu âm có ảnh hƣởng lớn đến hiệu suất chiết cao từ Khôi nhung Thời gian 30 phút đƣợc xác định mốc thời gian tốt để đánh sóng siêu âm với hiệu suất chiết cao đạt cao 22,95% Bảng 3.5 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hiệu suất chiết cao Thời gian Khối lƣợng Hiệu suất (phút) cao chiết (g) chiết cao (%) 10 0,634d 12,93d 20 0,81c 16,52c 30 1,125a 22,95a 40 1,099b 22,42b * Hàm lƣợng Flavonoid tổng Lá Khôi nhung đƣợc chiết siêu âm với ethanol 70%, nhiệt độ 30°C Tiến hành thí nghiệm khác với mốc thời gian khác để xác định mốc thời gian chiết 17 thích hợp cho chiết flavonoid tổng số cao Kết khảo sát đƣợc thể bảng 3.6 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hàm lƣợng flavonoid Thời gian (phút) Hàm lƣợng Flavonoid (mg QE/g bột dƣợc liệu) 10 1,2813±0,2031d 20 2,7808±0,1862c 30 4,6492±0,1502a 40 3,2048±0,1129b Kết nghiên cứu cho thấy, thời gian ảnh hƣởng đến khả trích ly flavonoid tổng số Khôi nhung Cụ thể, tăng thời gian trích ly từ 10 phút lên 30 phút hàm lƣợng flavonoid có xu hƣớng tăng lên, tăng từ 1,2813 mg QE/g bột dƣợc liệu lên 4,6492 mg QE/g bột dƣợc liệu Tuy nhiên tăng thời gian lên 40 phút hàm lƣợng flavonoid giảm 3,2048 mg QE/g bột dƣợc liệu Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Nguyễn Thùy Linh cộng năm 2022 chiết xuất flavoniid băng phƣơng pháp đánh sóng siêu âm * Hàm lƣợng Tanin tổng số Sử dụng ethanol 70% làm dung môi chiết xuất, chiết siêu âm 30°C, tiến hành khảo sát mức thời gian chiết xuất khác Kết khảo sát đƣợc thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hàm lƣợng Tanin Thời gian (phút) Hàm lƣợng Hàm lƣợng Polyphenol polyphenol tổng không liên kết casein (mg GAE/g bột dƣợc (mg GAE/g bột dƣợc liệu) liệu) Hàm lƣợng Tanin tổng số (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 10 5,8088±0,1497 2,8724±0,1572 2,9364d 20 7,9865±0,1204 4,6204±0,1159 3,3660c 30 12,1923±0,1963 5,8745±0,1701 6,3177a 40 11,3998±0,2145 5,7647±0,1875 5,6350b Khi tăng thời gian siêu âm từ 10 phút lên 30 phút hàm lƣợng Tanin có xu hƣớng tăng lên giảm đân tăng thời gian chiết lên 40 phút Lúc đầu hàm lƣợng polyphenol khôi nhung lớn nên chênh lệch nồng độ bên bên tế bào 18 cao, mà hàm lƣợng tanin dịch trích ly tăng mạnh (10-30 phút) Tuy nhiên, theo thời gian hàm lƣợng polyphenol bên bên gần đạt đến trạng thái cân làm cho hàm lƣợng polyphenol thu đƣợc tăng chậm dần (30-40 phút) theo định luật Fick (Pinolo cộng sự, 2006) Kết tƣơng tự với kết nghiên cứu La Thị Hiền cộng năm 2017 Kết cho thấy tăng thời gian từ 10-30 phút trích ly hàm lƣợng tanin có xu hƣớng tăng lên sau giảm dần tăng thời gian từ 40-70 phút (La Thị Hiền cs, 2017) * Hàm lƣợng Saponin tổng số Kết khảo sát ảnh hƣởng thời gian trích ly đến hàm lƣợng flavonoid tổng số đƣợc thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng thời gian chiết siêu âm đến hàm lƣợng saponin Thời gian (phút) Hàm lƣợng Saponin tổng số (mg RG/ g bột dƣợc liệu) 10 0,9914±0,1460d 20 2,5844±0,1979c 30 3,8749±0,1508a 40 2,7952±0,1939b Từ kết Bảng 3.8 cho thấy, thời gian trích ly siêu âm có ảnh hƣởng lớn đến q trình trích ly saponin tổng số từ Khơi nhung Hàm lƣợng Saponin trích ly tăng mạnh tăng thời gian trích ly từ 10 phút lên 30 phút đạt giá trị lớn 3,8749±0,1508 Kết nghiên cứu Xiang cộng (2010) nghiên cứu trích ly saponin từ trà cho kết tƣơng tự Thời gian siêu âm thay đổi từ phút đến 30 phút hàm lƣợng saponin tăng, nhiên hàm lƣợng saponin giảm thời gian siêu âm tiếp tục tăng đến mức nghiệm thức 35, 40 45 phút (Xiang cs, 2010) Kết tƣơng tự nghiên cứu Sun cộng (2021) nghiên cứu chiết saponin từ táo tàu (Zizyphus jujuba Mil var spinosa) với hỗ trợ siêu âm Kết nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng saponin tăng tăng thời gian chiết đạt giá trị cao 50 phút, nhiên tiếp tục tăng lên 60 70 phút hàm lƣợng saponin có xu hƣớng giảm (Sun cs, 2021) 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết cao hàm lƣợng hợp chất phƣơng pháp đánh sóng siêu âm Với hầu hết hợp chất hữu cơ, tăng nhiệt độ ủ đóng vai trị quan trọng giúp tăng độ hòa tan hệ số khuyếch tán chất (Mokrani & Madani, 2016; Spigno et al., 2007) Trong phần lớn trƣờng hợp tách chiết dƣợc chất, để tránh biến tính hoạt 19 chất, nhiệt độ tách chiết đƣợc giới hạn khoảng nhiệt độ thấp 60 oC (Dong, 2008) Chính thế, chúng tơi thực thí nghiệm khảo sát hiệu tách chiết khoảng nhiệt độ từ 30-60 oC * Hiệu suất chiết cao Sử dụng ethanol 70% làm dung môi chiết xuất, chiết siêu âm 30 phút, tiến hành khảo sát mức nhiệt độ chiết xuất khác Kết trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hiệu suất chiết cao Nhiệt độ (oC) Khối lƣợng cao chiết Hiệu suất chiết cao (%) 30 1,109 22,62c 40 1,175 23,97b 50 1,318 26,88a 60 0,88 17,95d Kết nghiên cứu cho thấy, tƣơng tác sóng siêu âm nhiệt độ có ảnh hƣởng đến hiệu suất chiết cao Khơi nhung Có thể thấy nhiệt độ 50 oC cho hiệu suất chiết cao tốt so với nhiệt độ lại với hiệu suất cao chiết đạt 26,88% * Hàm lƣợng Flavonoid Với thời gian chiết 30 phút, dung môi chiết ethanol 70%, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ siêu âm đến trình tách chiết flavonoid tổng số có Khơi nhung, kết trình khảo sát đƣợc trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hàm lƣợng flavonoid Nhiệt độ (oC) Hàm lƣợng Flavonoid (mg QE/g bột dƣợc liệu) 30 3,7155±0,1382c 40 4,5437±0,1626b 50 5,2336±0,1111a 60 1,9271±0,1603d Khi tăng nhiệt độ từ 30 - 50° C, hàm lƣợng flavonoid tăng lên đáng kể Tuy nhiên, tiếp tục tăng nhiệt độ lên, 60° C hàm lƣợng flavonoid có xu hƣớng giảm Điều lý giải tăng nhiệt độ, khả khuếch tán chất tế bào môi trƣờng chiết tốt nhƣng nhiệt độ tăng cao, không độ tan chất tăng mà độ tan tạp chất tăng theo, dịch chiết lẫn nhiều tạp gây cản trở cho q trình tách chiết nên hàm lƣợng flavonoid tồn phần giảm xuống Tƣợng tự, 20 nghiên cứu Nguyễn Khánh Thuỳ Linh cộng năm 2022 cho thấy tăng nhiệt độ siêu âm từ 30-40 oC hàm lƣơng flavonoid có xu hƣớng tăng lên nhƣng sau giảm xuống nhiệt độ tiếp tực tăng từ 50-60oC * Hàm lƣợng Tanin tổng số Với thời gian chiết 30 phút, dung môi chiết ethanol 70%, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ siêu âm đến trình tách chiết Tanin tổng số có Khơi nhung, kết q trình khảo sát đƣợc trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hàm lƣợng Tanin Nhiệt độ (oC) Hàm lƣợng polyphenol Hàm lƣợng Polyphenol Hàm lƣợng Tanin tổng (mg GAE/g bột không liên kết casein (mg tổng số (mg GAE/g dƣợc liệu) GAE/g bột dƣợc liệu) bột dƣợc liệu) 30 10,1608±0,1599 5,2217±0,1184 4,9390c 40 11,5854±0,1429 5,8446±0,1575 5,7408b 50 14,2839±0,1828 6,7528±0,1665 7,5311a 60 9,1281±0,1889 5,1018±0,1578 4,0263d Từ bảng cho thấy hàm lƣợng saponin tăng dần tăng nhiệt độ từ 30-50°C Kết giải thích nhƣ sau, nhiệt độ tăng cao tăng cƣờng phân hủy thành phần tế bào thực vật, làm tăng khả thẩm thấu qua màng tế bào, từ giúp giải phóng polyphenol mẫu (Wang cs, 1998) Ngoài ra, nhiệt độ tăng cao, làm tăng độ hòa tan, tốc độ truyền khối nhƣ giảm độ nhớt sức bề mặt dung mơi góp phần làm cho tỉ lệ khai thác hợp chất polyphenol cao (Brglez cs, 2012) Tuy nhiên, nhiệt độ cao khơng phải lúc thích hợp để chiết xuất hợp chất poly-phenol, làm biến tính hợp chất nhạy cảm với nhiệt (Jing, Dong cs, 2015) Đây nguyên nhân dẫn đến hàm lƣợng tanin giảm nhiệt độ bắt đầu tăng từ 50oC lên 90°C Do đó, nhiệt độ 50°C đƣợc chọn nhiệt độ trích ly Tanin tổng số thích hợp * Hàm lƣợng Saponin tổng số Với thời gian chiết 30 phút, dung môi chiết ethanol 70%, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ siêu âm đến q trình tách chiết saponin tổng số có Khơi nhung, kết q trình khảo sát đƣợc trình bày bảng 3.12 21 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ chiết siêu âm đến hàm lƣợng saponin Nhiệt độ (oC) Hàm lƣợng Saponin tổng số (mg RG/ g bột dƣợc liệu) 30 3,7981±0,1453a 40 2,9580±0,1682b 50 2,8165±0,1162c 60 1,8362±0,2072d Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ ảnh hƣởng đáng kể đến trích ly saponin tổng số từ khôi nhung Khác với hàm lƣợng flavonoid tanin, tăng nhiệt độ siêu âm từ 30 – 60oC hàm lƣợng Saponin có xu hƣớng giảm dần, giảm từ 3,7981 mg/g bột dƣợc liệu mức 30oC xuống 1,8362 mg/g bột dƣợc liệu nhiệt độ 60oC 22 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: Qua kết khảo sát ảnh hƣởng yếu tố siêu âm đến hàm lƣợng chất cho thấy: - Dung môi phù hợp để trích ly hợp chất favonoid, Tanin saponin ethanol 70% Hàm lƣợng flavonoid, tanin, saponin chiết đƣợc lần lƣợt 4,0545±0,1468 (mg QE/g bột dƣợc liệu); 3,7855 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 3,1822±0,1398 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) - Thời gian phù hợp để trích ly hợp chất favonoid, Tanin saponin 30 phút Hàm lƣợng flavonoid, tanin, saponin chiết đƣợc lần lƣợt 4,6492±0,1502 (mg QE/g bột dƣợc liệu); 6,3177 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 3,8749±0,1508 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) - Nhiệt độ phù hợp để trích ly hợp chất favonoid, Tanin 50°C với hàm lƣợng lần lƣợt 5,2336±0,1111 (mg QE/g bột dƣợc liệu); 7,5311 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) saponin 30°C với hàm lƣợng 3,7981±0,1453 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) Hàm lƣợng flavonoid, tanin, saponin trích ly đạt giá trị lớn lần lƣợt là: 5,2336 (mg QE/g bột dƣợc liệu), 7,5311 (mg GAE/g bột dƣợc liệu) 3,8749 (mg RG/ g bột dƣợc liệu) 4.2 Kiến nghị: - Tối ƣu hóa quy trình trích ly hợp chất có hoạt tính sinh học từ khôi nhung Thử nghiệm khả ức chế vi khuẩn Helicobacter Pylori 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO Do, T L (2004) Vietnamese medicinal plants and herbs Ha Noi, Vietnam: Medical Publishing House Kobayashi, H., & de Mejia, E (2005) The genus Ardisia: a novel source of health-promoting compounds and phytopharmaceuticals Journal of Ethnopharmacol 96(3), 347-354 Nguyen, T P (1999) Handbook for searching and identifying families of angiosperms in Vietnam Ha Noi,Vietnam: Agricultural Publishing House Tran, L T K (2002) Study on chemical composition and biological activity of some Ardisia species of Myrsinaceae family in Vietnam (Unpublished Doctoral dissertation) Vietnam Academy of Science andTechnology, Ha Noi, Vietnam Ezeonu and Ejikeme (2016) “ Qualitative and Quantitative Determination of Phytochemical Contents of Indigenous Nigerian Softwoods” Bui Thi Xuan, Tran Minh Ngoc et al (2018) “Flavonoids and the Subchronic Toxicity, Antipeptic Ulcer, and Analgesic Effects of the Ethyl Acetate Soluble Fraction of the Ethanol Extract from Sanchezia nobilis Hook f Leaves” Chang, C., Yang, M., Wen, H., & Chem, J (2002) Estimation of flavonoid total content in propolis by two complementary colorimetric methods Journal of Food and Drug Analysis 10, 178-182 Rostagno M.A., Palma M., Barroso C.G - Pressurized liquid extraction of isoflavones from soybeans, Analytica Chimica Acta 522 (2) (2004) 169–177 Fang, Li et al (2007) “Effects of grape variety, harvest date, fermentation vessel and wine ageing on flavonoid concentration in red wines” Food Research International, Volume 41, Issue 1, 2008, Pages 53-60 Xiang L., Jian-zhong M., Jing X & Yun-dong S - A study on the extraction and purification technology of tea sapogenin, African Journal of Biotechnology (18) (2010) 2691-2696 10 Ji J B., Lu X H., Cai M Q & Xu X C - Improvement of leaching process of Geniposide with ultrasound, Ultrasonics Sonochemistry 13 (5) (2006) 455-462 11 Sun Y., Zhang Y., Qi W., Xie J & Cui X - Saponins extracted by ultrasound from Zizyphus jujuba Mil var spinosa leaves exert resistance to oxidative damage in Caenorhabditis elegans, Journal of Food Measurement and Characterization 15 (1) 24 (2021) 541-554 12 Wang, M., Li, J., Rangarajan, M.,Shao,Y.,LaVoie,E.J and Huang,T.C.and Ho,C.T (1998) Antioxidative phenolic compounds from sage(Salviaof cinalis) JournalofAgricultural DQG) RRG & KHPLVWU\, 46, pp 4869-4873 13 Jing,C.L., Dong,X.F andTong,J.M (2015).Op-timization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoid compounds and antioxidants from Alfalfa using response surface method 20, pp 15550-15571 Việt Nam Lƣu Tuấn Anh (2013) “Nghiên cứu thành phần hóa học lồi Ardisia balansanathuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae) Việt Nam” Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Ngô Văn Thu (2011) “Bài giảng dƣợc liệu” Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội tập Ngô Văn Thu, Trần Hùng (2011) “Dƣợc liệu học tập I” NXB Y học Hà Nội, 262-270 Đỗ Tất Lợi (2004) “Những thuốc vị thuốc Việt Nam” Nhà xuất Y học Huỳnh Văn Biết, Nguyễn Thị Ngọc Phƣơng et al (2020) “Phân tích thành phần hóa thực vật xác định khả chống oxy hóa kháng khuẩn dịch chiết từ khơi nhung Tạp Chí Nơng nghiệp Và Phát triển 19(4), 28-35 Bùi Thị Luyến et al (2019) “ Định lƣợng saponin toàn phần dƣợc liệu giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum) thu hái thái nguyên phƣơng pháp đo quang” La Thị Hiền, Trần Thị Minh Nhung , Nguyễn Thùy Trang & Đỗ Mai Nguyên Phƣơng (2017) Ảnh hƣởng trình trích ly đến hàm lƣợng polyphenol khả chống oxy hóa từ đắng (Vernonia amygdalina) Tạp chí Khoa học Đại học Văn Hiến, 5(4), 93-99 Nguyễn Khánh Thuỳ Linh, Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2022) xây dựng phƣơng pháp định lƣợng flavonoid toàn phần dịch chiết vối (cleistocalyx operculatus) quang phổ uv-vis Phạm Thị Vân Anh, Vũ Văn Điền, Nguyễn Trần Giáng Hƣơng, Nguyễn Thanh Phƣơng (2000) “Một số kết bƣớc đầu nghiên cứu hoá học tác dụng sinh học khơi” Tạp chí thơng tin Y dƣợc số 6: 25-28 25 10 Nguyễn Trọng Thông, Đỗ Thị Phƣơng (2012) “Nghiên cứu tác dụng kháng HP chống loét tá tràng HPmax” 11 Vũ Thị Diệp, Đỗ Thị Hà , Nguyễn Thị Thảo “Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính chống oxy hóa gây độc tế bào ung thƣ dịch chiết khôi tía” 12 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) “Phƣơng pháp lập hợp chất hữu cơ” NXB ĐHQG TPHCM: 228-244 13 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) “Phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu cơ” NXB ĐHQG TPHCM: 28-33 26 PHỤ LỤC Xây dựng đƣờng chuẩn flavonoid, tanin va saponin 1.1 Đƣờng chuẩn flavonoid Bảng 2.1 Mật độ quang chất chuẩn Quercetin nồng độ khác Nồng độ mg/l 10 15 25 50 100 Abs 0,0236 0,0524 0,1522 0,2892 0,428 0,5115 OD Linear (OD) Linear (OD) 0.6 y = 0.0053x + 0.0099 R² = 0.9911 0.5 AXIS TITLE 0.4 0.3 0.2 0.1 0 20 40 60 80 100 120 AXIS TITLE Hình 2.2 Đƣờng chuẩn Quercetin 1.2 Đƣờng chuẩn Tanin Bảng 2.2 Mật độ quang chất chuẩn acid gallic nồng độ khác Nồng độ mg/l 10 20 40 60 80 100 Abs 0,0374 0,0704 0,1349 0,1923 0,2445 0,2879 27 OD 0.35 y = 0.0028x + 0.0161 R² = 0.9949 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 20 40 60 80 100 120 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn acid galic 1.3 Đƣờng chuẩn saponin Bảng 2.3 Mật độ quang chất chuẩn Ginsenoside Rb1 nồng độ khác Nồng độ mg/l 10 20 40 60 80 100 Abs 0,3223 0,6846 1,3887 1,9831 2,67744 3,0092 OD 3.5 y = 0.0307x + 0.0935 R² = 0.9907 2.5 1.5 0.5 0 20 40 60 80 Hình 2.4 Đƣờng chuẩn Ginsenoside Rb1 28 100 120