Đánh giá đa dạng di truyền giữa các quần thể cây mẹ cọc rào (jatropha curcas) bằng kỹ thuật chỉ thị phân tử rapd là cơ sở cho quá trình chọn giống

ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuel) phát triển từ lâu giới xu hƣớng sản xuất nhiên liệu thay tƣơng lai Đến nay, quy mô nhỏ nhƣng Việt Nam bƣớc đầu thử nghiệm thành công chiết xuất dầu diesel từ hạt Cọc rào (Jatropha curcas) với tỷ lệ dầu đạt 32-37% dầu Tuy nhiên, nƣớc ta Cọc rào chủ yếu đƣợc trồng phân tán khơng mục đích khai thác Trong đó, nhu cầu nguồn nguyên liệu lại cao không nƣớc mà giới, nên cần phải trồng Cọc rào tập trung quy mô lớn Trong chƣa có biện pháp gây trồng thích hợp nhằm tiến tới trồng kinh doanh quy mô lớn Dù đƣợc vào nghiên cứu, khai thác sử dụng Việt Nam nhƣng thấy Cọc rào có giá trị sử dụng cao đặc biệt tiềm khai thác dầu Diesel sinh học Đây thay nguồn nguyên liệu truyền thống gây ô nhiễm môi trƣờng ngày cạn kiệt Bên cạnh Cọc rào lồi phù hợp có ý nghĩa việc cải tạo mơi trƣờng đặc biệt vùng đất đai khô hạn, hoang hóa khả sinh trƣởng tốt điều kiện bất lợi Tuy nhiên thiếu nghiên cứu tuyển chọn, gây trồng, phát triển, quản lý sử dụng bền vững loài đa mục đích Các đánh giá ban đầu nhƣ tảng di truyền, mức độ đa dạng di truyền, mối quan hệ di truyền… Cọc rào chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ Do đó, với giá trị mà Cọc rào đem lại tƣơng lai việc nghiên cứu, đánh giá tính đa dạng di truyền xuất xứ khác đƣợc trồng Việt nam kỹ thuật RADP sở cần thiết cho công tác tuyển chọn giống có suất chất lƣợng cao trồng quy mô công nghiệp Ngày nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền loài sinh vật cấp độ phân tử Các phƣơng pháp dựa kỹ thuật nhƣ: thị phân tử RFLP dựa kỹ thuật lai DNA; thị phân tử RAPD, SSR, AFLP, STS dựa kỹ thuật PCR Đối với Cọc rào Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu sâu cấp độ phân tử lồi nên chƣa có mồi đặc hiệu, thị RAPD (Đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên – Random Amplified Polymorphism DNA) đƣợc xem lựa chọn hợp lý phân tích đa dạng di truyền kỹ thuật cho kết nhanh, dễ làm, tốn đặc biệt mồi sử dụng mồi ngẫu nhiên Xuất phát từ sở trên, khn khổ khóa luận này, thực đề tài “Đánh giá đa dạng di truyền quần thể mẹ Cọc rào (Jatropha curcas) kỹ thuật thị phân tử RAPD làm sở cho trình chọn giống” CHƢƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nghiên cứu Cọc rào Thế giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới Trong bối cảnh khủng hoảng lƣợng, vấn đề ô nhiễm môi trƣờng toàn cầu ngày gia tăng, nhiều nỗ lực tập trung nghiên cứu nhằm tìm lƣợng mới, tái tạo, bền vững hơn, để dần thay nguồn lƣợng hóa thạch ngày bị cạn kiệt, dầu diesel sinh học phƣơng án thực đầy tiềm Những năm gần đây, nhiều nƣớc đƣa chiến lƣợc quốc gia phát triển sử dụng nhiên liệu sinh học, đề cập chi tiết lộ trình sử dụng Etanol sinh học với tỷ lệ trộn khác (E5, E10, E20, E30…) Diesel sinh học với tỷ lệ trộn B5, B10, B20, B30 khác Trên giới, nghiên cứu Cọc rào đầy đủ Đây liệu quan trọng cho việc áp dụng vào điều kiện cụ thể Việt Nam Các nghiên cứu giá trị Cọc rào việc cung cấp nguyên liệu cho công nghệ sản xuất biofuel đƣợc thực nƣớc nhƣ USA, Austria, India, Nicaragua Nghiên cứu ứng dụng dƣợc liệu Cọc rào nhƣ thành phần thức ăn kiêng, đặc tính chống virus, chữa mụn cơm, làm liền sẹo, hoạt tính chống nấm, chống virus, chống HIV Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt Cọc rào Jatropha curcas nhƣ hoạt tính esterase lipase, lectin ; tính chất tẩy; hoạt chất enzym, đồng thời có nhiều cơng trình nghiên cứu độc tính, thành phần chất tinh dầu Cọc rào Nghiên cứu khả kháng Cọc rào với đối tƣợng gây bệnh nhƣ ốc sên, ấu trùng sán máng Các kỹ thuật nhân giống gây trồng Cọc rào nhƣ ni cấy mơ, phát sinh hình thái tái sinh nuôi cấy in vitro, nhân hom, gieo hạt, mật độ trồng Theo Norman Jones Ioan H.Miller (1999) kỹ thuật gây trồng Cọc rào đƣợc nghiên cứu đầy đủ, đặc biệt Ấn Độ Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào kỹ thuật gây trồng, sản xuất giống thu hái hạt Hiện nay, Cọc rào đƣợc gây trồng dƣới hình thức phổ biến trồng phân tán trồng rừng tập trung diện rộng Mơ hình trồng rừng tập trung chủ yếu phát triển nƣớc Châu Phi (Cape Verde, Ivory Coast, Madagascar) Châu Mỹ (Brazil) Ngoài ra, Ấn Độ nƣớc phát triển mạnh Cọc rào với diện tích trồng ƣớc chừng khoảng triệu 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Tại Việt Nam, theo Quyết định số 177/2007/QĐ/TTg Thủ tƣớng phủ phê duyệt Chƣơng trình nhiên liệu sinh học quốc gia với tầm nhìn tới năm 2025, đặt mục tiêu tới năm 2010: đáp ứng đƣợc 8% nhu cầu sử dụng xăng dầu E5 & B5 (100 nghìn E5 & 50 nghìn B5), đến năm 2015, đáp ứng đƣợc 20% nhu cầu E5 & B5 tới năm 2025 đáp ứng đƣợc 100% nhu cầu sử dụng xăng dầu E5 & B5 toàn lãnh thổ Việt Nam Ngày 19/6/2008, Bộ trƣởng Bộ NN & PTNT ký Quyết định số 1842/QĐ-BNN-LN phê duyệt Đề án Quốc gia theo yêu cầu Thủ tƣớng phủ “Nghiên cứu, phát triển sử dụng sản phẩm Jatropha (Jatropha curcas L.) Việt Nam giai đoạn 2008-2015 tầm nhìn đến 2025” Hiện nay, Cọc rào đƣợc trồng phân tán, chủ yếu để làm rào dậu Trong chƣơng trình nghiên cứu TS Lê Võ Định Tƣờng (Phân viện Hóa học hợp chất thiên nhiên TP.HCM) tiến hành trồng thử nghiệm nhân hom Cọc rào giống cho suất cao vùng đất thối hóa Lê Hồng Phong, huyện Bắc Bình xã Vĩnh Hảo, huyện Tuy Phong (tỉnh Bình Thuận) Kết cho thấy lớn nhanh sau năm cho Các đơn vị nhƣ UBND tỉnh Thanh Hóa, Sở Nơng nghiệp phát triển nông thôn Lai Châu, Sở Khoa học- Cơng nghệ Sơn La có kế hoạch cho việc trồng thử nghiệm trồng Cọc rào vùng đất hoang hóa tỉnh UBND huyện Đăk Hà, ngày 2- 6- 2006 định đƣa vào trồng thử nghiệm 5ha Cọc rào vùng đất hoang hóa Đề án trồng thử nghiệm đƣợc triển khai dƣới bảo trợ mặt khoa học Viện Sinh học nhiệt đới Nhìn chung, Cọc rào đối tƣợng đƣợc quan tâm gần xuất phát chủ yếu từ mục đích chiết xuất dầu diesel chế biến thuốc nên thông tin gây trồng, hƣớng dẫn kỹ thuật cịn hạn chế Đồng thời, có nghiên cứu sâu cấp độ phân tử loài Đây trở ngại lớn cho cơng tác tuyển chọn giống Cọc rào có phẩm chất tốt, ổn định trƣớc trồng khai thác quy mơ cơng nghiệp 1.1.3 Các đặc điểm Cọc rào Cây Cọc rào (Jatropha curcas) (sau gọi Jatropha), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), có nguồn gốc châu Mỹ nhƣng du nhập vào Việt Nam cách khoảng 600 năm Sản phẩm quan trọng Jatropha dầu từ hạt phù hợp cho sản xuất diesel sinh học Cọc rào bụi lớn, có chu kỳ sống lâu tới 30-40 năm, thƣờng xanh, cho quả, hạt sớm, hàng năm, suất 7-8 tấn/ha, hàm lƣợng dầu hạt tới 32- 60%; tƣơng đƣơng sản lƣợng 2000-2500 lít dầu/ha/năm, dầu không ăn đƣợc nên không ảnh hƣởng đến an ninh lƣơng thực Jatropha loài thân thiện với môi trƣờng chu kỳ sống dài (3050 năm), cộng sinh với nấm rễ mycorrhiza, nên thích nghi sinh trƣởng tốt lập địa cằn cỗi vùng nhiễm bãi thải, có tác dụng cải tạo đất, làm môi trƣờng Mặt khác, loài thƣờng xanh, cần thu hái hàng năm, đốn hạ cây, tạo thảm thực vật che phủ ổn định, có tác dụng phòng hộ, khả hấp thụ CO2 cao, tiềm cho dự án CDM Đồng thời hàm lƣợng Nitơ cao nên đƣợc làm nguồn dinh dƣỡng cho trồng Cọc rào cịn lồi có ý nghĩa to lớn cải thiện đời sống cộng đồng vùng nơng thơn khó khăn, đất đai cằn cỗi Trồng Cọc rào Jatropha mang lại thu nhập cho ngƣời dân từ 15-18 triệu đồng/năm Có thể đa dạng hóa sản phẩm, tăng giá trị kinh tế từ sản phẩm phụ nhƣ bã ép hạt phân bón hữu cơ, hoạt chất hạt làm thuốc trừ sâu sinh học Tuy nhiên, nhiều khó khăn đối mặt cần phải đƣợc giải để Jatropha trở nên có hiệu thực Jatropha từ “cây dại”, chƣa phải trồng mùa vụ, chƣa có nguồn giống thức, chƣa đƣợc kiểm sốt, nên có nhiều nguồn hạt jatropha chất lƣợng thấp lƣu hành, gây rủi ro cao cho dự án gây trồng jatropha, nguyên nhân dẫn đến suất hạt hàm lƣợng dầu béo chƣa ổn định gây biến dị lớn thụ phấn chéo Bên cạnh đó, nhìn chung cịn thiếu biện pháp kỹ thuật gây trồng hiệu quả, phù hợp Mặc dù Cọc rào sinh trƣởng tốt đất khơ cằn, nhƣng để có hiệu kinh tế cần phải đầu tƣ Qua nghiên cứu thực nghiệm trồng chăm sóc Cọc rào nhận thấy lồi có nhiều ƣu Năng suất dầu thu đƣợc 1ha lớn có khả tạo hạt có hàm lƣợng dầu cao, bắt đầu cho sản lƣợng hạt cao từ năm thứ trở Cọc rào cho suất 0,4 hạt/ha năm đầu, tăng lên hạt/ha sau năm Hạt Cọc rào dễ thu hái thu hái sau mùa mƣa đặc điểm thấp Cho tới nay, Việt Nam tiến hành chiết suất thử nghiệm kết cho thấy chiết suất dầu diesel từ hạt Cọc rào với tỷ lệ dầu đạt 32-37% dầu Mặc dù việc tách chiết mang tính thử nghiệm nhƣng với thu đƣợc tín hiệu mừng cho lĩnh vực lƣợng (năng lƣợng sinh học) tƣơng lai Nhiều phận khác có giá trị dƣợc liệu: vỏ chứa tanin, hoa hấp dẫn ong mật có tiềm cho tạo mật ong Hiện nay, có thêm nghiên cứu tác dụng diệt sâu (đặc biệt rừng) bƣớc đầu cho kết khả quan Đây loài thích nghi với nhiều điều kiện tự nhiên: trồng vùng có lƣợng mƣa thấp (500mm/năm) có vấn đề đất Ở vùng có lƣợng mƣa cao đƣợc tƣới nƣớc, suất đạt đƣợc cịn cao Vì thế, trồng hầu khắp vùng, sinh trƣởng đƣợc vùng đất hoang hóa Bên cạnh đó, Cọc rào sinh trƣởng đƣợc loại đất thuộc lƣu vực sơng, độ màu mỡ kém, đất thối hóa, đất bỏ hoang, đất trống vùng đất khác nhƣ dọc theo kênh, đƣờng cao tốc, đất khô cằn bán khơ cằn, chí đất nhiễm mặn mà sinh trƣởng nhanh Với đặc điểm đó, Cọc rào đƣợc trồng để cải tạo vùng đất thối hóa nhiều vùng đất có điều kiện khắc nghiệt Có thể tạo từ hạt sau tháng giâm hom Nhân hom cành dễ dàng đạt đƣợc sinh trƣởng nhanh Cây Cọc rào không làm thức ăn cho động vật tránh đƣợc phá hoại chúng q trình gây trồng, chăm sóc bảo vệ Từ lý trên, phát triển trồng rừng Cọc rào đáp ứng đƣợc yêu cầu bản: cung cấp nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học (biofuel) quy mô lớn, phủ xanh cải tạo vùng đất hoang hóa nghèo kiệt khó khai thác Bên cạnh đó, Cọc rào cịn trở đối tƣợng tiềm cho trồng rừng theo chế phát triển (AR-CDM) Ngồi ra, có tín hiệu khả quan việc tách chiết độc tính lồi sử dụng cơng tác phịng trừ sâu bệnh cho rừng 1.2 Khái niệm đa dạng sinh học giá trị đời sống ngƣời 1.2.1 Khái niệm đa dạng sinh học Đa dạng sinh học phong phú đa dạng nguyên liệu di truyền, loài hệ sinh thái Đa dạng sinh học bao gồm đa dạng nguồn gene mức độ loài, đa dạng phong phú loài phong phú hệ sinh thái Đa dạng di truyền tập hợp biến đổi gene kiểu genotype nội loài Đây đa dạng quan trọng nhất, yếu tố định đến tồn lâu dài tự nhiên loài Vì có khả thích nghi với thay đổi bất lợi môi trƣờng [1] Đa dạng di truyền xác định đƣợc mức độ thể nhƣ hàm lƣợng DNA, cấu trúc số lƣợng NST Những alen khác gene ảnh hƣởng đến phát triển, đặc điểm sinh lý cá thể Bởi vậy, đa dạng di truyền nguồn cung cấp nguyên liệu cho chƣơng trình chọn cải tiến giống nơng nghiệp Xác định đƣợc tính đa dạng di truyền loài giúp ta xác định độ gần xa giống, để tự chọn tổ hợp có khả tạo lai cho ƣu lai cao 1.2.2 Giá trị đa dạng sinh học đời sống ngƣời Đa dạng sinh học trì dịch vụ sinh thái quan trọng, thơng qua q trình quang hợp xanh chuyển khí CO2 thành O2 để ngƣời sinh vật hô hấp Các thuốc động vật làm thuốc truyền thống nguồn gốc việc bảo vệ sức khỏe cho 80% dân số giới Đa dạng sinh học nguồn cho suất tính bền vững nơng nghiệp Hàng năm, nhờ có đa dạng sinh vật cố định Nitơ mang lại giá trị kinh tế khoảng 50 tỷ USD Các giống trồng nông – nghiệp cịn phụ thuộc nhiều vào lồi hoang dại Chúng họ hàng loài đƣợc hóa đƣợc xem nhƣ nguồn nguyên liệu di truyền cung cấp khả kháng bệnh, nâng cao suất, cải thiện thích nghi với mơi trƣờng sống Đa dạng sinh học giúp cho ổn định hệ thống trị, xã hội Con ngƣời cần lƣơng thực, nƣớc sạch, thuốc tài nguyên khác từ hệ sinh thái, gây cân sinh thái xã hội biến động Bên cạnh đó, đa dạng sinh học phục vụ cho nhiều hoạt động giải trí xã hội [2],[3] 1.3 Các loại thị phân tử dựa DNA Sự đời kỹ thuật thị phân tử từ năm 1980 đem đến tiến tất lĩnh vực sinh học đại Sự tiến kỹ thuật mở nhiều triển vọng nắm bắt tiến tới cải biến nhƣ điều khiển gene quy định nhiều đặc điểm quan trọng Chỉ thị phân tử gene đoạn DNA hệ gene Chúng dựa sở kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) để phát locus đơn gene đa gene, địi hỏi khơng địi hỏi trình tự, khác mức độ tin cậy, mức độ khó khăn chi phí, nhƣ chất đa hình mà chúng phát Mỗi kỹ thuật có ƣu điểm nhƣợc điểm riêng Kỹ thuật thị phân tử cho phép nghiên cứu biến đổi vật liệu di truyền thể sống mức DNA Biến đổi di truyền đƣợc nghiên cứu trực tiếp mức độ DNA phát lƣợng lớn đa hình tạo tỷ lệ đột biến cao làm cho chúng phong phú so với thị hình thái Một số thị DNA đƣợc sử dụng phổ biến thị đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP ) thị dựa vào PCR nhƣ đa hình đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP), mircosatellite hay gọi đa hình đoạn lặp lại ngẫu nhiên (SimpleSequence Repeat – SSR), đa hình độ dài đoạn nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism – AFLP)… 1.3.1 Các loại thị phân tử dựa kỹ thuật DNA * Chỉ thị RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) – đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn Enzyme giới hạn nuclease có khả nhận biết đoạn DNA có trình tự nhận biết đoạn DNA có trình tự nucleotide xác định, bám vào đoạn DNA cắt hai sợi phân tử DNA vào nucleotid đói xứng điểm cắt hạn chế [4] *Giới thiệu chung RFLP RFLP (Tanksley cs,1989), sau phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi phân tích genome [5] Để xác định biến dạng chuỗi DNA, ngƣời ta sử dụng RE (Restriction Enzyme) – enzyeme cắt hạn chế, để cắt chuỗi DNA thành phân đoạn có chiều dài khác Số lƣợng chiều dài mảnh cắt thể vị trí giới hạn có chuỗi DNA Đối với phân tử DNA lục lạp xử lý với RE, phân đoạn đƣợc tách riêng theo kích thƣớc kỹ thuật điện di gel agarose Khi nhuộm gel với ethydium bromide phân bố mảnh cắt DNA gel rõ dƣới ánh sáng tia cực tím Đối với phân tử DNA nhân xử lý với RE có hàng triệu mảnh đƣợc tạo thành với kích thƣớc Bởi vậy, điện di gel agarose nhuộm ethydium bromide, dƣới ánh sáng tia cực tím khơng nhận băng riêng biệt mà vệt sáng Để xác định tính đa dạng chiều dài phân đoạn ta phải sử dụng mẫu dò đánh dấu kỹ thuật lai DNA [4] 10 TL37; TQ61 TQ62; TQ63, TQ64 TQ66; TQ67 TQ68; TQ69 TQ70; AĐ71 AĐ72 cao 1.00 Nhóm 2.3: gồm 30 mẫu đƣợc chia thành nhóm: Nhóm 2.3.1: gồm mẫu NA1, NA2, HT27, HT28, HT29 HT30 hệ số tƣơng đồng mẫu HT27, HT28 HT29 cao 1.00 Nhóm 2.3.2: gồm 24 mẫu cịn lại nhóm lại đƣợc chia thành nhóm: Nhóm 3.3.2.1: gồm 18 mẫu mẫu thuộc xuất xứ Nghệ An (trừ NA1 NA2) tồn mẫu thuộc xuất xứ Hịa Bình (HB11 đến HB20) Trong hệ số tƣơng đồng mẫu giống NA3, NA6 NA7; NA4, NA9, NA10 HB11; HB12, HB13 HB14; HB15 HB16; HB17 HB18 có giá trị cao 1.00 Nhóm 3.3.2.2: gồm mẫu là: HT21, HT22, HT23, HT24, HT25 HT26 mẫu thuộc xuất xứ Hà Tĩnh, hệ số tƣơng đồng HT21 HT22 nhƣ mẫu HT23, HT24, HT25 HT26 cho giá trị lớn 1.00 Nhƣ xuất xứ Cọc rào nghiên cứu có xuất xứ Mê – xi – cơ, Bn Ma Thuật, Trung Quốc Hịa Bình xuất xứ có tất mẫu nghiên cứu thuộc nhóm phân loại tức mẫu nghiên cứu thuộc xuất xứ khơng có khác biệt rõ ràng mặt di truyền (hệ số tƣơng đồng quần thể cao) Trong xuất xứ lại, mẫu nghiên cứu thuộc xuất xứ khơng phân bố thành nhóm mà phân tán phân loại Điều cho thấy có khác biệt rõ mặt di truyền mẫu thuộc xuất xứ Cụ thể đƣợc trình bày dƣới đây: 51 3.4.1 Mối quan hệ di truyền mẫu xuất xứ 3.4.1.1 Các dòng thuộc xuất xứ Nghệ An Bảng 3.7 Hệ số tương đồng dòng thuộc xuất xứ Nghệ An Hình 3.6 Cây phân loại di truyền dòng thuộc xuất xứ Nghệ An Kết thể bảng 3.6 cho thấy xuất xứ Nghệ An chia thành nhóm cụm lại hệ số tƣơng đồng 0.88: Nhóm 1: có hai mẫu NA1 NA2 có hệ số sai khác mặt di truyền so với mẫu khác xuất xứ 0.12 (1 – 0.88) Nhóm 2: gồm mẫu cịn lại, đƣợc chia thành nhóm phụ: Nhóm 2.1 Gồm mẫu NA3, NA5, NA6 NA7 NA3, NA6 NA7 có hệ số tƣơng đồng lớn 1.00 52 Nhóm 2.2 Gồm NA4, NA8, NA9, NA10 có NA4, NA9 NA10 có hệ số tƣơng đồng 1.00 3.4.1.2 Các dòng thuộc xuất xứ Hà Tĩnh Bảng 3.8 Hệ số tương đồng dòng thuộc xuất xứ Hà Tĩnh Hình 3.7 Cây phân loại di truyền dịng thuộc xuất xứ Hà Tĩnh Xuất xứ Hà Tĩnh phân bố chủ yếu thành nhóm cụm lại hệ số tƣơng đồng 0.84: Nhóm 1: gồm HT7 HT8, HT9 HT10 đựợc chia thành nhóm phụ: Nhóm 1.1: có HT10 Nhóm 1.2: HT7, HT8 HT9 có hệ số tƣơng đồng 1.00 Nhóm 2: gồm HT1 đến HT6 đƣợc chia thành nhóm phụ Nhóm 2.1: Gồm HT1 HT2 có hệ số tƣơng đồng với 1.00 Nhóm 2.2: gồm HT3, HT4, HT5 HT6 có hệ số tƣơng đồng 1.00 53 3.4.3 Các dòng thuộc xuất xứ Thái Lan Bảng 3.9 Hệ số tương đồng di truyền dịng thuộc xuất xứ Thái Lan Hình 3.8 Cây phân loại di truyền dòng thuộc xuất xứ Thái Lan Xuất xứ Thái Lan phân thành nhóm phân loại (hình 3.8) cụm lại hệ số tƣơng đồng 0.86: Nhóm 1: gồm mẫu TL1 TL9 Nhóm 2: gồm mẫu cịn lại đƣợc chia thành nhóm phụ: Nhóm 2.1: có mẫu TL10 Nhóm 2.2: gồm TL2, Tl3, TL4, TL5, TL6, TL7 TL8 mẫu TL3 TL5; Tl7 TL8 có hệ số tƣơng đồng lớn 1.00 54 3.4.4 Các dòng thuộc xuất xứ Ấn Độ Bảng 3.10 Hệ số tương đồng dịng thuộc xuất xứ Ấn Độ Hình 3.9 Cây phân loại di truyền dòng thuộc xuất xứ Ấn Độ Hình 3.9 cho thấy xuất xứ Ấn Độ đƣợc phân thành hai nhóm phân loại di truyền cụm lại hệ số tƣơng đồng 0.80: Nhóm 1: mẫu AĐ71, AĐ72, AĐ73 AĐ74 với AĐ1 AĐ2 có hệ số tƣơng đồng 1.00 Nhóm 2: gồm mẫu AĐ5, AĐ6, AĐ7, AĐ8, AĐ9, AĐ10 mẫu AĐ5 AĐ6; AĐ7 AĐ8; AĐ9 AĐ10 có hệ số tƣơng đồng 1.00 Qua phân tích, cho thấy tiến hành phân tích riêng cho xuất xứ phân bố mẫu hồn tồn giống với vị trí mẫu phân loại chung Đồng thời, cho thấy mẫu Cọc rào cho thấy khác biệt mặt di truyền dòng 55 xuất xứ vài mẫu cá biệt (phần lớn mẫu xuất xứ có hệ số tƣơng đồng di truyền lớn phân bố tập chung phân loại) Cả xuất xứ nhìn chung có sai khác nhỏ, đặc biệt có nhiều mẫu xuất xứ có hệ số tƣơng đồng 1.00, sở quan trọng tiến hành gộp mẫu để nghiên cứu 3.4.2 Mối quan hệ di truyền xuất xứ Để tiện đánh giá mối quan hệ di truyền xuất xứ với tiến hành đồng mẫu thuộc xuất xứ để thu đƣợc mẫu xuất xứ sử dụng phần mềm NTSYS để thiết lập hệ số tƣơng đồng nhƣ hình phân loại di truyền Kết cho bảng 3.11 hình 3.10 Bảng 3.11 Hệ số tương đồng mẫu đại diện xuất xứ Hình 3.10 Hình phân loại di truyền xuất xứ 56 Khi xét sai khác mặt di truyền quần thể với nhận thấy xuất xứ, đại đa số có khác biệt mặt di truyền Điều thể chỗ, hầu hết mẫu nghiên cứu thuộc xuất xứ tập trung thành nhóm riêng biệt phân loại di truyền Dựa vào phân loại di truyền chia xuất xứ nghiên cứu thành nhóm cụm lại hệ số tƣơng đồng 0.63: Nhóm 1: có xuất xứ Mê – xi – Nhóm 2: gồm xuất xứ cịn lại đƣợc chi thành nhóm phụ: Nhóm 2.1: có xuất xứ Ấn Độ Nhóm 2.2: gồm xuất xứ đƣợc chia thành nhóm: Nhóm 2.2.1: gồm xuất xứ Nghệ An, Hịa Bình Hà Tĩnh xuất xứ Nghệ An xuất xứ Hịa Bình có hệ số tƣơng đồng 0.93 Nhóm 2.2.2: gồm Xuất xứ Thái Lan, Trung Quốc Bn Mê Thuật xuất xứ Thái Lan xuất xứ Trung Quốc có hệ số tƣơng đồng 0.93 Từ phân tích cho thấy so sánh mối quan hệ mặt di truyền xuất xứ với nhìn chung có khác biệt xuất xứ Tuy nhiên, quan hệ di truyền chƣa phản ánh phân bố mặt địa lý xuất xứ nghiên cứu Điều lí giải nhƣ sau: - Nền tảng di truyền loài Cọc rào hẹp Các nghiên cứu Basha [20] Popluechai [21] đa dạng di truyền loài với 38 loài địa phƣơng (accession) 13 nƣớc giới cho thấy 75% loài địa phƣơng giống nhau, có lồi địa phƣơng thuộc Ấn Độ có mức độ đa dạng di truyền cao Thêm vào đó, có bao trùm mặt giống di truyền xuất xứ địa phƣơng nƣớc Một số nghiên 57 cứu sử dụng microsatellite gần mức độ đồng hợp tử Cọc rào lớn [21] - Ảnh hưởng thu mẫu Việc thu mẫu nhân tố quan trọng Đối với xuất xứ mà có nhiều cọc rào, mẫu hạt thu từ đa dạng hơn, số lƣợng mẹ nhiều Tuy nhiên, số xuất xứ, lƣợng mẹ ít, nên hạt phần lớn đƣợc thu tập trung từ vài mẹ Do mức độ đa dạng xuất xứ thấp Việc ảnh hƣởng đến vị trí xuất xứ phân loại - Số lượng thị phân tử Do đặc điểm mồi RAPD mồi khuyếch đại ngẫu nhiên genome, nên với mồi sử dụng khuôn khổ luận văn số xuất xứ genome bị khuyếch đại với băng có vị trí gần nhƣ Do vậy, sử dụng chƣơng trình NTSYSPC 2.2 để lập phân loại, xuất xứ nằm vào nhóm Cần phải tăng số lƣợng mồi lên - Quá trình phân bào genome Các mẫu lấy từ xuất xứ gieo từ hạt nên xảy phân ly, trao đổi chéo khiến cho genome chúng gần cách ngẫu nhiên 58 CHƢƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Kết tách chiết DNA tổng số từ 80 mẫu Cọc rào thu đƣợc mẫu DNA sạch, khơng bị đứt gẫy, có chất lƣợng tốt đủ tiêu chuẩn cho thực phản ứng PCR- RAPD - Kết phản ứng PCR- RAPD 80 mẫu Cọc rào xuất xứ nƣớc với mồi ngẫu nhiên khác điện di sản phẩm gel agarose 1,8% cho thấy 5/5 mồi cho đa hình có 1487 băng (phân đoạn) DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên Trong có mồi OPAB6, OPAB5 OPA4 cho số phân đoạn DNA nhiều hẳn mồi lại, mồi cho số phân đoạn phong phú - Số liệu phân tích chƣơng trình NTSYS đƣa đƣợc ma trận thể độ tƣơng đồng di truyền mẫu xuất xứ xuất xứ với Qua xác định đƣợc nhiều cặp mẫu giống có gần gũi mặt di truyền có hệ số tƣơng đồng ≥ 0,9 - Đã lập đƣợc sơ đồ hình thể mối quan hệ mặt di truyền mẫu thuộc xuất xứ mẫu không xuất xứ nghiên cứu Trên sở đó, ngƣỡng hệ số tƣơng đồng 0,53 sơ đồ hình thu đƣợc có nhóm với hệ số sai khác hệ số tƣơng đồng di truyền từ 0.00 (AĐ75, AĐ76, AĐ79, AĐ80, MXC52, MXC54, MXC55, MXC56, MXC57, MXC58, BMT1, BMT2, BMT3, BMT4, BMT5, BMT6, BMT7, BMT8, BMT9, TL33 TL35; TL36, TL37, TQ61, TQ62, TQ63, TQ64, TQ66, TQ67, TQ68, TQ69, TQ70, AĐ71, AĐ72 …) đến 0.47 (nhóm 1) hay từ 0% đến 47 % 59 - Sơ đồ hình chƣa phản ánh vị trí phân bố địa lý Điều nguyên nhân nhƣ Cọc rào có tảng di truyền hẹp, ảnh hƣởng thu mẫu, số lƣợng mồi RAPD q trình phân bào genome 4.2 Tồn - Hiện chƣa có nhiều nơi gây trồng Cọc rào với thông tin đầy đủ chi tiết, điều hạn chế trình thu mẫu nghiên cứu - Cọc rào có chu kỳ rụng lâu (từ tháng 12 đến tháng 4) nên việc nghiên cứu sử dụng mẫu (đặc biệt mẫu lá) phụ thuộc nhiều vào chu kỳ sinh trƣởng loài này, giai đoạn vƣờm ƣơm 4.3 Kiến nghị - Do nghiên cứu sử dụng mồi RAPD nên để xác định xác mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu cần tiếp tục tiến hành phân tích thêm với số mồi để phân tích sâu mối quan hệ mặt di truyền quần thể - Do số lƣợng mẫu nghiên cứu nhiều nên gây khó khăn trình xử lý phân tích số liệu (đặc biệu bảng ma trận) Do nghiên cứu tiếp theo, mà dung lƣợng mẫu lớn nên sử dụng phƣơng pháp gộp mẫu để thuận tiện trình nghiên cứu, đồng thời đảm bảo hàm lƣợng khoa học 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Ngọc Ẩn (2004), Đa dạng sinh học bảo tồn thiên nhiên, NXB nông nghiệp, TPHCM.21 Lê Trọng Cúc (2002), Đa dạng sinh học bảo tồn thiên nhiên, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.6 Phạm Bình Quyền, Nguyễn Nghĩa Thìn (2003), Đa dạng sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.18 Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội.7 Nguyễn Thị Lang (2002), phƣơng pháp nghiên cứu công nghệ sinh học, NXB Nông Nghiêp TPHCM.11 Khuất Hữu Thành, Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội.4 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.3 Willams, J.G.K.,Kubelik, A.R., Livak, K.j., Rafalski, J.A., Tingey, S.V (1990), DNApolymorphisms amplified by arbitrary primers are usefulas genetics markers, Nucl Acid Res., 18, pp 6531-6535.27 Devos K.M and Gale M.D (1992), The use of random amplified polymorphic DNA markers in wheat theor, Appl Genet., 84, pp 660÷565.25 10 A Chtterjee and S.K Talapatra (1955), Constitution of vincain, a β – carbolin alkaloid isolated from vinca rosea, Science and culture (India), 20, pp 568-570.27 11 Nguyễn Văn Thiết, Lê Thị Lan Oanh (1999), Một số kết ban đầu nghiên cứu mối quan hệ di truyền giống nhãn trồng Việt 61 Nam kỹ thuật RAPDm Tóm tắt báo cáo Khoa học, Hội nghị Cơng nghệ sinh học toàn quốc, Hà mội.14 12.Nguyễn Xuân Thụ, Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Dung (1998), Sử dụng dấu chuẩn RAPD đệ nhận dạng số giống chuối trồng Việt Nam, Di truyền ứng dụng, số 3, tr 20-25.16 13 Nguyễn Văn Thiết, Lê Lan Oanh (2001), Nghiên cứu đa dạng sinh học nhãn trồng Việt Nam kỹ thuật RAPD, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 7, tr 14-20.17 14.Nguyễn Đức Thành, Phạm Duy Toản, Nguyễn Hoàng Anh (2000), Ứng dụng thị phân tử RAPD STS nghiên cứu đa dạng di truyền chọn giống lúa, Những vấn đề nghiên cứu sinh học, Tóm tắt Báo cáo Khoa học, Hà Nội.9 15 Nguyễn Quang Khải, Khuất Hứu Trung, Nghiên cứu đa dạng di truyền số giống Sở (camellia.sp.) Việt Nam kỹ thuật RAPD, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Lâm nghiệp, số 4,2007, tr.452-459 16 Tanksley S.D., Young N.D., Paterson A H; Bonierbale M.W., (1989) RFLP mapping in plant breeding – new tools for an old science Biotechnology (3): 257-264 17 Mullis, K.B and Faloona, F A (1987) Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalysed chain reaction In Wu, R (ed.) Method in Enzymology, vol 155, pp 335-350 Academic Press, New York 18 Williams, J.G.K.; Kubelik, A R.; Livak, K J., Rafalsk J A., and Tingey, S V (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are usefull as genetic markers Nucleic Acids Research 18:6531-6535 19 Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., Vandelee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Pelaman, J Kuiper, M and Zabeau, M (1995) 62 AFLP: a new techniques for DNA fingerprinting Nucleic Acid Research 23: 4407-4414 20 Olson, M., Hood, L., Cantor, D and Bostein, D (1989) A common language for physical mapping of the human genome Science 245: 1434-1435 21.Basha S.D Sujatha E M (2007) Inter and intra-population variability of Jatropha curcas (L.) characterized by RAPD and ISSR markers and development of population-specific SCAR markers Euphytica (2007) 156:375–386 22 Popluechai S., Breviario D., Mulpuri S., Makkar H.P.S., Raorane M., Reddy A.R , Palchetti E., Gatehouse A M R., Syers J K, Anthony G., O’Donnell, Ajay Kohli A (2009) Narrow genetic and apparent phenetic diversity in Jatropha curcas: initial success with generating low phorbol ester interspecific hybrids Nature Precedding 63 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tình hình nghiên cứu Cọc rào Thế giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nghiên cứu Thế giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 1.1.3 Các đặc điểm Cọc rào 1.2 Khái niệm đa dạng sinh học giá trị đời sống ngƣời 1.2.1 Khái niệm đa dạng sinh học 1.2.2 Giá trị đa dạng sinh học đời sống ngƣời 1.3 Các loại thị phân tử dựa DNA 1.3.1 Các loại thị phân tử dựa kỹ thuật DNA 10 1.3.2 Các thị phân tử dựa kỹ thuật PCR 11 1.4 Ứng dụng thị phân tử RAPD nghiên cứu đa dạng di truyền chọn giống lâm nghiệp 19 1.4.2 Sử dụng bảo tồn nguồn gen rừng 20 CHƢƠNG MỤC TIÊU, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21 2.1.1 Mục tiêu chung 21 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 21 2.2 Vật liệu nghiên cứu 21 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2.2 Các mồi sử dụng nghiên cứu 22 2.2.3.Hoá chất sử dụng nghiên cứu 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 64 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Kỹ thuật thu bảo quản mẫu 24 2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng độ DNA 25 2.4.4 Phản ứng PCR –RAPD 26 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 29 3.2 Kết xác định quy trình chạy PCR- RAPD phù hợp sử dụng nghiên cứu tối ƣu hoá mồi 31 3.2.1 Kết xác định chƣơng trình chạy PCR- RAPD phù hợp phục vụ nghiên cứu 31 3.2.2 Kết tối ƣu hoá mồi RAPD 32 3.3 Kết phân tích đa hình mẫu DNA với mồi kỹ thuật RAPD 33 3.3.1 Kết phân tích với mồi OPAB6 34 3.3.3 Mồi OPA4 43 3.4 Mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu xuất xứ mẫu xuất xứ dựa phân tích RAPD 47 3.4.1 Mối quan hệ di truyền mẫu xuất xứ 52 3.4.4 Các dòng thuộc xuất xứ Ấn Độ 55 3.4.2 Mối quan hệ di truyền xuất xứ 56 CHƢƠNG KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Tồn 60 4.3 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 65