Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy hợp chất eurycomanone của tế bào cây mật nhân eurycoma longifolia jack nuôi cấy in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG THÁI THỊ MỸ DIỆU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP CHẤT EURYCOMANONE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY IN VITRO ĐÀ NẴNG, 05 - 2016 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG THÁI THỊ MỸ DIỆU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP CHẤT EURYCOMANONE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY IN VITRO NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS VÕ CHÂU TUẤN ĐÀ NẴNG, 05 - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khác Đà nẵng, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Thái Thị Mỹ Diệu LỜI CÁM ƠN Để hồn thành khóa luận này, trước hết em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô môn Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đại học Đà Nẵng Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Châu Tuấn, thầy giáo trực tiếp hướng dẫn bảo tận tình cho em từ nhận đề tài hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo – người trực tiếp giảng dạy truyền đạt kiến thức khoa học chuyên ngành công nghệ sinh học cho em năm qua Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ em vật chất lẫn tinh thần để em đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! Đà nẵng, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Thái Thị Mỹ Diệu MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn .2 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nuôi cấy tế bào thực vật .3 1.1.1 Nuôi cấy callus 1.1.2 Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy tế bào thực vật 1.1.3.1 Môi trường nuôi cấy .5 1.1.3.2 Điều kiện nuôi cấy 1.2 Sự tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật nuôi cấy in vitro .7 1.3 Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) 1.3.1 Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) 1.3.2 Một số chất kích kháng thường dùng 1.3.3 Những nghiên cứu bổ sung chất kích kháng sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 10 1.3.3.1 Những nghiên cứu nước .10 1.3.3.2 Những nghiên cứu nước .13 1.4 Giới thiệu mật nhân 14 1.4.1 Nguồn gốc phân bố 14 1.4.2 Đặc điểm hình thái 14 1.4.3 Thành phần hóa học 15 1.4.4 Tác dụng dược lý 15 1.4.5 Một số nghiên cứu mật nhân .16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy callus 20 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào mật nhân có bổ sung kích kháng 21 2.2.2.1 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 21 2.2.2.2 Ảnh hưởng thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân .21 2.2.2.3 Ảnh hưởng nồng độ NaH2PO4 lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 21 2.2.2.4 Ảnh hưởng thời gian bổ sung NaH2PO4 lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân .21 2.2.2.5 Xác định sinh khối tế bào .22 2.2.3 Xác định hàm lượng eurycomanone HPLC 22 2.2.4 Xử lý thống kê 22 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân .23 3.2 Ảnh hưởng thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 25 3.3 Ảnh hưởng nồng độ NaH2PO4 lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 26 3.4 Ảnh hưởng thời gian bổ sung NaH2PO4 lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân 27 3.5 Sự tích lũy hợp chất eurycomanone tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro có bổ sung kích kháng .28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 Kết luận 32 Đề nghị 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BA : 6-benzyl adenine BAP : 6-benzyl amino purine cs : cộng ĐHST : điều hòa sinh trưởng GA : gibberellin acid HPLC : high performance liquid chromatography IBA : indole 3-butyric acid KIN : kinetin (6-furfuryl aminopurine) L : lít MS : Murashige Skoog (1962) NAA : α-nathyl acetic acid NXB : Nhà xuất DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Tế bào callus mật nhân 19 2.2 Sơ đồ thí nghiệm 20 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Dịch huyền phù tế bào mật nhân sau 14 ngày ni cấy bình tam giác có bổ sung g/L dịch chiết nấm men Khối lượng tươi khối lượng khô tế bào mật nhân bổ sung NaH2PO4 vào ngày nuôi cấy thứ Phổ HPLC eurycomanone chuẩn Phổ HPLC eurycomanone tế bào mật nhân bổ sung NaH2PO4 sau 15 ngày nuôi cấy Phổ HPLC eurycomanone tế bào mật nhân bổ sung dịch chiết nấm men sau 15 ngày nuôi cấy 24 28 29 29 29 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Tên bảng Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng thời gian bổ sung dịch chiết nấm men lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng nồng độ NaH2PO4 lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Ảnh hưởng thời gian bổ sung NaH2PO4 lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân Hàm lượng eurycomanone tế bào mật nhân loại kích kháng khác Trang 23 25 26 27 30 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Từ xa xưa, người biết sử dụng số cỏ để làm thực phẩm làm thuốc điều trị bệnh tật vết thương Những tác dụng chữa bệnh, tăng cường bảo vệ sức khoẻ cỏ người chủ yếu hợp chất tự nhiên mà chúng sinh tổng hợp, tích luỹ q trình sinh trưởng phát triển Đến nay, có nhiều dược phẩm sản xuất đường tổng hợp hoá học người quan tâm đến hợp chất có nguồn gốc tự nhiên Bởi nhà khoa học phát nhiều thuốc tổng hợp hóa học tồn phần có cấu trúc hóa học xa lạ, ngoại lai với cấu trúc hóa học hợp chất thiên nhiên nên sinh nhiều tác dụng phụ độc hại cho người [7] Hiện nay, nạn khai thác bừa bãi, mức loài thuốc phục vụ nhu cầu dược liệu làm suy giảm nhanh chóng chất lượng loài thuốc đẩy nhiều loài quý, vào nguy tuyệt chủng Như vậy, việc sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật đường canh tác truyền thống tổng hợp hóa học có nhiều hạn chế, khó đáp ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày tăng tương lai [18] Vì vậy, ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất dược liệu nhà khoa học quan tâm ngày nhiều Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) thuốc quý, sử dụng nhiều nước Đông Nam Á Hầu hết phận sử dụng làm thuốc để chữa nhiều loại bệnh, chẳng hạn bệnh sốt rét, tiểu đường, viêm loét, nhiễm khuẩn…; đặc biệt có tác dụng tốt cải thiện sinh lý nam giới Tuy nhiên, mật nhân loài thân gỗ, sinh trưởng chậm, phải khoảng năm trồng thu hoạch cho nguyên liệu dùng làm dược liệu [13] Mặc khác, bị ảnh hưởng nạn khai thác bừa bãi, mật nhân lâm vào nguy tuyệt chủng tương lai không xa Nuôi cấy tế bào huyền phù có bổ sung chất kích kháng thực vật biện pháp làm tăng hiệu suất tổng hợp hoạt chất sinh học tế bào, tăng hàm lượng hoạt tính sinh học cao, rút ngắn thời gian giảm chi phí sản xuất so với thu từ tự nhiên Các chất kích kháng thường sử dụng methyl jasmonate, acid salicylic, dịch chiết nấm men, ethrel… [16], [67] 28 đầu Trong đó, NaH2PO4 bổ sung vào ngày thứ 12 sinh khối giảm 29,35 g tươi 0,59 g khơ a b Hình 3.2 Khối lượng tươi (a) khối lượng khô (b) tế bào mật nhân bổ sung NaH2PO4 vào ngày nuôi cấy thứ Như vậy, NaH2PO4 có khả tăng cường sinh khối tế bào đạt sinh khối cao bổ sung vào ngày ni cấy thứ 3.5 Sự tích lũy hợp chất eurycomanone tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro có bổ sung kích kháng Dựa vào kết nghiên cứu sinh trưởng tế bào mật nhân loại chất kích kháng dịch chiết nấm men NaH2PO4, chọn điều kiện đạt sinh trưởng tốt g/L dịch chiết nấm men bổ sung từ lúc bắt đầu nuôi cấy g/L NaH2PO4 bổ sung vào ngày nuôi cấy thứ để khảo sát tích lũy eurycomanone tế bào Kết phân tích HPLC trình bày hình 3.3 – 3.5 bảng 3.5 Phổ HPLC eurycomanone chuẩn có đỉnh (peak) thời gian lưu 4,83 phút Một peak có thời gian lưu tương đương tìm thấy dịch chiết tế bào mật nhân có bổ sung dịch chiết nấm men (4,82 phút) tế bào mật nhân có bổ sung NaH2PO4 (4,82 phút) Dựa vào phổ HPLC eurycomanone chuẩn, xác định rằng, hai dịch chiết tế bào mật nhân có bổ sung dịch chiết nấm men NaH2PO4 có tích lũy eurycomanone tế bào 29 Hình 3.3 Phổ HPLC eurycomanone chuẩn Hình 3.4 Phổ HPLC eurycomanone tế bào mật nhân bổ sung NaH2PO4 sau 15 ngày ni cấy Hình 3.5 Phổ HPLC eurycomanone tế bào mật nhân bổ sung dịch chiết nấm men sau 15 ngày nuôi cấy 30 Bảng 3.5 Hàm lượng eurycomanone tế bào mật nhân loại kích kháng khác Thời gian lưu Diện tích peak Hàm lượng (phút) (mAU) eurycomanone (%) Dịch chiết nấm men 4,82 526,10 0,0132 NaH2PO4 4,82 410,54 0,0103 Control 4,81 496,39 0,0125 Loại kích kháng Chú thích: control: dịch chiết tế bào mật nhân khơng bổ sung chất kích kháng Kết nghiên cứu bảng 3.5 cho thấy, hàm lượng eurycomanone (theo % khối lượng khơ) tích lũy tế bào mật nhân sau 15 ngày nuôi cấy bổ sung dịch chiết nấm men cao so với mẫu đối chứng, tế bào mật nhân bổ sung NaH2PO4 lại thấp Điều cho thấy dịch chiết nấm men có khả tăng cường tích lũy eurycomanone tế bào mật nhân, NaH2PO4 lại ức chế tích lũy eurycomanone Các nghiên cứu cho thấy rằng, dịch chiết nấm men có tác dụng tăng cường tích lũy hợp chất có hoạt tính sinh học Chẳng hạn nghiên cứu Amita Saumya (2015) dịch chiết nấm men có khả tăng cường tích lũy solasodine (43,12 µg/g trọng lượng khơ) gấp lần so với không bổ sung nuôi cấy rễ tơ cà Tím [21] Hay nghiên cứu Nguyễn Hoàng Lộc cs (2014), dịch chiết nấm men nồng độ g/L giúp tăng hàm lượng solasodine tế bào cà Gai Leo lên 220,5 mg/g, gấp 1,8 lần so với tế bào không bổ sung dịch chiết nấm men [64] Hakkim cs (2011) sử dụng dịch chiết nấm men chất kích kháng nhằm tăng rosmarinic ni cấy tế bào Ocimum sanctum Kết cho thấy dịch chiết nấm men nồng độ 0,5 g/L giúp tăng hàm lượng tích lũy rosmarinic acid lên gấp lần so với nuôi cấy huyền phù không bổ sung (hàm lượng rosmarinic acid 5,7 mg/L/ngày) [36] Như vậy, khảo sát tích lũy eurycomanone tế bào mật nhân sau 15 ngày nuôi cấy điều kiện bổ sung chất kích kháng đạt sinh trưởng tốt ta thấy, điều kiện có g/L dịch chiết nấm men bổ sung vào ngày đầu nuôi cấy cho hàm 31 lượng tích lũy eurycomanone cao so với đối chứng đạt 0,0132%, cịn điều kiện có g/L NaH2PO4 bổ sung vào ngày ni cấy thứ hàm lượng tích lũy giảm đạt 0,0103%, thấp so với đối chứng 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu, rút số kết luận sau: - Dịch chiết nấm men có tác dụng tăng sinh khối tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù, nồng độ dịch chiết g/L bổ sung từ lúc bắt đầu ni cấy cho sinh khối cao nhất, đạt 45,34 g tươi 0,88 g khô, gấp 15 lần so với ban đầu 1,8 lần so với đối chứng - NaH2PO4 có tác dụng tăng cường sinh trưởng tế bào mật nhân, sinh khối tế bào cao đạt 42,74 g tươi 0,83 g khô, gấp 14 lần so với ban đầu 1,6 lần so với đối chứng bổ sung g/L NaH2PO4 vào ngày nuôi cấy thứ - Hàm lượng eurycomanone tế bào mật nhân sau 15 ngày nuôi cấy có bổ sung dịch chiết nấm men 0,0132%, NaH2PO4 0,0103% Trong đó, dịch chiết nấm men có khả tăng cường tích lũy eurycomanone, cịn NaH2PO4 cho thấy ức chế khả tích lũy eurycomanone tế bào mật nhân Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu nội dung sau: - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích kháng lên khả sinh trưởng tích lũy eurycomanone tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng lên khả tích lũy hoạt chất sinh học tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù theo giai đoạn sinh trưởng 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt [1] Tạ Như Thục Anh, Trần Dụ Chi, Vũ Văn Vụ (2008), “Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng đến phát sinh hình thái mô Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blaco) Benth) ni cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 24, Tr 44-49 [2] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương cs (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập I, NXB khoa học kỹ thuật [3] Ngơ Xn Bình (2010), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Đại học Nông lâm Thái Nguyên [4] Nguyễn Thị Mỹ Duyên, Trương Thị Hằng (2014), “Khảo sát khả tạo mô sẹo từ cuống lá, phiến nụ hoa non phục vụ cho việc vi nhân giống hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii bolus)”, Tạp chí khoa học trường đại học An Giang, 4(3), Tr 114-120 [5] Phan Duy Hiệp, Nguyễn Trí Minh, Phan Xuân Huyên, Cao Đình Hùng, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh Hằng (2014), “Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái số giống sâm Bố (Hibiscus sagittifolius kurz) điều kiện in vitro”, Tạp chí sinh học, 36(1), Tr 266-271 [6] Phạm Thị Như Hồng (2006), “Khảo sát thành phần hóa học Bá Bệnh (Eurycoma longifolia Jack) họ thất (Simarubaceae)”, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh - Đại học Huế, 64 [7] TS Phan Quốc Kinh (2011), Giáo trình hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB Giáo dục Việt Nam [8] Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật, NXB Đại học Huế [9] Nguyễn Hồng Lộc (2006), Giáo trình Cơng nghệ tế bào, NXB Đại học Huế [10] Trần Văn Minh (1997), Công nghệ tế bào thực vật – Plant cell biotechnplogy, Đại học Nơng Lâm, Tp Hồ Chí Minh 34 [11] Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên (2007), “Nuôi cấy tế bào tái tạo mô sẹo từ huyền phù tế bào thông đỏ Hymalaya (thông đỏ lâm đồng) (Taxus wallichiana Zucc.)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(2), Tr 243-253 [12] Dương Tấn Nhựt, Trần Thị Thu Hà, Trịnh Thị Hương, Hoàng Văn Cương, Nguyễn Phúc Huy (2012), “Nghiên cứu hình thành mơ sẹo tế bào đơn Kiwi (Actinidia deliciosa)”, Tạp chí sinh học, 34(4), Tr 505-514 [13] Trần Thị Kiều Oanh (2015), Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố nuôi cấy lên khả sinh trưởng tế bào mật nhân (Eurycoma longifolia Jack), Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng [14] Quách Ngô Diễm Phương, Hoàng Thị Thanh Minh, Hoàng Thị Thu, Bùi Văn Lệ (2010), “Nuôi cấy mô sẹo dịch huyền phù tế bào bèo đất Drosera burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone”, Tạp chí phát triển KH&CN, 13(2), Tr 53-61 [15] Lâm Ngọc Phương , Nguyễn Bảo Vệ Đỗ Thị Trang Nhã (2005), “Ảnh hưởng cường độ ánh sáng hàm lượng đường sucrose môi trường nuôi cấy đến phát triển chồi dưa hấu tam bội in vitro”, Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 4, Tr 1-8 [16] Trần Vũ Ngọc Thi (2014), “Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên khả tích lũy curcumin tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe), Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 1(1) [17] Đỗ Quốc Trương (2012), Nghiên cứu trình phát sinh mô sẹo từ mẫu bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack), Khóa luận tốt nghiệp, Ngành cơng nghệ sinh học, trường Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh [18] Võ Châu Tuấn (2014), “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) khảo sát khả tích lũy số hợp chất có hoạt tính sinh học chúng”, Luận án Tiến sĩ ngành Sinh học, Đại học Khoa học Huế [19] Vũ Văn Vụ (1990), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục Hà Nội 35 Tiếng anh [20] Abdul Shukor Tajul Ariff, Ima Nirwana Soelaiman, J Pramanik, and Ahmad Nazrun Shuid (2012), “Effects of Eurycoma longifolia on Testosterone Level and Bone Structure in an Aged Orchidectomised Rat Model, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine”, J Hindawi [21] Amita Jain and Saumya Singh (2015), “Effect of growth regulators and elicitors for the enhanced production of solasodine in hairy root culture of solanum melongena (L.)”, J Indian bot Soc, 94 (1,2), pp 23-39 [22] Ang H., T Ngai and T Tan (2003), “Effects of Jack on sexual qualities in middle aged male rats”, Phytomedicine, 10(6-7), pp 590-593 [23] Ang H.; Ikeda S.; Gan E (2001), “Evaluation of the potency activity of aphrodisiac in Eurycoma longifolia Jack”, Phytother Res, 15, pp 435–436 [24] Ang HH, Hitotsuyanagi Y, Fukaya H, Takeya K (2002), “Quassinoids from Eurycoma longifolia”, Phytochem, 59(8), pp 833-837 [25] Arehzoo Z, Christina S, Florian G, Parvaneh A, Javad A, Seyed H M, Christoph W (2015), “Effects of some elicitors on tanshinone production in adventitious root cultures of Perovskia abrotanoides Karel”, Industrial Crops and Products, 67, pp 97–102 [26] B Poornasri Devi, A Vimala, Isha Sai and S Chandra (2008), “Effect of cyanobacterial elicitor on Neem cell suspension cultures”, Indian Journal of Science and Technology, 1(7) [27] Balazova A, Bilka F, Blana´rikova´ V, Psena´k M (2002), “Effect of a fungal elicitor on levels of sanguinarine and polyphenoloxidase activity in a suspension culture of Papaver somniferum L.”, Ceská a Slovenská Farmacie, 51, pp 182– 185 [28] Bhagwath SG, Hjortso MA (2000), “Statistical analysis of elicitation strategies for thiarubrine A production in hairy root cultures of Ambrosia artemisiifolia”, Journal of Biotechnology, 80, pp 159-167 [29] Chan KL, Lee S, Sam TW, Han BH (1989), “A quassinoid glycoside from the roots of Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 28, pp 2857-2859 36 [30] Chan Lai Keng, Ang Dze Wei and Arvind Bhatt (2010), “Elicitation effect on cell biomass and production of alkaloids in cell suspension culture of the tropical tree Eurycoma longifolia”, Cuadernos de Investigación UNED, 2(2), pp 239-244 [31] Chan, K., B Low, C The and P Das (2009), “The effect of Eurycoma longifolia on sperm quality of male rats”, Natural product communications, 4(10), pp 1331-1336 [32] Chan, K.; Lee, S.; Sam, T.; Han, B (1989), “A quassinoid glycoside from the roots of Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 28, pp 2857–2859 [33] Curtin C, Zhang W, Franco C (2003), “Manipulating anthocyanin composition in Vitis vinifera suspension cultures by elicitation with jasmonic acid and light irradiation”, Biotechnology Letters, 25, pp 1131–1135 [34] Darise, M.; Kohda, H.; Mizutani, K.; Tanaka, O (1982), “Eurycomanone and eurycomanol, quassinoids from the roots of Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 21, pp 2091–2093 [35] Eilert U, Ehmke A, Wolters B (1984), “Induced accumulation of acridone alkaloid epoxides in Ruta graveolens suspension cultures”, Planta Medica, 50, pp 508–512 [36] F Lukmanul Hakkim, Sivan kalyani, Mohammed Essa, S Girija, Hyuk Song (2011), “Production of rosmarinic in Ocimum sanctum cell cultures by the influence of sucrose, phenylalanine, yeast extract, and methyl jasmonate”, J Biol Med Res, 2(4), pp 1070-1074 [37] Farouk AE, Benafri A (2007), “Antibacterial activity of Eurycoma longifolia Jack A Malaysian medicinal plant”, Saudi Med J, 28(9), pp 1422-1424 [38] Felix G, Grosskopf DG, Regenass M, Basse CW, Boller T (1991), “Elicitor– induced ethylene biosynthesis in tomato cells: characterization and use as a bioassay for elicitor action”, Plant Physiology, 97, pp 19–25 [39] Gangopadhyay M, Dewanjee S, Bhattacharya S (2011), “Enhanced plumbagin production in elicited Plumbago indica hairy root cultures”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 111, pp 706–710 37 [40] Ghasak G.Faisal, Basma E.Alahmad, Nazyih S.Mustafa, Ghazi F.Najmuldeen, Osama Althunibat, Marwan S.Azzubaidi (2013), “Histopathological effects of Eurycoma longifolia Jack extract (tongkat ali) on the prostate of rats”, Journal of Asian Scientific Research, (8), pp 843-851 [41] H Morita, E Kishi, K Takeya, H Itokawa, and Y Iitaka (1993), “Squalene derivatives from Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 34(3), pp 765–771 [42] H Yusuf, Mustofa , M Agus Wijayanti , R Asmah Susidarti , P Budi Setia Asih , Suryawati and Sofia (2013), “A new quassinoid of four isolated compounds from extract Eurycoma longifolia Jack roots and Their in-vitro antimalarial activity”, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, (3), pp 728-734 [43] Hu X, Neill S, Cai W, Tang Z (2003), “Hydrogen peroxide and jasmonic acid mediate oligogalacturonic acid–induced saponin accumulation in suspension– cultured cells of Panax ginseng”, Physiologia Plantarum, 118, pp 414–421 [44] Idrees M, Naeem M, Aftab T, Khan MM (2010), “Salicylic acid mitigates salinity stress by improving antioxidant defence system and enhances vincristine and vinblastine alkaloids production in periwinkle [Catharanthus roseus (L.) G Don]”, Acta Physiologia Plantarum, 33, pp 987–999 [45] Itokawa H, Kishi E, Morita H, Takeyak, Eureline IY (1991), “A new squalene type triterpene form Eurycoma longifolia”, Tetrahedron Lett, 15, pp 18031804 [46] Jiwajinda S, Santisopasri V, Murakami A, Kawanaka M, Kawanaka H, Gasquet M, Eilas R, Balansard G, Ohigashi H (2002), “In vitro anti-tumor promoting and anti-parasitic activities of the quassinoids from Eurycoma longifolia, a medicinal plant in Southeast Asia”, Journal of Ethnopharmacology, 82(1), pp 55-58 [47] Kart – Hermann Neumann, Ashwani Kumar Jafargholi Imani (2009), “Plant Cell and Tissue Culture – A Tool in Biotechnology”, Springer – Verlag Berlin Heidelberg 38 [48] Krzyzanowska J, Czubacka A, Pecio L, Przybys M, Doroszewska T, Stochmal A, Oleszek W (2013), “The effects of jasmonic acid and methyl jasmonate on rosmarinic acid production in Mentha piperita cell suspension cultures”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 108, pp 73–81 [49] Kuo P-C, Damu AG, Lee KH, Wu TS (2004), “Cytotoxic and antimalarial constituents from the roots of Eurycoma longifolia”, Bioorg Med Chem, 12, pp 537-544 [50] Lattanzio V, Lattanzio VM, Cardinali A (2006), “Role of phenolics in the resistance mechanisms of plants against fungal pathogens and insects”, Phytochemistry Advances in Research, 661, pp 23–67 [51] Lee JM (2001), “Biochemical Engineering”, Prentice Hall, Inc USA [52] Low BS, The CH, Yuen KH, Chan KL (2011), “Physico-chemical effects of the major quassinoids in a standardized Eurycoma longifolia extract (Fr2) on the bioavailability and pharmacokinetic properties, and their implications for oral antimalarial activity”, Nad Prod Commun, 6(3), pp 337-341 [53] Low, B.S.; Choi, S.B.; Wahab, H.A.; Das, P.K.; Chan, K.L (2013), “Eurycomanone, the major quassinoid in Eurycoma longifolia root extract increases spermatogenesis by inhibiting the activity of phosphodiesterase and aromatase in steroidogenesis”, J Ethnopharmacol, 149, pp 201–207 [54] M I B M Tambi, M K Imran, and R R Henkel (2012), “Standardised watersoluble extract of Eurycoma longifolia, Tongkat Ali, as testosterone booster for managing men with late-onset hypogonadism?”Andrologia, 44, pp 226–230 [55] M I Tambi (2002), “Glycoprotein water-soluble extract of Eurycoma longifolia Jack as a health supplement in management of Health aging in aged men”, Aging Male, pp [56] M I Tambi (2005), “Standardized water soluble extract of Eurycoma longifolia (LJ100) on men’s health”, International Journal of Andrology, 28, pp 27 [57] Marvin Loke Kah Hong, Arvind Bhatt, Ning Shu Ping And Chan Lai Keng (2012), “Detection of elicitation effect on Hyoscyamus niger L root cultures for 39 the root growth and production of tropane alkaloids”, Romanian Biotechnological Letters, 17(3) [58] Md Abdullahil Baque, Md Humayun Kabir Shiragi , Eun-Jung Lee, Kee-Yoeup Paek (2012), “Elicitor effect of chitosan and pectin on the biosynthesis of anthraquinones, phenolics and flavonoids in adventitious root suspension cultures of Morinda citrifolia (L.)”, Australian Journal of Crop Science, 6(9) [59] Meng, D.; Li, X.; Han, L.; Zhang, L.; An, W.; Li, X (2014), “Four new quassinoids from the roots of Eurycoma longifolia Jack” Fitoterapia, 92, pp 105–110 [60] Ming Q, Su C, Zheng C, Jia M, Zhang Q, Zhang H, Rahman K, Han T, Tần L (2013), “Elicitors from the endophytic fungus Trichoderma atroviride promote Salvia miltiorrhiza hairy root growth and tanshinone biosynthesis”, J Exp Bot, 64(18), pp 5687-5694 [61] Misawa M (1994), “Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite”, FAO Agricultural services bulletin, 108 [62] Miyake K, Li F, Tezuka Y, Awale S, Kadota S (2010), “Cytotoxic activity of quassinoids Eurycoma longifolia”, Nad Prod Commun, 5(7), pp 1009-1012 [63] Morita, H.; Kishi, E.; Takeya, K.; Itokawa H (1992), “ Biphenylneolignans from wood of Eurycoma longifolia”, Phytochemistry, 31, pp 3993–3995 [64] Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh Khuyen, Ton Nu Thuy An (2014), “Effects of yeast extract and methyl jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis in cell cultures of Solanum hainanense Hance”, J BioSci Biotech, 3(1), pp 1-6 [65] orhazlina Abdul Wahab; Norfilza M Mokhtar; Wan Nurul Heriza A Halim; Srijit Das (2010), “The effect of Eurycoma longifolia jack on spermatogenesis in estrogen-treated rats”, J Clinics, 65 (1) [66] Peiqin Li, Yan Mou, Tijiang Shan, Jianmei Xu, Yan Li, Shiqiong Lu and Ligang Zhou (2011), “Effects of Polysaccharide Elicitors from Endophytic Fusarium oxysporium Dzf17 on Growth and Diosgenin Production in Cell Suspension Culture of Dioscorea zingiberensis”, Journal Molecules, 16(11) 40 [67] Poornananda M Naik and Jameel M Al–Khayri (2016), Abiotic and Biotic Stress in Plants - Recent Advances and Future Perspectives, Publisher InTech [68] Ramachandra RS, Ravishankar GA (2002), “Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites”, Biotechnology Advances, 20, pp 101-153 [69] Rashid M, Kumar S, Bahar Ahmad Dr (2009), “Medicinal uses of Eurycoma longifolia: a review”, The Pharma Research (T Pharm Res.), pp 70-78 [70] Riksa Parikrama and Rizkita Rachmi Esyanti (2014), “Effect of UV Elicitation on Callus Growth, Alkaloid and Terpenoid Contents in Eurycoma longifolia Jack”, Journal of Advances in Chemical Engg., & Biological Sciences (IJACEBS), 1(1) [71] Shaheed Ur Rehman, Kevin Choe and Hye Hyun Yoo (2016), “Review on a Traditional Herbal Medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Its Traditional Uses, Chemistry, Evidence-Based Pharmacology and Toxicology”, J Molecules, 21 (331) [72] Sharma P, Yadav S, Srivastava A, Shrivastava N (2013), “Methyl jasmonate mediates upregulation of bacoside A production in shoot cultures of Bacopa monnieri”, Biotechnology Letters, 35, pp 1121–1125 [73] Sharma SN, Jhaa Z, Sinhab RK, and Gedac AK (2015), “Jasmonate–induced biosynthesis of andrographolide in Andrographis paniculata”, Physiologia Plantarum, 153, pp 221–229 [74] Shuid AN, Abu Bakar MF, Abdul Shukor TA, Muhammad N, Mohamed N, Soelaiman IN (2011), “The anti-asteoporotic effect of Eurycoma longifolia in aged orchidectomised rat model”, Aging Male, 14(3), pp 150-154 [75] Silja PK, Gisha GP, Satheeshkumar K (2014), “Enhanced plumbagin accumulation in embryogenic cell suspension cultures of Plumbago rosea L following elicitation”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 119, pp 469–477 [76] Sonja GS, Oliver T, Stéphane M, Alain D, Eric L, Claude J, and Daniel H (2015), “Polysaccharide elicitors enhance phenylpropanoid and naphtodianthrone production in cell suspension cultures of Hypericum perforatum”, Plant Cell Tissue and Organ Culture 41 [77] Stangarlin JR, Kuhn OJ, Assi L, Schwan–Estrada KRF (2011), “Control of plant diseases using extracts from medicinal plants and fungi” In: Mendez–Vilas A editor Science Against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances Formatex Research Center, Badajoz, Spain; p 1033–1042 [78] Taurino M, Ingrosso I, D’amico L, Domenico1 S D, Nicoletti I, Corradini D, Santino A, Giovinazzo G (2015), “Jasmonates elicit different sets of stilbenes in Vitis vinifera cv Negramaro cell cultures”, SpringerPlus, 4, pp 49 [79] Teh, C.H.; Abdulghani, M.; Morita, H.; Shiro, M.; Hussin, A.H.; Chan, K.L (2011),”Comparative X-Ray and conformational analysis of a New Crystal of 13α,21-Dihydroeurycomanone with Eurycomanone from Eurycoma longifolia and Their Anti-Estrogenic Activity Using the Uterotrophic Assay”, Planta Med, 77, pp 128–132 [80] Wang C, Wu J, Mei X (2001), “Enhancement of taxol production and excretion in Taxus chinensis cell culture by fungal elicitation and medium renewal”, Applied Microbiology and Biotechnology, 55, pp 404–410 [81] Wasternack C, Parthier B (1997), “Jasmonate–signalled plant gene expression”, Trends in Plant Science, 2, pp 302–307 [82] Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) “Tissue culture of Dioscorea doryophora Hance II Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin content”, Chinese Agronomy Journal, 4, pp 257-268 [83] Z Ismail, N Ismail, and J Lassa (1999), “Malaysian Herbal Monograph”, Malaysian Monograph Committee, [84] Zohreh Jalalpour , Leila Shabani, Ladan Afghani, Majid Sharifi-Tehrani, SayedAsadollah Amini (2014), “Stimulatory effect of methyl jasmonate and squalestatin on phenolic metabolism through induction of LOX activity in cell suspension culture of Yew”, Turkish Journal of Biology, 38, pp 76-82 42 PHỤ LỤC BẢNG THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG MS Stock Nồng độ Nồng độ Dung tích dùng cho (mg/L) (g/1000 mL) lít mơi trường KNO3 1900 95 KH2PO4 170 8,5 NH4NO3 1650 82,5 MgSO4.7H2O 370 18,5 CaCl2.2H2O 440 44 H3BO3 6,2 0,62 MnSO4.4H2O 22,3 1,69 CoCl2.6H2O 0,025 0,0025 CuSO4.5H2O 0,025 0,0025 ZnSO4.7H2O 8,6 1,06 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,025 KI 0,83 0,083 FeSO4.7H2O 27,8 2,78 Na – EDTA 37,3 4,09 Myo - inositol 100 10 Thiamine – HCl 0,1 0,01 Pyridoxine – HCl 0,5 0,05 Nicotinic axit 0,5 0,05 Glycine 0,2 Hóa chất MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 20 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL ... KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG THÁI THỊ MỸ DIỆU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY HỢP CHẤT EURYCOMANONE CỦA TẾ BÀO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI... tích lũy eurycomanone tế bào mật nhân nuôi cấy in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng lên khả tích lũy hoạt chất sinh học tế bào mật nhân nuôi cấy huyền phù theo giai đoạn sinh trưởng. .. ? ?Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng đến khả sinh trưởng tích lũy hợp chất eurycomanone tế bào mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy in vitro? ?? Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện kích kháng