Nghiên cứu tuyển chọn các chủng bacillus thuringiensis có khả năng kiểm soát rệp sáp (planococcus citri)

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ NGƠ HỒI NAM NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SỐT RỆP SÁP (PLANOCOCCUS CITRI) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Chun ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng - 2021 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ NGƠ HỒI NAM NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CĨ KHẢ NĂNG KIỂM SỐT RỆP SÁP (PLANOCOCCUS CITRI) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: ThS Lê Thị Mai Đà Nẵng - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan liệu trình bày khóa luận trung thực Đây kết nghiên cứu hướng dẫn Thạc sĩ Lê Thị Mai Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng chưa công bố công trình khác trước Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm vi phạm quy định đạo đức khoa học Tác giả khóa luận Ngơ Hồi Nam i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Mơi trường, trường Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình thực đề tài khóa luận Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngồi nỗ lực thân, tơi xin chân thành cảm ơn đến ThS Lê Thị Mai tận tình hướng dẫn, khích lệ, động viên định hướng cho tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn bạn 17CNSH đồng hành tôi, hỗ trợ nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ vật chất lẫn tinh thần để đạt kết tốt Xin chân thành cảm ơn! ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii TÓM TẮT x MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung .2 2.2 Mục tiêu cụ thể Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .4 1.1 Lịch sử phát Bacillus thuringiensis .4 1.2 Đặc điểm phân bố 1.3 Đặc điểm sinh lý Bacillus thuringiensis 1.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus thuringiensis 1.5 Phân loại gene độc tố Bacillus thuringiensis 1.6 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis 1.7 Cơ chế tác động protein tinh thể lên rệp 10 1.8 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B.thuringiensis giới Việt Nam 10 1.8.1 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis giới 10 1.8.2 Một số nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B.thuringiensis Việt Nam 12 1.9 Rệp sáp 13 iii CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 16 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis địa .16 2.2.3 Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 16 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa chủng Bacillus thuringiensis tuyển chọn 17 2.2.5 Phương pháp điện di protein tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis phân lập 19 2.2.6 Phương pháp thử nghiệm đánh giá khả kiểm soát rệp sáp (Planococcus citri) gây hại chủng Bacillus thuringiensis tuyển chọn 21 2.2.7 Phương pháp phân lập lại chủng vi khuẩn từ xác rệp chết 23 2.3 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tuyển chọn kỹ thuật sinh học phân tử 23 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp từ mẫu đất trồng hoa màu 25 3.2 Kết xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa vi khuẩn Bacillus thuringiensis giả định phân lập .28 3.3 Kết điện di protein tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập 33 3.4 Xác định hoạt tính kiểm sốt rệp (Planococcus citri) chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập 33 3.5 Kết phân lập lại chủng vi khuẩn từ thể rệp chết 36 3.6 Kết nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào chủng TA1 37 3.7 Kết định danh phương pháp khuếch đại vùng gene 16S rRNA 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 Kết luận 41 Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 iv PHỤ LỤC 44 Phụ lục Địa điểm lấy mẫu 44 Phụ lục Chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập 44 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT B.thuringiensis Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis cs cộng CT công thức DNA Deoxyribonucleic acid KL Khuẩn lạc KH - KT Khoa học – kỹ thuật NCBI National Center for Biotechnology Information P citri Planococcus citri PCR Polymerase Chain Reaction rRNA ribosome Ribonucleic acid vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Tiêu đề bảng Trang 1.1 Phân loại gene cry Bacillus thuringiensis 2.1 Thành phần gel polyacrylamide 20 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập 42oC 25 3.2 Kết thử nghiệm khả di động 28 3.3 Kết thử phản ứng catalase 30 3.4 Hoạt lực diệt rệp chủng vi khuẩn nghiên cứu 34 3.5 Khả sinh enzyme ngoại bào sản xuất hydro xyanua chủng TA1 vii 37 DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình vẽ Hình Trang 1.1 Hình ảnh bào tử tinh thể vi khuẩn B.thuringiensis 1.2 Tóm tắt phổ hoạt tính B.thuringiensis σ-endotoxins (Cry Cyt) 1.3 Hình ảnh mơ tả vịng đời rệp sáp (P citri) 15 2.1 Hình ảnh nhân ni rệp sáp bí ngơ 21 3.1 3.2 3.3 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tinh thể chủng TA1 (100X) Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tinh thể chủng CP (100X) Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tinh thể chủng M1 (100X) 27 27 27 3.4 Thử nghiệm khả di động chủng TA1, CP, M1 29 3.5 Thử nghiệm phản ứng oxidase chủng TA1, CP, M1 29 3.6 Thử nghiệm phản ứng catalase chủng TA1, CP, M1 30 3.7 Thử nghiệm phản ứng citrate chủng TA1, CP, M1 31 3.8 Thử nghiệm lên men đường chủng TA1, CP, M1 31 3.9 3.10 Thử nghiệm khả phân giải Urea chủng TA1, CP, M1 Hình ảnh điện di protein tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis TA1, CP, M1 32 33 3.11 Hoạt lực diệt rệp 03 chủng Bacillus thuringiensis 34 3.12 Đối chứng 35 3.13 Hình ảnh chủng Bt phân lập từ thể rệp chết 36 viii Kết thử phản ứng citrate Cấy ria vi khuẩn bề mặt ống thạch nghiêng có mơi trường Citrate Simmons chứa thị màu xanh Bromothymol, để tủ ấm 37oC Sau 24 cấy tiến hành đọc kết Thể hình Hình 3.7: Thử nghiệm phản ứng citrate chủng TA1, CP, M1 Màu xanh bromthymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương Như ba chủng TA1, CP, M1 có khả sử dụng citrat Kết thử phản ứng lên men đường Cấy chủng vi khuẩn vào mơi trường có thành phần gồm Phenol red carbohydrate broth (trypticase: 1%; NaCl: 0,5%; phenol đỏ: 0,018g/l; carbohydrate: 0,1% (glucose, sucrose, lactose…), nuôi 37ºC 24 - 48h CP Hình 3.8: Thử nghiệm lên men đường chủng TA1, CP, M1 31 Kết thử nghiệm khả phân giải Urea Cấy vi khuẩn vào 5ml môi trường Urea christensen, thị màu dùng môi trường phenol red, ủ 37oC Sau 24 – 48 tiến hành đọc kết quả, phản ứng dương tính mơi trường chuyển sang màu hồng cánh sen, phản âm tính môi trường không đổi màu (Nguyễn Lân Dũng et al., 2005) Kết thể hình Hình 3.9: Thử nghiệm khả phân giải Urea chủng TA1, CP, M1 Qua kết thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hóa 03 chủng Bacillus thuringiensis giả định cho thấy 03 chủng có phản ứng tích cực liên quan đến xét nghiệm catalase, oxidase, thử nghiệm khả di động, citrate, urea phân giải đường Cả ba chủng vi khuẩn sinh trưởng 42°C Như vậy, xét nghiệm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn thống với báo cáo Claus Berkeley (1986), khẳng định lần ba chủng tuyển chọn thuộc chi Bacillus 32 3.3 Kết điện di protein tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập CP M1 TA1 Hình 3.10: Hình ảnh điện di protein tinh thể độc chủng Bacillus thuringiensis TA1, CP, M1 SDS-PAGE sử dụng rộng rãi để so sánh cấu hình protein phân lập B.thuringiensis SDS-PAGE nghiên cứu dòng phân lập có chứa gen cry đặc hiệu Aphidicidal trình bày tinh thể để ước tính trọng lượng phân tử protein Cry Các chất phân lập có trọng lượng phân tử δ-endotoxin từ 35kDa, 70kDa 130 kDa.Các cấu hình protein dịng Bt Haggag Yousef (2010) phân biệt thành ba nhóm chính, nhóm I (28–58 KDa), nhóm II (60–80 KDa) nhóm II (125–150 KDa) Như vậy, 03 chủng Bt phân lập địa bao gồm ba nhóm 3.4 Xác định hoạt tính kiểm sốt rệp (Planococcus citri) chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập Để thử hoạt tính diệt sâu chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành nuôi cấy ba chủng vi khuẩn (TA1, M1, CP) môi trường Lysogeny broth nuôi 28ºC sau khoảng 72 để thu sinh khối Sau tiến hành xác định số lượng rệp chết sau 24, 48, 72 thử hoạt tính 33 Bảng 3.4: Hoạt lực diệt rệp chủng vi khuẩn nghiên cứu Tỉ lệ rệp chết (%) STT Kí hiệu chủng 24 48 72 M1 ± 0a ± 2a 56 ± 4a TA1 ± 0b 36.33 ± 5.5b 86.67 ± 4.61b CP ± 0c 12 ± 4c 73.33 ± 4.61c Đối chứng ± 0d ± 0d ± 0d Ban đầu Sau 48h Sau 72h Hình 3.11: Hoạt lực diệt rệp 03 chủng Bacillus thuringiensis 34 Hình 3.12: Đối chứng Từ Bảng 3.4, Hình 3.11 cho thấy, 03 chủng vi khuẩn Bt nghiên cứu có khả diệt rệp Trong 24 đầu tiên, rệp tiếp xúc với dịch nuôi cấy 03 chủng Bt di chuyển chậm, đoạn bụng bắt đầu xẹp xuống Sau 48 đến 72 giờ, rệp ngừng di chuyển, màu sắc chúng chuyển sang màu nâu, bụng chúng tăng kích thước hiển thị đốm đen đoạn bụng đầu tiên, thể chúng bị nước Màu tối kéo dài phía ngực sau Nhận thấy, 03 chủng Bt cho hoạt lực diệt rệp khác nhau, đó: - Chủng TA1 có hoạt lực diệt rệp mạnh nhất: sau 48 (36.33%); 72 (86.67%) - Chủng CP có hoạt lực diệt rệp yếu chủng TA1: sau 48 (12%); 72 (73.33%) - Chủng M1 có hoạt lực diệt rệp yếu chủng: 48 (6%); 72 (56%) - Tỷ lệ tử vong quan sát nghiệm thức đối chứng 0% Bt độc tố nguyên nhân gây chết rệp tiếp xúc, thay đổi thể chất quan sát nhiễm B.thuringiensis Các bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis xâm nhập vào rệp qua đường tiêu hóa Sau đó, protein Bacillus thuringiensis hoạt hóa tác động môi trường kiềm ruột rệp Độc tố hoạt hóa bám vào phân tử cảm thụ đặc biệt nằm màng vi thể tế bào thành ruột rệp Sự gắn kết ruột rệp làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành lỗ rị (kênh ion) Việc làm phá hủy 35 cân áp suất thẩm thấu màng tế bào, làm cho tế bào phồng lên chọc thủng ruột gây tổn thương làm chúng ngừng ăn Sau thời gian (vài đến vài ngày) rệp bị tiêu diệt Ngồi độc tố Bt có khả diệt rệp sáp, enzym thủy phân ngoại bào góp phần phân hủy lớp biểu bì rệp sáp bao quanh thể tạo điều kiện cho tinh thể xâm nhập vào thể rệp.Nhiều nghiên cứu enzym thủy phân ngoại bào liên quan đến lớp biểu bì thâm nhập tiêu hóa tế bào vật chủ protease, collagenase, lipase, chitinase, sáp phân hủy enzym (Niu et al., 2006) Mohamedova1, cs 2017, nghiên cứu ảnh hưởng Bacillus amyloliquefaciens A1, Paenibacillus polymyxa AB3 Providencia rettgeri K10 Citrus Mealybug, Planococcus citri (Risso) (Hemiptera: Pseudococcidae) thấy phân lập vi khuẩn, hiệu chúng để kiểm soát rệp sáp hại cam quýt, Planococcus citri (Risso) (Hemiptera: Pseudocoсcidae) Tất chủng vi khuẩn thử nghiệm cho thấy hiệu gần giống Các tỷ lệ chết ấu trùng trường hợp thứ B amyloliquefaciens A1, P rettgeri K10 P polymyxa AB3 gây đạt 84,29, 82,62 90,37% Các phân lập vi khuẩn thử nghiệm để sản xuất serinprotease (EC 3.4.21) metalloproteases (EC 3.4.24) 3.5 Kết phân lập lại chủng vi khuẩn từ thể rệp chết Sau thử nghiệm khả diệt rệp sáp chủng vi khuẩn phân lập được, rệp chết chọn ngẫu nhiên phân lập lại, ba khuẩn lạc riêng lẻ lấy ngẫu nhiên tăng sinh môi trường Lysogeny broth 72 30°C cấy vào môi trường đặc hiệu HiCrome™ Bacillus Agar - HiMedia Laboratories để kiểm chứng Kết hình dưới: Hình 3.13: Chủng Bt phân lập từ thể rệp chết 36 Khuẩn lạc phân lập có màu xanh đặc trưng cấy vào mơi trường đặc hiệu HiCrome™ Bacillus Agar - HiMedia Laboratories Vậy chủng Bacillus thuringiensis tác nhân gây chết rệp sáp Planococcus citri 3.6 Kết nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào chủng TA1 Khả sinh enzyme vi khuẩn xác định nhờ vào khả phân hủy chất làm đổi màu môi trường đặc hiệu xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn Kết nghiên cứu khả sinh enzyme ngoại bào chủng TA1 thể Bảng 3.5 Hình 3.14 Bảng 3.5: Khả sinh enzyme ngoại bào sản xuất hydro xyanua chủng TA1 Tên chủng TA1 Đường kính vịng phân giải (cm) Chitinase Protease Cellulase 2,0 ± 0,08 2,7 ± 0,14 1,24 ± 0,12 Từ Bảng 3.5 Hình 3.14 kết thu cho thấy chủng TA1 có khả phân giải chitin, cellulose, protease Trong đó, khả sinh protease cao nhất, đường kính vịng phân giải đạt 2,7 ± 0,14cm Hình 3.14: Đường kính vịng phân giải chitinase, protease cellulose chủng TA1 Qua kết cho thấy, chủng TA1 có hoạt lực diệt rệp cao có khả enzyme ngoại bào cao nên định chọn chủng TA1 để tiến hành định danh đến loài sinh học phân tử 37 3.7 Kết định danh phương pháp khuếch đại vùng gene 16S rRNA Sau phân lập tuyển chọn, chủng vi khuẩn TA1 định danh sơ thuộc chi Bacillus Nhằm định danh chúng đến tên loài, chọn phương pháp sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm tách chiết DNA tổng số, khuếch đại vùng gen sản phẩm PCR gửi công ty Khoa học – Kỹ thuật NEXT GENE ( TP.HCM ) để đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA Kết đọc trình tự 16s – rRNA so sánh ngân hàng gen NCBI để định danh loài TA1 Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết kiểm tra kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8% Kết trình bày hình 3.11 Hình 3.15: Hình ảnh điện di DNA tổng số chủng Bt TA1 Lượng DNA tổng số thu có chất lượng tốt (sạch bị đứt gãy) sử dụng làm DNA khuôn mẫu để khuếch đại vùng gene 16S rRNA Khuếch đại vùng gene 16S rRNA 38 Sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA kiểm tra kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8% Kết trình bày hình 3.12 Sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1500bp, khơng có sản phẩm phụ sử dụng để gửi đọc trình tự Hình 3.16: Khuếch đại vùng gene 16S rRNA chủng TA1 Đọc trình tự sản phẩm PCR Sản phẩm khuếch đại đọc trình tự Cơng ty TNHH Khoa học-Kỹ thuật NEXT GENE (TP.HCM) Trình tự 5’ – 3’ gene 16S rRNA: GTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG GGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGG CTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT AACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAA TAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC 39 CAGCACCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCG TAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAATTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAA CCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTG Sử dụng công cụ Blast web NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết sau: Hình 3.17: Kết tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn TA1 Chủng vi khuẩn TA1 có trình tự vùng gene 16S rRNA tương đồng 99.68% với chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki, cho phép kết luận chủng TA1 loài Bacillus thuringiensis Như vậy, qua bước định danh cấp độ lồi, nhóm nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (TA1) vi khuẩn loài Bacillus thuringiensis Đây bước tiền đề cho nghiên cứu loài 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trên sở kết thu được, rút kết luận sau đây: - Từ mẫu đất thu vùng trồng hoa màu thuộc thành phố Đà Nẵng phân lập 10 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus Trong có 3/10 chủng có khả sinh tinh thể độc Đó chủng TA1, CP M1; - Đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh hóa chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis giả định (TA1, CP, M1) Kết cho thấy chủng (TA1, CP, M1) lồi Bacillus thuringiensis; - Đã tiến hành phân tích tinh thể ký sinh Bacillus thuringiensis (TA1) SDSPAGE, xác định trọng lượng phân tử protein phù hợp với nghiên cứu trước - Đã chọn chủng TA1 dựa khả diệt rệp sáp (Planococcus citri) cao (86.67 ± 4.61%) Đây chủng tiềm làm tiền đề cho nghiên cứu - Kết định danh chủng vi khuẩn TA1 việc giải trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng có độ tương đồng 99.68% với lồi Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Kiến nghị Qua kết thu q trình nghiên cứu, tơi đưa số định hướng nghiên cứu tương lai sau: - Định danh sâu mặt di truyền chủng TA1 để xác định phổ diệt côn trùng gây hại cho trồng vườn trồng hoa màu địa bàn TP Đà Nẵng - Nghiên cứu tạo biến chủng vi khuẩn để nâng cao hoạt tính sinh học cho chủng phân lập 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ajuna, H B., Kim, I., Han, Y S., Maung, C E H., & Kim, K Y (2020) Aphicidal activity of Bacillus thuringiensis strain AH-2 against cotton aphid (Aphis gossypii) Entomological Research, 51(4), 151–160 Dương, P T., Bính, N Đ., Thu Hà, T T., & Khánh, L Đ (2018) Nghiên cứu biểu gen cry2a diệt ấu trùng ruồi nhà (musca domestica) chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki mss8.4 Vietnam Journal of Biotechnology, 15(3), 563–569 Ebert, T., Ebert, T A., & Cartwright, B (n.d.) Biology and ecology of Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae) Gobatto, V., Giani, S G., Camassola, M., Dillon, A J P., Specht, A., & Barros, N M (2010) Bacillus thuringiensis isolates entomopathogenic for Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) and Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) Brazilian Journal of Biology, 70(4), 10391046 Karacaolu, M., Yarpuzlu, F (2007) Turunỗgilde Biyolojik Mücadele Lecadet, M M., Chaufaux, J., Ribier, J., & Lereclus, D (1992) Construction of novel Bacillus thuringiensis strains with different insecticidal activities by transduction and transformation Applied and Environmental Microbiology, 58(3), 840–849 Minh, N Van (2011) Thực tập vi sinh sở 1996(2), 58–75 Ngơ Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đ V T (2010) Công bố khoa học Bài báo nước - 35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam Ngơ Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học.(n.d.) Retrieved May 10, 2021 Pardo-López, L., Soberón, M., & Bravo, A (2013) Bacillus thuringiensis insecticidal three-domain Cry toxins: Mode of action, insect resistance and consequences for crop protection In FEMS Microbiology Reviews (Vol 37, Issue 1, pp 3–22) FEMS Microbiol Rev Paul Vos, George Garrity, Dorothy Jones, Noel R Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A Rainey, Karl-Heinz Schleifer, W B W (n.d.) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes - Google Sách Retrieved May 10, 2021 Ramasamy, A., Suresh, M., & Mallesh, M S H (2020) Toxicity evaluation of Aphidicidal crystalliferous toxins from Bacillus thuringiensis strains: A molecular study Annals of Microbiology, 70(1), 1–14 Rosas-Garcia, N (2009) Biopesticide Production from Bacillus thuringiensis: An Environmentally Friendly Alternative Recent Patents on Biotechnology, 3(1), 28– 36 Sambrook, J and Russell, D (2001) Molecular cloning a laboratory manual Vol 2, 3rd edn Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York - References - Scientific 42 Research Publishing Sanahuja, G., Banakar, R., Twyman, R M., Capell, T., & Christou, P (2011) Bacillus thuringiensis: A century of research, development and commercial applications In Plant Biotechnology Journal (Vol 9, Issue 3, pp 283–300) Plant Biotechnol J Sharif, F A., & Alaeddinoĝlu, N G (1988) A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis Journal of Industrial Microbiology, 3(4), 227–229 Thu Hà, T T., Quyền, Đ V., & Bính, N Đ (2018) Biểu tinh chitinase từ Bacillus thuringiensis serovar kurstaki vi khuẩn escherichia coli Vietnam Journal of Biotechnology, 15(3), 571–579 Tphcm, H S P (n.d.) Phân Lập , Tuyển Chọn Chủng Bacillus Thuringiensis 49–58 Uribe, D., Martinez, W., & Cerón, J (2003) Distribution and diversity of cry genes in native strains of Bacillus thuringiensis obtained from different ecosystems from Colombia Journal of Invertebrate Pathology, 82(2), 119–127 Website https://www.wikipedia.org https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 43 PHỤ LỤC Phụ lục Địa điểm lấy mẫu Hình Lấy mẫu đất vườn trồng hoa màu, Thành phố Đà Nẵng Phụ lục Chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập Hình Chủng 3, 5, B1 mơi trường Lysogeny broth 44 Hình Chủng HPF, L, NCL2 môi trường Lysogeny broth Hình Chủng NL, NCP, TA1, M1 mơi trường Lysogeny broth 45 ... soát rệp sáp (Planococcus citri) gây hại chủng Bacillus thuringiensis tuyển chọn + Chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tinh thể độc sau trình tuyển chọn để tiến hành thử nghiệm khả kiểm sốt rệp sáp (Planococcus. .. cho nghiên cứu sâu ứng dụng sau Xuất phát từ lý tiến hành đề tài nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis có khả kiểm sốt rệp sáp (Planococcus citri)? ?? Với mong muốn tìm chủng. .. vi khuẩn Bacillus thuringiensis tuyển chọn Thử nghiệm khả kiểm sốt rệp sáp (Planococcus citri) trùng gây hại từ chủng phân lập Nội dung nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis