CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp điện di protein tinh thể độc của chủng Bacillus thuringiensis phân lập
lập được
Môi trường nuôi cấy lỏng của chủng TA1, CP, M1 được ly tâm ở 6000 vòng / phút, 4°C trong 10 phút và sinh khối thu được được rửa hai lần bằng cách huyền phù trong NaCl 1M chứa 0,01% triton X-100. Sau đó, sinh khối này được lơ lửng trong ống ly tâm 50mL với dung dịch muối, để tăng cường các tương tác kỵ nước. Dung môi hữu cơ (dietyl ete, diclometan hoặc hexan) được thêm vào với tỷ lệ nhỏ hơn hoặc bằng 10% (50, 75 hoặc 100 μL / mL huyền phù nước) để giảm thiểu nguy cơ biến đổi tinh thể. Huyền phù được siêu âm ở 100W trong 10 phút để giảm sự vón cục sau đó được ly tâm ở tốc độ 6000 vịng / phút trong 10 phút. Sinh khối thu được được ngâm lại trong dung dịch muối, dung mơi hữu cơ lại được thêm vào và quy trình tương tự được lặp lại ba đến bốn lần. Cuối cùng viên được rửa hai lần bằng nước cất lạnh.
20
SDS-PAGE được sử dụng rộng rãi để so sánh các cấu hình protein phân lập
B.thuringiensis. SDS-PAGE đã nghiên cứu các dịng phân lập có chứa các gen đặc hiệu
Aphidicidal biểu hiện các tinh thể để ước tính trọng lượng phân tử của các protein Cry. Protein từ hỗn hợp bào tử / tinh thể thu được theo quy trình được mơ tả bởi (Lecadet et al., 1992). Protein được lơ lửng trong một lượng nhỏ dung dịch muối đệm phosphat (136mM NaCl, 1,4 mM KH2PO4, 2,6 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 và 4,2 mL H2O, pH 7,4), và được phân đoạn bằng điện di trên gel SDS-PAGE 12% (Sambrook, J. and Russell, 2001)). Thành phần acrylamide trong gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của protein được điện di (Stefan, 2000). Bản gel được đổ hai lớp, lớp dưới là separating gel được đổ cách mặt trên 1,5 cm; để đông 30 phút, cài lược rồi đổ tiếp lớp stacking gel ở trên, để 30 phút cho gel đơng hồn tồn và ổn định. Bản gel sau đó được lắp vào hệ thống điện di BioRad.38
Chuẩn bị mẫu: Hút 15 µl dịch ni cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào và trộn đều với 15 µl loading dye 2X. Hỗn hợp được đưa vào gel điện di SDS-PAGE với stacking gel 5% và separating gel 12%.
Quá trình điện di sẽ chạy 2 lần:
- Lần 1 chạy với điện áp 100V trong 30 phút (khi mẫu chạy ra khỏi stacking gel).
- Lần 2 chạy với điện áp 80V trong 180 phút (khi mẫu chạy ra khỏi separating gel). Các chất phân lập có trọng lượng phân tử δ-endotoxin từ 13 đến 130 kDa, nhưng dạng điển hình nhất bao gồm các protein trọng lượng phân tử từ 50 đến 60 kDa.
21