Kết quả định danh bằng phương pháp khuếch đại vùng- 123docz.net

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.7. Kết quả định danh bằng phương pháp khuếch đại vùng gene 16S rRNA

Sau khi được phân lập và tuyển chọn, chủng vi khuẩn TA1 định danh sơ bộ thuộc chi Bacillus. Nhằm định danh chúng đến tên loài, chọn phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm tách chiết DNA tổng số, khuếch đại vùng gen và sản phẩm PCR được gửi tại công ty Khoa học – Kỹ thuật NEXT GENE ( TP.HCM ) để đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA. Kết quả đọc trình tự 16s – rRNA được so sánh trên ngân hàng gen NCBI để định danh loài TA1.

Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.11.

Lượng DNA tổng số thu được có chất lượng khá tốt (sạch và ít bị đứt gãy) được sử dụng làm DNA khuôn mẫu để khuếch đại vùng gene 16S rRNA.

Khuếch đại vùng gene 16S rRNA

Sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.12.

Sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1500bp, khơng có sản phẩm phụ được sử dụng để gửi đi đọc trình tự.

Đọc trình tự sản phẩm PCR

Sản phẩm khuếch đại được đọc trình tự tại Cơng ty TNHH Khoa học-Kỹ thuật NEXT GENE (TP.HCM).

Trình tự 5’ – 3’ của gene 16S rRNA:

GTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG GGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGG CTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT AACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAA TAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC

CAGCACCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCG TAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAATTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAA CCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTG

Sử dụng công cụ Blast trên web NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết quả như sau:

Hình 3.17: Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn TA1

Chủng vi khuẩn TA1 có trình tự vùng gene 16S rRNA tương đồng 99.68% với chủng

Bacillus thuringiensis serovar kurstaki, cho phép kết luận chủng TA1 là loài Bacillus thuringiensis.

Như vậy, qua bước định danh ở cấp độ lồi, nhóm nghiên cứu xác định được 1 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (TA1) là vi khuẩn loài Bacillus thuringiensis. Đây là bước đi đầu tiên tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về loài này

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận

Trên cơ sở các kết quả thu được, tôi rút ra những kết luận sau đây:

- Từ các mẫu đất thu được tại các vùng trồng cây hoa màu thuộc thành phố Đà Nẵng đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn là thuộc chi Bacillus. Trong đó có 3/10 chủng có khả năng sinh tinh thể độc. Đó là các chủng TA1, CP và M1;

- Đã tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sinh hóa của các chủng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis giả định (TA1, CP, M1). Kết quả cho thấy cả 3 chủng (TA1, CP, M1) đều là loài Bacillus thuringiensis;

- Đã tiến hành phân tích tinh thể ký sinh Bacillus thuringiensis (TA1) bằng SDS-

PAGE, xác định trọng lượng phân tử của protein phù hợp với các nghiên cứu trước đây. - Đã chọn được chủng TA1 dựa trên khả năng diệt rệp sáp (Planococcus citri) cao nhất (86.67 ± 4.61%). Đây là một chủng tiềm năng làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.

- Kết quả định danh chủng vi khuẩn TA1 bằng việc giải trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng này có độ tương đồng 99.68% với loài Bacillus thuringiensis serovar kurstaki.

2. Kiến nghị

Qua kết quả thu được trong q trình nghiên cứu, tơi đưa ra một số định hướng nghiên cứu trong tương lai như sau:

- Định danh sâu hơn về mặt di truyền của chủng TA1 để xác định được phổ diệt côn trùng gây hại cho cây trồng tại các vườn trồng cây hoa màu trên địa bàn TP. Đà Nẵng.

- Nghiên cứu tạo ra các biến chủng vi khuẩn để nâng cao hoạt tính sinh học cho các chủng phân lập được.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ajuna, H. B., Kim, I., Han, Y. S., Maung, C. E. H., & Kim, K. Y. (2020). Aphicidal activity of Bacillus thuringiensis strain AH-2 against cotton aphid (Aphis gossypii). Entomological Research, 51(4), 151–160.

Dương, P. T., Bính, N. Đ., Thu Hà, T. T., & Khánh, L. Đ. (2018). Nghiên cứu biểu hiện gen cry2a diệt ấu trùng ruồi nhà (musca domestica) của chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki mss8.4. Vietnam Journal of Biotechnology, 15(3), 563–569.

Ebert, T., Ebert, T. A., & Cartwright, B. (n.d.). Biology and ecology of Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)

Gobatto, V., Giani, S. G., Camassola, M., Dillon, A. J. P., Specht, A., & Barros, N. M. (2010). Bacillus thuringiensis isolates entomopathogenic for Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) and Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae). Brazilian

Journal of Biology, 70(4), 1039–1046.

Karacaoğlu, M., Yarpuzlu, F. (2007). Turunỗgilde Biyolojik Mỹcadele.

Lecadet, M. M., Chaufaux, J., Ribier, J., & Lereclus, D. (1992). Construction of novel

Bacillus thuringiensis strains with different insecticidal activities by transduction and

transformation. Applied and Environmental Microbiology, 58(3), 840–849. Minh, N. Van. (2011). Thực tập vi sinh cơ sở. 1996(2), 58–75.

Ngơ Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đ. V. T. (2010). Công bố khoa học -

Bài báo trong nước - 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis tại Việt Nam.

Ngơ Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học.(n.d.). Retrieved May 10, 2021. Pardo-López, L., Soberón, M., & Bravo, A. (2013). Bacillus thuringiensis insecticidal

three-domain Cry toxins: Mode of action, insect resistance and consequences for crop protection. In FEMS Microbiology Reviews (Vol. 37, Issue 1, pp. 3–22). FEMS

Microbiol Rev.

Paul Vos, George Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer, W. B. W. (n.d.). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes - Google Sách. Retrieved May 10, 2021.

Ramasamy, A., Suresh, M., & Mallesh, M. S. H. (2020). Toxicity evaluation of Aphidicidal crystalliferous toxins from Bacillus thuringiensis strains: A molecular study. Annals

of Microbiology, 70(1), 1–14.

Rosas-Garcia, N. (2009). Biopesticide Production from Bacillus thuringiensis: An

Environmentally Friendly Alternative. Recent Patents on Biotechnology, 3(1), 28–

36.

Sambrook, J. and Russell, D. . (2001). Molecular cloning a laboratory manual. Vol. 2, 3rd

Research Publishing.

Sanahuja, G., Banakar, R., Twyman, R. M., Capell, T., & Christou, P. (2011). Bacillus thuringiensis: A century of research, development and commercial applications. In

Plant Biotechnology Journal (Vol. 9, Issue 3, pp. 283–300). Plant Biotechnol J.

Sharif, F. A., & Alaeddinoĝlu, N. G. (1988). A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis. Journal of Industrial Microbiology, 3(4),

227–229.

Thu Hà, T. T., Quyền, Đ. V., & Bính, N. Đ. (2018). Biểu hiện và tinh sạch chitinase từ

Bacillus thuringiensis serovar kurstaki trong vi khuẩn escherichia coli. Vietnam Journal of Biotechnology, 15(3), 571–579.

Tphcm, H. S. P. (n.d.). Phân Lập , Tuyển Chọn Chủng Bacillus Thuringiensis. 49–58. Uribe, D., Martinez, W., & Cerón, J. (2003). Distribution and diversity of cry genes in

native strains of Bacillus thuringiensis obtained from different ecosystems from Colombia. Journal of Invertebrate Pathology, 82(2), 119–127.

Website

https://www.wikipedia.org

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Địa điểm lấy mẫu

Phụ lục 2. Chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập được

Hình 2. Chủng 3, 5, B1 trên mơi trường Lysogeny broth

Hình 3. Chủng HPF, L, NCL2 trên môi trường Lysogeny broth