CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Định danh chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh
học phân tử
+ Phương pháp tách chiết DNA tổng số
1: Pha tách chiết
1. Cho 100 µl mẫu vào ống eppendorf 1,5 ml. 2. Thêm 1 ml TRIzol. (vortex và spin down) 3. Giữ 5 phút ở nhiệt độ phịng.
4. Thêm 0,2 ml cloroform. (Đóng chặt nắp) 5. Vortex mạnh ống trong 15 giây.
6. Để ống ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
7. Ly tâm ống ở 12.000 vòng / phút trong 15 phút ở 4oC.
2: Kết tủa DNA
8. Hút dịch nổi (khoảng 300 ~ 400 µl) sang một ống mới. 9. Thêm 500 µl isopropanol.
10. Ủ ống ở nhiệt độ phịng trong 10 phút.
24
3: Rửa DNA
12. Loại bỏ dịch nổi phía trên. 13. Thêm 1ml etanol 75%. 14. Vortex ống.
15. Ly tâm ở 7.500 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC.
4: Hòa tan DNA
16. Bỏ phần dịch nổi phía trên.
17. Làm khơ DNA trong 10 phút ở nhiệt độ phịng. 18. Thêm 20 ~ 50 µl nước đã qua xử lý DEPC. 19. Hòa tan DNA nhẹ nhàng bằng pipet.
20. (Ủ dung dịch DNA trong 10 phút ở 60oC khi cần thiết)
+ Sản phẩm PCR được tinh chế và gửi giải trình tự tại Cơng ty TNHH Khoa học – Kỹ thuật NEXT GENE (TP.HCM). Sử dụng công cụ BLAST trên website NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết quả.
Thành phần phản ứng PCR: PCR buffer 10X (có chứa Mg2+) 2,5µl; dNTPs (100mM) 2,5µl; mồi xi 27F 1µl; mồi ngược 1492R 1µl, Taq polymerase 0,2µl; DNA 1µl; DH2O 15,8 µl; Tổng thể tích 25µl.
Trình tự cặp mồi: 27F: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 1492R: 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT -3’
Chu trình nhiệt độ: Biến tính ban đầu ở 94°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 53°C trong 30 giây, kéo dài sợi ở 72°C trong 2 phút; và giai đoạn kết thúc ở 72°C trong 15 phút (Nguyễn Thiện Phú, Trần Thanh Thủy, 2013).
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm SPSS với độ tin cậy 95%. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng (M ± SD).
25