Kết quả điện di protein tinh thể độc của chủng Bac- 123docz.net

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.3. Kết quả điện di protein tinh thể độc của chủng Bacillus thuringiensis giả định phân

phân lập được

SDS-PAGE được sử dụng rộng rãi để so sánh các cấu hình protein phân lập

B.thuringiensis . SDS-PAGE đã nghiên cứu các dịng phân lập có chứa các gen cry đặc

hiệu Aphidicidal trình bày các tinh thể để ước tính trọng lượng phân tử của các protein Cry. Các chất phân lập có trọng lượng phân tử δ-endotoxin từ 35kDa, 70kDa và 130 kDa.Các cấu hình protein của dịng Bt được Haggag và Yousef (2010) phân biệt thành ba nhóm chính, nhóm I (28–58 KDa), nhóm II (60–80 KDa) và nhóm II (125–150 KDa). Như vậy, 03 chủng Bt phân lập bản địa bao gồm cả ba nhóm trên.

3.4. Xác định hoạt tính kiểm sốt rệp (Planococcus citri) của các chủng Bacillus

thuringiensis giả định phân lập được

Để thử hoạt tính diệt sâu của các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy ba chủng vi khuẩn (TA1, M1, CP) trên môi trường Lysogeny broth nuôi ở 28ºC sau khoảng 72 giờ để thu sinh khối. Sau đó tiến hành xác định số lượng rệp chết sau 24, 48, 72 giờ thử hoạt tính.

Hình 3.10: Hình ảnh điện di protein tinh thể độc của các chủng Bacillus

thuringiensis TA1, CP, M1

Bảng 3.4: Hoạt lực diệt rệp của các chủng vi khuẩn nghiên cứu

STT Kí hiệu chủng Tỉ lệ rệp chết (%)

24 giờ 48 giờ 72 giờ

1 M1 0 ± 0a 6 ± 2a 56 ± 4a

2 TA1 0 ± 0b 36.33 ± 5.5b 86.67 ± 4.61b

3 CP 0 ± 0c 12 ± 4c 73.33 ± 4.61c

4 Đối chứng 0 ± 0d 0 ± 0d 0 ± 0d

Hình 3.11: Hoạt lực diệt rệp của 03 chủng Bacillus thuringiensis

Ban đầu Sau 48h

Hình 3.12: Đối chứng

Từ Bảng 3.4, Hình 3.11 cho thấy, cả 03 chủng vi khuẩn Bt nghiên cứu đều có khả năng diệt rệp. Trong 24 giờ đầu tiên, những con rệp tiếp xúc với dịch nuôi cấy của 03 chủng Bt di chuyển chậm, các đoạn bụng bắt đầu xẹp xuống. Sau 48 đến 72 giờ, rệp ngừng di chuyển, màu sắc của chúng chuyển sang màu nâu, bụng chúng tăng kích thước và hiển thị các đốm đen trên các đoạn bụng đầu tiên, và cơ thể chúng bị mất nước. Màu

tối kéo dài về phía ngực sau. Nhận thấy, 03 chủng Bt cho hoạt lực diệt rệp khác nhau,

trong đó:

- Chủng TA1 có hoạt lực diệt rệp mạnh nhất: sau 48 giờ (36.33%); 72 giờ (86.67%) - Chủng CP có hoạt lực diệt rệp yếu hơn chủng TA1: sau 48 giờ (12%); 72 giờ (73.33%)

- Chủng M1 có hoạt lực diệt rệp yếu nhất trong 3 chủng: 48 giờ (6%); 72 giờ (56%). - Tỷ lệ tử vong quan sát được ở nghiệm thức đối chứng luôn là 0%

Bt độc tố là nguyên nhân gây ra cái chết của rệp tiếp xúc, và những thay đổi thể chất

quan sát được là do nhiễm B.thuringiensis. Các bào tử và tinh thể Bacillus thuringiensis

xâm nhập vào rệp qua đường tiêu hóa. Sau đó, protein Bacillus thuringiensis được hoạt hóa dưới tác động của môi trường kiềm trong ruột rệp. Độc tố đã hoạt hóa bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột rệp. Sự gắn kết này ở ruột rệp làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành các lỗ rò (kênh ion). Việc này làm phá hủy

cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho tế bào phồng lên và chọc thủng ruột giữa gây ra sự tổn thương làm chúng ngừng ăn. Sau một thời gian (vài giờ đến vài ngày) rệp sẽ bị tiêu diệt.

Ngoài độc tố của Bt có khả năng diệt rệp sáp, các enzym thủy phân ngoại bào góp phần phân hủy lớp biểu bì của rệp sáp bao quanh cơ thể tạo điều kiện cho tinh thể xâm nhập vào cơ thể rệp.Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các enzym thủy phân ngoại bào liên quan đến lớp biểu bì thâm nhập và tiêu hóa tế bào vật chủ là protease, collagenase, lipase, chitinase, cũng như sáp phân hủy enzym (Niu et al., 2006).

Mohamedova1, và cs 2017, khi nghiên cứu ảnh hưởng của Bacillus amyloliquefaciens A1, Paenibacillus polymyxa AB3 và Providencia rettgeri K10 trên Citrus Mealybug, Planococcus citri (Risso) (Hemiptera: Pseudococcidae) thấy rằng các

phân lập vi khuẩn, hiệu quả của chúng để kiểm soát rệp sáp hại cam quýt, Planococcus citri (Risso) (Hemiptera: Pseudocoсcidae). Tất cả các chủng vi khuẩn được thử nghiệm

cho thấy hiệu quả gần như giống nhau. Các tỷ lệ chết của ấu trùng trường hợp thứ nhất do B. amyloliquefaciens A1, P. rettgeri K10 và P. polymyxa AB3 gây ra đạt lần lượt là 84,29, 82,62 và 90,37%. Các phân lập vi khuẩn được thử nghiệm để sản xuất serinprotease (EC 3.4.21) và metalloproteases (EC 3.4.24).

3.5. Kết quả phân lập lại chủng vi khuẩn từ cơ thể rệp chết

Sau khi thử nghiệm khả năng diệt rệp sáp của 3 chủng vi khuẩn phân lập được, 5 con rệp chết được chọn ngẫu nhiên và phân lập lại, ba khuẩn lạc riêng lẻ được lấy ngẫu nhiên và tăng sinh trong môi trường Lysogeny broth trong 72 giờ ở 30°C và được cấy vào môi trường đặc hiệu HiCrome™ Bacillus Agar - HiMedia Laboratories để kiểm chứng. Kết quả như hình dưới:

Khuẩn lạc phân lập được có màu xanh đặc trưng khi cấy vào môi trường đặc hiệu

HiCrome™ Bacillus Agar - HiMedia Laboratories. Vậy chủng Bacillus thuringiensis chính là tác nhân gây chết ở rệp sáp Planococcus citri.

3.6. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng TA1

Khả năng sinh enzyme của vi khuẩn được xác định nhờ vào khả năng phân hủy các cơ chất và làm đổi màu môi trường đặc hiệu xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng TA1 được thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.14

Từ Bảng 3.5 và Hình 3.14 kết quả thu được cho thấy chủng TA1 có khả năng phân giải chitin, cellulose, protease. Trong đó, khả năng sinh protease là cao nhất, đường kính vịng phân giải đạt 2,7 ± 0,14cm.

Qua các kết quả trên cho thấy, chủng TA1 có hoạt lực diệt rệp cao nhất và cũng có khả năng các enzyme ngoại bào cao nên chúng tôi quyết định chọn chủng TA1 để tiến hành định danh đến loài bằng sinh học phân tử.

Tên chủng Đường kính vịng phân giải (cm)

TA1

Chitinase Protease Cellulase

2,0 ± 0,08 2,7 ± 0,14 1,24 ± 0,12

Hình 3.14: Đường kính vịng phân giải chitinase, protease và cellulose của

chủng TA1

3.7. Kết quả định danh bằng phương pháp khuếch đại vùng gene 16S rRNA

Sau khi được phân lập và tuyển chọn, chủng vi khuẩn TA1 định danh sơ bộ thuộc chi Bacillus. Nhằm định danh chúng đến tên loài, chọn phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, bao gồm tách chiết DNA tổng số, khuếch đại vùng gen và sản phẩm PCR được gửi tại công ty Khoa học – Kỹ thuật NEXT GENE ( TP.HCM ) để đọc trình tự đoạn gen 16S – rRNA. Kết quả đọc trình tự 16s – rRNA được so sánh trên ngân hàng gen NCBI để định danh loài TA1.

Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.11.

Lượng DNA tổng số thu được có chất lượng khá tốt (sạch và ít bị đứt gãy) được sử dụng làm DNA khuôn mẫu để khuếch đại vùng gene 16S rRNA.

Khuếch đại vùng gene 16S rRNA

Sản phẩm khuếch đại vùng gene 16S rRNA được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose 0,8%. Kết quả được trình bày ở hình 3.12.

Sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1500bp, khơng có sản phẩm phụ được sử dụng để gửi đi đọc trình tự.

Đọc trình tự sản phẩm PCR

Sản phẩm khuếch đại được đọc trình tự tại Cơng ty TNHH Khoa học-Kỹ thuật NEXT GENE (TP.HCM).

Trình tự 5’ – 3’ của gene 16S rRNA:

GTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCG GGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGG CTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT AACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA GGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAA TAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC

CAGCACCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCG TAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAATTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAA CCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTG

Sử dụng công cụ Blast trên web NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết quả như sau:

Hình 3.17: Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn TA1

Chủng vi khuẩn TA1 có trình tự vùng gene 16S rRNA tương đồng 99.68% với chủng

Bacillus thuringiensis serovar kurstaki, cho phép kết luận chủng TA1 là loài Bacillus thuringiensis.

Như vậy, qua bước định danh ở cấp độ lồi, nhóm nghiên cứu xác định được 1 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus (TA1) là vi khuẩn loài Bacillus thuringiensis. Đây là bước đi đầu tiên tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về loài này

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận

Trên cơ sở các kết quả thu được, tôi rút ra những kết luận sau đây:

- Từ các mẫu đất thu được tại các vùng trồng cây hoa màu thuộc thành phố Đà Nẵng đã phân lập được 10 chủng vi khuẩn là thuộc chi Bacillus. Trong đó có 3/10 chủng có khả năng sinh tinh thể độc. Đó là các chủng TA1, CP và M1;

- Đã tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sinh hóa của các chủng vi khuẩn

Bacillus thuringiensis giả định (TA1, CP, M1). Kết quả cho thấy cả 3 chủng (TA1, CP, M1) đều là loài Bacillus thuringiensis;

- Đã tiến hành phân tích tinh thể ký sinh Bacillus thuringiensis (TA1) bằng SDS-

PAGE, xác định trọng lượng phân tử của protein phù hợp với các nghiên cứu trước đây. - Đã chọn được chủng TA1 dựa trên khả năng diệt rệp sáp (Planococcus citri) cao nhất (86.67 ± 4.61%). Đây là một chủng tiềm năng làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.

- Kết quả định danh chủng vi khuẩn TA1 bằng việc giải trình tự gene 16S rRNA cho thấy chủng này có độ tương đồng 99.68% với lồi Bacillus thuringiensis serovar kurstaki.

2. Kiến nghị

Qua kết quả thu được trong q trình nghiên cứu, tơi đưa ra một số định hướng nghiên cứu trong tương lai như sau:

- Định danh sâu hơn về mặt di truyền của chủng TA1 để xác định được phổ diệt côn trùng gây hại cho cây trồng tại các vườn trồng cây hoa màu trên địa bàn TP. Đà Nẵng.

- Nghiên cứu tạo ra các biến chủng vi khuẩn để nâng cao hoạt tính sinh học cho các chủng phân lập được.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ajuna, H. B., Kim, I., Han, Y. S., Maung, C. E. H., & Kim, K. Y. (2020). Aphicidal activity of Bacillus thuringiensis strain AH-2 against cotton aphid (Aphis gossypii). Entomological Research, 51(4), 151–160.

Dương, P. T., Bính, N. Đ., Thu Hà, T. T., & Khánh, L. Đ. (2018). Nghiên cứu biểu hiện gen cry2a diệt ấu trùng ruồi nhà (musca domestica) của chủng Bacillus thuringiensis serovar kurstaki mss8.4. Vietnam Journal of Biotechnology, 15(3), 563–569.

Ebert, T., Ebert, T. A., & Cartwright, B. (n.d.). Biology and ecology of Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)

Gobatto, V., Giani, S. G., Camassola, M., Dillon, A. J. P., Specht, A., & Barros, N. M. (2010). Bacillus thuringiensis isolates entomopathogenic for Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) and Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae). Brazilian

Journal of Biology, 70(4), 1039–1046.

Karacaoğlu, M., Yarpuzlu, F. (2007). Turunỗgilde Biyolojik Mỹcadele.

Lecadet, M. M., Chaufaux, J., Ribier, J., & Lereclus, D. (1992). Construction of novel

Bacillus thuringiensis strains with different insecticidal activities by transduction and

transformation. Applied and Environmental Microbiology, 58(3), 840–849. Minh, N. Van. (2011). Thực tập vi sinh cơ sở. 1996(2), 58–75.

Ngơ Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đ. V. T. (2010). Công bố khoa học -

Bài báo trong nước - 35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis tại Việt Nam.

Ngơ Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học.(n.d.). Retrieved May 10, 2021. Pardo-López, L., Soberón, M., & Bravo, A. (2013). Bacillus thuringiensis insecticidal

three-domain Cry toxins: Mode of action, insect resistance and consequences for crop protection. In FEMS Microbiology Reviews (Vol. 37, Issue 1, pp. 3–22). FEMS

Microbiol Rev.

Paul Vos, George Garrity, Dorothy Jones, Noel R. Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A. Rainey, Karl-Heinz Schleifer, W. B. W. (n.d.). Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes - Google Sách. Retrieved May 10, 2021.

Ramasamy, A., Suresh, M., & Mallesh, M. S. H. (2020). Toxicity evaluation of Aphidicidal crystalliferous toxins from Bacillus thuringiensis strains: A molecular study. Annals

of Microbiology, 70(1), 1–14.

Rosas-Garcia, N. (2009). Biopesticide Production from Bacillus thuringiensis: An

Environmentally Friendly Alternative. Recent Patents on Biotechnology, 3(1), 28–

36.

Sambrook, J. and Russell, D. . (2001). Molecular cloning a laboratory manual. Vol. 2, 3rd

Research Publishing.

Sanahuja, G., Banakar, R., Twyman, R. M., Capell, T., & Christou, P. (2011). Bacillus thuringiensis: A century of research, development and commercial applications. In

Plant Biotechnology Journal (Vol. 9, Issue 3, pp. 283–300). Plant Biotechnol J.

Sharif, F. A., & Alaeddinoĝlu, N. G. (1988). A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis. Journal of Industrial Microbiology, 3(4),

227–229.

Thu Hà, T. T., Quyền, Đ. V., & Bính, N. Đ. (2018). Biểu hiện và tinh sạch chitinase từ

Bacillus thuringiensis serovar kurstaki trong vi khuẩn escherichia coli. Vietnam Journal of Biotechnology, 15(3), 571–579.

Tphcm, H. S. P. (n.d.). Phân Lập , Tuyển Chọn Chủng Bacillus Thuringiensis. 49–58. Uribe, D., Martinez, W., & Cerón, J. (2003). Distribution and diversity of cry genes in

native strains of Bacillus thuringiensis obtained from different ecosystems from Colombia. Journal of Invertebrate Pathology, 82(2), 119–127.

Website

https://www.wikipedia.org

PHỤ LỤC Phụ lục 1. Địa điểm lấy mẫu

Phụ lục 2. Chủng Bacillus thuringiensis giả định phân lập được

Hình 2. Chủng 3, 5, B1 trên mơi trường Lysogeny broth

Hình 3. Chủng HPF, L, NCL2 trên môi trường Lysogeny broth