CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Phương pháp thử nghiệm đánh giá khả năng kiểm soát rệp sáp (Planococcus citri)
gây hại của chủng Bacillus thuringiensis tuyển chọn
+ Chọn ra chủng vi khuẩn có khả năng sinh ra tinh thể độc sau quá trình tuyển chọn để tiến hành thử nghiệm khả năng kiểm soát rệp sáp (Planococcus citri) gây hại.
+ Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn trong môi trường Lysogeny broth lỏng ở máy lắc 180 vòng/phút trong 16 giờ.
+ Rệp sáp thu ở ngồi tự nhiên và nhân ni rệp sáp trong phịng thí nghiệm: Theo phương pháp nhân ni của Quách Thị Ngọ và cs., (2004). Rệp sáp là loài đa thực nên khi nhân ni trong phịng thí nghiệm với số lượng lớn tiến hành nhân ni trên củ khoai tây hoặc trên thân và lá của cây cà chua.
+ Phương pháp nhiễm rệp sáp lên quả bí đỏ: Quần thể Planococcus citri ban đầu được thu thập từ cây cà chua, cây ăn quả có múi bị nhiễm bệnh từ các vườn trồng cây hoa màu trên địa bàn TP. Đà Nẵng. Các bộ phận bị nhiễm bệnh của cây được chuyển đến phịng thí nghiệm và đặt trên quả bí đỏ. Ấu trùng đầu tiên di chuyển từ lá khơ sang quả bí. Quy trình này giúp giảm thiểu nguy cơ tổn thương cơ thể của rệp sáp (Hogendrop và cộng sự, 2006). Để tạo ra một quần thể ấu trùng P. citri đồng nhất cho các thí nghiệm về độc lực, quy trình này được lặp lại nhiều lần và 3 thế hệ rệp sáp đã được hình thành. (Mohamedova1 et al., 2017)
22
a. Phương pháp xác định mật độ bào tử
Cấy trang các chủng Bacillus thuringiensis giả định ra từng đĩa môi trường Lysogeny broth riêng rẽ, nuôi ở 28ºC sau khoảng 72 giờ để thu sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được xử lý ở 80ºC trong 10 phút, sau đó pha lỗng đến nồng độ 10-9. Lấy 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng cấy trang trên đĩa petri chứa môi trường Lysogeny broth. Nuôi ở 28ºC trong 24 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. Số lượng bào tử được tính theo cơng thức:
CFU = n.a.10
Trong đó:
CFU : số lượng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy
n : số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha lỗng
a : nồng độ pha loãng.
b. Đánh giá khả năng kiểm soát rệp của các chủng Bacillus sp. phân lập được
+ Thí nghiệm được tiến hành với 4 cơng thức:
CT1 : 25 con rệp + 10ml TA1 (107 cfu/ml) CT2 : 25 con rệp + 10ml NCP (107 cfu/ml) CT3 : 25 con rệp + 10ml M1 (107 cfu/ml) Đối chứng : 25 con rệp
Hiệu lực diệt cơn trùng của nấm gây bệnh hiện tính bằng công thức Abbot (1925).
M (%) = (C-T)/C
Trong đó:
C : Tỷ lệ cơn trùng cịn sống ở cơng thức đối chứng T : Tỷ lệ cơn trùng sống sót ở cơng thức xử lý nấm. M : Tỷ lệ côn trùng chết sau khi phun thuốc.
23