CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus thuringiensis tuyển
tuyển chọn
+ Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: Tiến hành tuyển chọn Bacillus thuringiensis bằng cách nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc. Các chủng Bacillus thuringiensis giả định được thử nghiệm về khả năng tăng trưởng ở 42oC. Sự tăng trưởng được ghi nhận bằng trực quan. Theo Fadel 1998, các vi khuẩn Bacillus thuringiensis bị mất khả năng sản xuất tinh thể độc khuẩn lạc thường có màu trắng đục với các cạnh mịn, vi khuẩn khơng có khả năng sinh bào tử và tinh thể các khuẩn lạc đều trong mờ. Khuẩn lạc của vi khuẩn Bacillus thuringiensis hoang dã có khả năng sinh bào tử và tinh thể có màu trắng sữa và bị lõm với
các cạnh thơ
+ Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử và tinh thể: Tiến hành nuôi cấy các chủng trên môi trường Lysogeny broth ở 30oC khoảng 48 – 72 giờ. Sau đó làm tiêu bản nhuộm với thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue trong 3 phút để quan sát hình dạng tế bào, tinh thể và bào tử dưới kính hiển vi quang học. Khi quan sát bằng kính hiển vi, các tinh thể được giải phóng có thể phân biệt với các bào tử vì chúng nhuộm màu xanh dương và hiển thị hình cầu hoặc hình dạng quả trám độc đáo, trong khi các bào tử vẫn khơng bắt màu hình elip. Tế bào sinh dưỡng xuất hiện dưới dạng hình que bắt màu xanh của thuốc nhuộm.
+ Thử nghiệm khả năng di động:
Nguyên tắc: phát hiện khả năng di chuyển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy nhờ roi và vi mao.
Cách tiến hành: cấy đâm sâu sinh khối vào trong thạch mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37oC từ 18 - 24h. Dương tính: vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy và làm đục mơi trường xung quanh. Âm tính: vi sinh vật chỉ mọc quanh đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong. Bacillus thuringiensis thường cho kết quả dương tính.
+ Thử nghiệm oxidase:
18
Cách tiến hành: Nhỏ vài giọt thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% trên giấy lọc đã được khử trùng trên một lam kính sạch. Dùng que thủy tinh vơ trùng lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cọ lên vùng thuốc thử trên giấy lọc. Nếu chuyển qua màu xanh dương hay tím sẫm cho kết quả dương tính, vi khuẩn có sinh các cytochrome oxidases, nếu không đổi màu cho kết quả âm tính. Bacillus thuringiensis
thường cho kết quả dương tinh (Minh, 2011). + Thử nghiệm catalase:
Nguyên tắc: Phát hiện enzyme catalase của vi sinh vật, catalase thủy phân hydrogene peroxide (H2O2) thành H2O và O2.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc thuần đặt lên một lam kính sạch. Nhỏ vài giọt hydrogene peroxide (H2O2) 0,3% lên sinh khối vi khuẩn trên lam kính. Việc sủi bọt khí từ các mẫu cho thấy thử nghiệm catalase dương tính, khơng sủi bọt cho kết quả âm tính.
Bacillus thuringiensis thường cho kết quả dương tinh (Minh, 2011).
+ Thử nghiệm citrate
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng sử dụng citrate trong MT có Na.citrate làm nguồn cacbon duy nhất của các chủng CK. Khi sử dụng citrate chúng giải phóng ra MT ion Na+ làm tăng pH của MT. Đồng thời VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon thì cũng có khả năng sử dụng muối amonium vơ cơ NH4H2PO4 làm nguồn nitơ tạo ra NH3 cũng làm kiềm hóa MT, sự thay đổi pH của MT cũng được nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromthymol blue.
Cấy ria vi khuẩn trên bề mặt ống thạch nghiêng có mơi trường Citrate Simmons chứa chỉ thị màu xanh Bromothymol, để ở tủ ấm 37oC. Sau 24 giờ vi khuẩn sử dụng citrate để phát triển và do đó làm kiềm hóa mơi trường. Nếu mơi trường chuyển từ màu cỏ úa (xanh lá cây) sang màu xanh dương là phản ứng dương tính. Nếu mơi trường giữ ngun màu xanh cỏ úa (xanh lá cây) phản ứng âm tính
Phản ứng dương tính: xanh bromthymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương. Phản ứng âm tính: xanh bromthymol vẫn giữ nguyên màu (Minh, 2011).
19
Cấy chủng vi khuẩn vào mơi trường có thành phần gồm Phenol red carbohydrate broth (trypticase: 1%; NaCl: 0,5%; phenol đỏ: 0,018g/l; carbohydrate: 0,1% (glucose, sucrose, lactose…), nuôi ở 37ºC/24-48h, vi sinh vật sử dụng nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH, thay đổi màu chất chỉ thị phenol đỏ. Kết quả: (+): môi trường chuyển vàng; (-): mơi trường có màu đỏ (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000), (Saadeldin Mudawi Osman Mudawi, 2007).
+ Thử nghiệm khả năng phân giải Urea
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng phân giải urê thành NH3 của các chủng VK, do có khả năng tổng hợp enzyme urease. Sự phó thích NH3 làm tăng pH MT và có thể theo dõi qua sự đổi màu của chất chỉ thị.
Cấy vi khuẩn vào 5ml môi trường urea christensen, chỉ thị màu dùng trong môi trường là phenol red, ủ 37oC. Sau 24 – 48 giờ tiến hành đọc kết quả, phản ứng dương tính khi mơi trường chuyển sang màu hồng cánh sen, phản âm tính khi mơi trường khơng đổi màu (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2000), (Saadeldin Mudawi Osman Mudawi, 2007).