Nghiên cứu chế phẩm vi sinh có khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy (ahpns) từ tôm thẻ nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM VI SINH CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY (AHPNS) TỪ TÔM THẺ Sinh viên thực hiện: Đào Phương Anh Thư Nguyễn Văn Có Ngơ Lập Vinh Vũ Thị Thùy Trang Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh TP Hồ Chí Minh, 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 TÌNH HÌNH TƠM NI TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 12 1.1.1 Tình hình tơm ni Thế giới 12 1.1.2 Tình hình tơm ni Việt Nam 13 1.2 BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY EMS/AHPNS TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG 15 1.2.3.1 Phân loại 18 1.2.3.2 Đặc điểm sinh học 18 1.2.3.3 Cơ chế gây bệnh 20 1.2.4.1 Phân loại 20 1.2.4.2 Nguồn gốc phân bố 20 1.2.4.3 Hình thái cấu trúc 21 1.2.4.4 Tập tính sinh sống 21 1.2.4.5 Đặc điểm dinh dƣỡng 21 1.2.4.6 Sinh sản 22 1.3 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus 22 1.3.1 Phân loại 22 1.3.2 Dinh dƣỡng phát triển Bacillus 23 1.3.3 Nhiệt độ phát triển 24 1.3.4 Quá trình tạo bào tử Bacillus 24 1.3.5 Ứng dụng vi khuẩn Bacillus 25 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 29 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 29 2.1.1.1 Mẫu tôm bệnh 29 2.1.1.2 Tôm dùng để thử nghiệm 29 2.1.2 Mơi trƣờng – Hóa chất 30 2.1.3 Thiết bị - Dụng cụ 30 2.1.3.1 Thiết bị 30 2.1.3.2 Dụng cụ 30 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.3.1 Thu nhận phân lập mẫu tôm bệnh 32 2.3.2 Sàng lọc sơ chủng vi khuẩn V.parahaemolyticus có khả gây bệnh mạnh tơm thẻ chân trắng 33 2.3.3 Gây cảm nhiễm lên tôm bệnh để xác định khả gây bệnh (LD50) 34 2.3.4 Phƣơng pháp định danh vi khuẩn 36 2.3.4.1 Indol 36 2.3.4.2 Nitrate 37 2.3.4.3 Citrate: 38 2.3.4.4 Voges – Proskauer (VP) 38 2.3.4.5 Thử nghiệm Methyl Red (MR) 39 2.3.4.6 Khả phân giải Gelatine 40 2.3.4.7 Xác định khả di động 41 2.3.4.8 Khả phát triển NaCl 0%, 1%, 6%, 8% 41 2.3.5 Tái phân lập chủng B Polyfermenticus F27 42 2.3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chủng B Polyfermenticus F27 phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch 42 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus 48 3.2 TÁI PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN Bacillus polyfermenticus F27 59 3.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Vibrio paraheamolyticus CỦA CHỦNG Bacillus polyfermenticus F27 BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH 60 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 4.1 KẾT LUẬN 62 4.2 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 71 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt Cs Cộng NN&PTNT Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn PTN Phịng thí nghiệm Tiếng Anh AHPNS Acute hepatopancreatic necrosis syndrome EMS Early Mortality Syndrome FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations GOAL Global Outlook for Aquaculture Leadership TCBS Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar FCR Feed Conversion Ratio NB Nutrient Broth NA Nutrient Agar CFU Colony forming unit TSB Trypto-casein Soy Broth KIA Kligler Iron Agar DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích, sản lƣợng suất tơm thẻ chân trắng qua năm 14 Bảng 2.1 Số lƣợng địa điểm thu nhận mẫu 29 Bảng 2.2 Bố trí nghiệm thức 34 Bảng 2.3 Bố trí nghiệm thức 35 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định khả gây bệnh (LD50) 36 Bảng 3.1 Ký hiệu tên chủng 48 Bảng 3.2 Kết nhuộm Gram 56 chủng Vibrio sp phân lập từ mẫu tôm bệnh 48, 49, 50, 51 Bảng 3.3 Kết khảo sát LD50 chủng Vibrio sp NH3.3a 52 Bảng 3.4 Kết khảo sát LD50 chủng Vibrio sp KH2.5 52 Bảng 3.5 Kết khảo sát LD50 chủng Vibrio sp KH2.8 53 Bảng 3.6 Kết khảo sát LD50 chủng Vibrio sp KH3.2 53 Bảng 3.7 Kết khảo sát LD50 chủng Vibrio sp KH6a 54 Bảng 3.8 Nồng độ gây chết chủng Vibrio sp qua khảo sát LD50 55 Bảng 3.9 Kết định danh chủng Vibrio sp 55, 56, 57 Bảng 3.10 Tỉ lệ tƣơng đồng test sinh hóa chủng Vibrio sp 57 Bảng 3.11 Kết quan sát đại thể vi thể chủng B.polyfermenticus F27.59 Bảng 3.12 Kết khảo sát khả đối kháng phƣơng pháp đục lỗ thạch 60 15 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sản lƣợng tơm tồn cầu 1990 – 2013 13 Hình 1.2 Tơm thẻ chân trắng bị nhiễm bệnh hoại tử gan tụy EMS/AHPNS 16 Hình 1.3 So sánh gan tụy ruột tơm khỏe (A) tơm bệnh (B) .16 Hình 1.4 A: Khuẩn lạc Vibrio parahaemolyticus môi trƣờng TCBS B: Hình thái nhuộm Gram Vibrio parahaemolyticus 19 Hình 3.1 Khuẩn lạc V.parahaemolyticus KH6a mơi trƣờng TCBS 58 Hình 3.2 Hình thái nhuộm Gram V.parahaemolyticus KH6a 58 Hình 3.3 Hình thái đại thể vi thể chủng B.polyfermenticus F27 59 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Các qui trình thí nghiệm 31 Sơ đồ 2.2 Xác định khả kháng khuẩn chủng B polyfermenticus F27 phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam có tiềm lớn ni trồng thủy sản, nghề ni tơm chiếm vị trí quan trọng Theo Tổng cục Thống kê, ước tính giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 đạt gần 188 nghìn tỷ đồng Trong đó, giá trị ni trồng thủy sản ước đạt 115 nghìn tỷ đồng (Tổng cục thủy sản 2014) Tuy nhiên, tình trạng dịch bệnh tơm hồnh hành nhiều vùng nuôi tôm nước ta Đặc biệt hội chứng tôm chết sớm Early Mortality Syndrome (EMS) hay gọi hội chứng hoại tử gan tụy Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) (Flegel cs., 2012) Đã gây thiệt hại đáng kể cho số trang trại nuôi tôm miền nam Trung Quốc, Việt Nam, Malaysia (Lightner cs., 2012; Mooney, 2012) phía Đơng vịnh Thái Lan vào năm 2011 (Eduardo cs., 2012; Flegel, 2012) Bệnh ghi nhận lần Trung Quốc năm 2009 Đây loại dịch bệnh xuất nước ta từ năm 2010, gây chết tôm sú tôm thẻ chân trắng hàng loạt địa bàn Đồng song Cửu Long Trong năm tiếp theo, 2011 2012, dịch bệnh tiếp tục lan rộng nhiều tỉnh khác, tập trung Trà Vinh, Sóc trăng, Kiên Giang số tỉnh ven biển phía Bắc: Hải Phịng Quảng Ninh, Bắc Trung bộ: Thanh Hóa Nghệ An, Nam Trung bộ: Quảng Ngãi, Bình Định, Khánh Hịa, Ninh Thuận Bình Thuận Do diện tích tơm mắc bệnh lớn tôm chết tập trung chủ yếu giai đoạn 20 30 ngày tuổi, cỡ tôm phát bệnh người nuôi thường xử lý xả bỏ nên gây thiệt hại lớn Đặc biệt năm 2012, nước có khoảng 100.776 diện tích ni tơm nước lợ bị thiệt hại dịch bệnh có tới 46.093 diện tích ni tơm nước lợ ước xác định bị chết hội chứng hoại tử gan tụy (Tổng cục Thủy sản, 2012) Vào đầu năm 2013, nhóm nghiên cứu GS Lightner (phịng nghiên cứu Bệnh học thủy sản Đại học Arizona) phân lập xác định tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) môi trường nhân tạo dòng đặc biệt vi khuẩn V parahaemolyticus có độc lực cao thơng qua kiểm tra mô hoc, sử dụng kit API Rapid NE giải trình tự 16S rRNA (Tran et al., 2013) V parahaemolyticus xâm chiếm đường tiêu hóa tơm sinh độc tố gây phá hủy mô, làm rối loạn chức gan tụy, quan tiêu hóa tôm (Lightner et al., FAO, 2013) Năm 2014, Kondo cộng phân tích trình tự gen chủng V parahaemolyticus gây bệnh hoai tử gan tụy Thái Lan phát gen độc tố PirA PirB đờng thời lại không phát chủng V parahaemolyticus không gây bệnh Điều chứng tỏ gen độc tố PirA PirB tác nhân gây bệnh AHPND (Kondo et al., 2014) Và biết đến với tốc độ lây lan gây tử vong cao trang trại nuôi tôm (Zorriehzahra et al., 2015) Chính có dấu hiệu bệnh hoại tử gan tụy tơm hầu hết hộ ni tơm thường sử dụng sản phẩm hóa học thuốc kháng sinh nhằm giảm thiểu thiệt hại bệnh Theo báo cáo Han đồng tác giả, 2015 xác định chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bệnh hoại tử gan tụy Việt Nam kháng kháng sinh chứng cho thấy lồi vi khuẩn có khả đề kháng kháng sinh nhanh, nguy dẫn đến thất bại việc điều trị bệnh hoại tử gan tụy cao Bên cạnh đó, việc điều trị kháng sinh hóa chất q nhiều ao ni tơm tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh lẫn vi khuẩn có lợi (Gatesoupe, 1999) Vì vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh hoc giúp sản phẩm thủy sản an tồn khơng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người quan tâm (Moriarty, 1997; Verschuere et al., 2000) Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm sinh học giúp sản phẩm thủy sản an tồn khơng gây ảnh hưởng đến sức khỏe người quan tâm (Verschuere cs., 2000) tình trạng lạm dụng kháng sinh hóa chất nuôi trồng thủy sản Điều trị kháng sinh hóa chất q nhiều nước ao tơm làm tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh lẫn vi khuẩn có lợi (Purivirojkul cs., 2007), gây tình trạng kháng thuốc dư lượng kháng sinh hóa chất gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm sức khỏe người sử dụng (Moriarty cs., 1997) Vi khuẩn thường ứng dụng làm chế phẩm sinh học nuôi trồng thủy sản phần lớn thuộc chi Bacillus, Bacillus có khả tạo enzym ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, tiết hợp chất kháng sinh hay chất ức chế có đặc tính đối kháng với chủng vi sinh vật gây bệnh ghi nhận nhiều khả đối kháng với Vibrio spp (Domrongpokkaphan cs., 2006; Ravi cs., 2007) 3.5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Vibrio paraheamolyticus CỦA CHỦNG Bacillus polyfermenticus F27 BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH Chủng vi khuẩn B polyfermenticus F27 tiến hành thử nghiệm đối kháng với chủng V Parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch Các thử nghiệm lặp lại lần, kết trình bày bảng 3.13 Bảng 3.12 Kết khảo sát khả đối kháng phƣơng pháp đục lỗ thạch Mã chủng Đƣờng kính vịng kháng (mm) NH3.3a 16,67 ± 1,25 KH2.5 16,67 ± 1,05 KH2.8 19,67 ± 0,67* KH3.2 14,67 ± 1,05 KH6a 16,33 ± 1,05 Đối chứng Chú thích: *: khác biệt mức P = 0,05 Kết cho thấy khác biệt nghiệm thức thí nghiệm qua phép thử t-Test đường kính vịng kháng khuẩn Trong đó, nghiệm thức KH2.8 (19,67 ± 0,67 mm) có đường kính vịng kháng lớn khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức cịn lại 60 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 4.1 KẾT LUẬN Sau trình thực đề tài, thu kết sau:  Phân lập 56 chủng Vibrio sp., có chủng có khả gây bệnh hoại tử gan tụy mạnh tôm thẻ là: NH3.3a, KH2.5, KH2.8, KH3.2 KH6a  Xác định nồng độ gây chết LD50 chủng Vibrio sp Trong có chủng Vibrio sp có LD50 cao là: KH2.5 với LD50 = 3.16*103 CFU/ml Vibrio sp KH6a với LD50 = 3.16*104 CFU/ml  Thực 23 test sinh hóa 27 test sinh hóa tiêu chuẩn vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus theo khóa phân loại Bergey  Khảo sát khả đối kháng chủng B.polyfermenticus F27 với chủng V.parahaemolyticus Trong đó, B.polyfermenticus F27 có khả kháng mạnh với chủng KH2.8 với đường kính vịng kháng 19,67 ± 0,67 mm 4.2 KIẾN NGHỊ Để hoàn thiện kết nghiên cứu ứng dụng vào thực tiễn, xin đưa đề nghị sau:  Tiếp tục tiến hành test sinh hóa tiêu chuẩn cịn lại để định danh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus  Tiến hành khảo sát thực nghiệm tôm thẻ chân trắng để xác định khả đối kháng chủng B.polyfermenticus F27 chủng V.parahaemolyticus 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Phạm Hùng Vân (2002), Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, ĐH Y Dược Tp HCM, tr.36, 37 [2] Nguyễn Trọng Nghĩa, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quốc Phú Phạm Anh Tuấn (2015), “Phân lập xác định khả gây bênh vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tôm nuôi Bạc Liêu” [3] Nguyễn Văn Duy Nguyễn Thị Cẩm Ly (2012), “Phân lập xác định gen độc tố Vibrio parahaemolyticus hải sản tươi sống Nha Trang” [4] Nguyễn Văn Minh cs., (2016), “Khả kiểm sốt sinh học Vibrio parahaemolyticus NT7 phân lập từ tơm thẻ bệnh hoại tử gan tụy (AHPND) chủng Bacillus polyfermenticus F27 phân lập từ giun quế” [5] Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2009), Công nghệ sinh học Dược, NXB Y học [6] Nguyễn Thị Thùy Giang, Phạm Văn Toàn Phạm Quốc Hùng (2016), “Hội chứng hoại tử gan tụy tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi thương phẩm Ninh Thuận” [7] Phạm Thị Tuyết Ngân, 2007 Giáo trình Vi sinh vật hữu ích Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ [8] Tăng Thị Chính Đinh Thị Kim, 2006 Sử dụng chế phẩm vi sinh ao nuôi tôm cao sản Viện công nghệ môi trường, viện Khoa học công nghệ Việt Nam [9] Trần Linh Thước (2010), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo Dục Việt Nam 63 [10] Trần Thị Thu Hiền, 2010 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản Luận văn cao học Viện công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm Đại học Bách Khoa Hà Nội TIẾNG ANH [11] Abhay B., Thakur R B., Vaidya, Suryawanshi S A (2003), “Pathogenicity and antibiotic susceptibility of Vibrio species isolated from moribund shrimps”, Indian Journal of Marine Sicences Vol, 32(1), pp 71-75 [12] Abhay B., Thakur R B., Vaidya, Suryawanshi S A (2003), “Pathogenicity and antibiotic susceptibility of Vibrio species isolated from moribund shrimps”, Indian Journal of Marine Sicences, 32(1), pp 71-75 [13] Abriouel H., Franz C., Ben O.N., Gaslvez A (2011), “Diversity and applications of Bacillus bacteriocins”, Microbiol, 35, pp 201-232 [14] Aguirre G G., Vazquez J., Ascencio R (2001) "Differences in the susceptibility of American White Shrimp larval substages (Litopenaeus vannamei) to four Vibrio species", J Invert Pathol [15] Arima K., Kakinuma A., Tamura G (1968), “Surfactin, a crystalline peptide lipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, chracterization and its inhibition of fibrin clot formation”, Biochem Biophys Res Commun, 31, pp 488- 494 [16] Baumann P., Shubert R.H.W (1984), "Family II Vibrionaceae", The Williams and Wilkins, Baltimore, pp 516-550 [17] Brock B.J.H., Moss S.M (1992), “Penaeid taxonomy, biology and zoogeography”, Developments In Aquaculture And Fisheries Science, 23, pp 9- 27 64 [18] Buchanan R E., Gibbons N E (1994), Bergey’s manual of determinative bacteriology, W E Johnson Library [19] D Fegan, presented at the Aquaculture Roundtable (TARS) conference in Phuket, Thailand, held Aug 20-21, 2014 [20] DePaola A., Kaysner C A., Bowers J , Cook D W (2000), " Environmental investigations of Vibrio parahaemolyticus in oysters after outbreaks in Washington, Texas, and New York (1997 and 1998)" Appl Environ Microbiol 66, pp 4649–4654 [21] Duitman H.E., Hamoen L.W., Rembold M., Venema G., Seitz H., Saenger W., Bernhard F., Reinhand R., Schmidt M., Ullrich C., Stein T., Leenders F., Vater J (1999), “The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis ATCC6633: a multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase and a fatty acid synthase”, PNAS, 96, pp 13294-13299 [22] Eldridge C.S., Compston W., Williams I.S., Harris J.W., Bristow J.W., Kinny P.D (1995), “Applications of the Shrimp ion microprobe to the understanding of processes and timing of diamond formation”, Economic Geology, 90, pp 271-280 emerging threat in shrimp industry Adv Anim Vet Sci., Volume 3, pp 64–72 [23] FAO (1998), Report of the Bangkok FAO Technical Consultation on Policies for Sustainable Shrimp Culture, Bangkok, Thailand, 8-11 December 1997 [24] Flegel, T.W.(2012) Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia Journal of Invertebrate Pathology 110:116-173 [25] Gibson T., Gordon R.E (1975), “Bacillus, in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology”, Williams & Wilkins, pp 576-583 65 [26] Han J.E., Mohney L.L., Tang K.F.J., Pantoja C.R., Lightner D.V.,2015 Plasmid mediated tetracycline resistance of Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimps Aquaculture [27] Hsieh, Feng- Chia, Lin, Tsung- Chun, Meng, Menghsiao, Kao, Suey- Sheng (2008), “Comparing methods for identifying Bacillus strains capable of producing the antifungal lipopeptide iturin A”, Curent Microbiology, 56, pp.1- [28] Isogai I., Takayama S., Murakoshi S., Suzuki A (1982), “Structure of βamino acids in antibiotic iturin A”, Tetrahedron Lett, 23, pp 3065-3068 [29] Jayasree L., Janakiram P., Madhavi R (2006), “Characterization of Vibrio spp.Associated with Diseased Shrimp from Culture Ponds of Andhra Pradesh (India)”, Journal of the World Aquaculture Society, pp 77-124 [30] Jenny K., Kappeli O., Fiechter A (1991), “Biosurfactants from Bacillus licheniformis structural analysis and charaterization”, Microbiol Biotechnol, 36, pp 1669-1671 [31] Jiang Y., Xu H., Li Y., Liu H., Yu L., Qiao M., Liu G (2014), “Draft genome sequence of Bacillus subtillis strain NKYL29, an antimicrobialpeptideproducing strain from soil”, Genome Announc (6), pp 1128-1140 [32] Kaneko T., Colwell R.R (1973), “Ecology of Vibrio parahaemolyticus in Chesapeake Bay”, Journal of Bacteriology, 113, pp 24-32 [33] Kaneko T., Cowell R.R (1975), “Adsorption of Vibrio parahaemolyticus onto chintin and copepods”, Microbiol, 20, pp 693-699 [34] Klaenhammer T (1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid 66 bacteria”, Microbiol, 12, pp 39-86 [35] Kondo H., Tinwongger S., Proespraiwong P., Mavichak R., Unajak S., Nozaki R.,Hirono I., 2014 Draft genome sequences of six strains of Vibrio parahaemolyticus Isolated from Early Mortality Syndrome/Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease shrimp in Thailand Genome Announc, 2(2), (e00221- 14) [36] Kumar A., Saini P., Shrivastava J N (2009), “Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian Journal of Experimental Biology, 47(1), pp 57 – 62 [37] Lavilla P.C.R., Leano E.M.,Paner M.G (1998), “Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp Penaeusmonodon associated with dominance of luminescent vibrios in the rearing environment”, Aquaculture, 164, pp 337–349 [38] Li C., Chen J (2008), “The immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus under low high pH stress”, Fish & Shellfish Immunology, 25, pp.701-709 [39] Lightner D.V (1996), “A Handbook of Shrimp Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Cultured Penaeid Shrimp” World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana, USA , pp.1-72 [40] Lightner D.V Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.I., Tran L (2012), “Early mortality syndrome affects shrimp in Asia”, Global Aquaculture Advocate, pp 40 [41] Loc T., Linda N., Rita M R., Leone L M., Carlos R P., Kevin F., Lightner D.V (2013), “Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp”, Diseases Of Aquatic Organisms, 105, pp 45–55 67 [42] Marahiel M.A., Stachelhaus T., Mootz H.D (1997), “Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis”, Chem Rev, 97, pp 2651-2673 [43] Mongkolthanaruk W (2012), “Classification of Bacillus beneficial substances related to plants, humans and animals”, Microbiol Biotechnol, 22, pp 1597 -1604 [44] Mukherjee S., Das P., Sen R (2006), “Towards commercial production of microbial surfactants”, Trends Biotechnol, 24, pp 509-515 [45] Nash, Nithimathachoke G., Tungmandi C., Arkarjamorn A., Prathanpipat P., Ruamthaveesub P (1992) “Vibriosis and its control in pond-reared Penaeusmonodonin Thailand”, In: M Shariff, R.P Subasinghe and J.R Authur (eds.) Diseases in Asian Aquaculture 1.Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila, Philippines, pp 143-155 [46] Nishikiori T., Naganawa H., Muraoka Y., Aoyagi T., Umezawa H (1986), “Plipasatins: new inhibitors of phospholipase A2 produced by Bacillus cereus BMG302-fF67.III Structural elucidation of plipastatins”, Antibiot, 35, pp 755- 761 [47] Reed J L., Muench H (1938), “A simple method of estimating fifty percent Endpoints”, The American journal of hygiene 27, pp.493-497 [48] Renata A C., Giselle C S., Jackson R O P., Gustavo H F V.a, Regine H S.F.V (2010), “Quantification and distribution of Vibrio species in water from an estuary in Ceará-Brazil impacted by shrimp farming”, Brazilian journal of Oceanography, 58(3), pp 183- 188 [49] Rodrigues L., Banat I.M., Teixeira J., Oliveira R (2006), “Biosurfactants : potential applications in medicine”, Jantimicrob Chemother, 57, pp 609- 68 618 [50] Roongsawang N., Thaniyavarn J., Thaniyavarn S., Kameyama T., Haruki M., Imanaka T., Morikawa M., Kanaya S (2002), “Isolation and characterization of halotolerant Bacillus subtilis BBK-1 which produces three kinds of lipopeptides: bacilomycin L, plipastatin and surfactin”, Extremophiles, 6, pp 499-506 [51] Shigueno K (1975), “Shrimp culture in Japan”, Association for International Technical Promotion, Japan, pp 150 [52] Stein T,(2005) Bacillus subtilis antibiotic: structure, synthees and specific function Mol microbiol 56(4): 655-671 [53] Tran L., Nunan L., Redman R.M., Mohney L.L., Pantoja C.R., Fitzsimmons K.,Lightner D.V., 2013 Determination of the infectious nature of the agent of acute hepato- pancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp Diseases Aquatic Organisms [54] Vanittanakom N., Loeffler W., Koch U., Jung G (1986), “Fengycin- a novel antifungal lipopeptide antibiotic produced by Bacillus subtilis F-29-3”, Antibiot, 39, pp 888-901 [55] Vengadesh Letchumanan, Kok-Gan Chan, and Learn-Han Lee (2014), Vibrio parahaemolyticus: a review on the pathogenesis, prevalence, and advance molecular identification techniques [56] Verschuere L., Rombaut P., Verstraete W (2000), “Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture” Microbiology Molecular Biology Reviews, 64 (4), pp 655-671 [57] Vesth T, Wassenaar T M, Hallin P F, Snipen L, Lagesen K and Ussery D W (2010) On the origins of a Vibrio species Microb Ecol, 59:1-13 69 [58] Wong H.C., Liu S.H., Wang T.K., Lee C.L., Chiou C.S., Liu D.P., Nishibuchi Mand Lee B.K (2000), “Characteristics of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 from Asia”, Environ Microbiol, 66, pp 3981-3986 [59] Williams L.A., LaRock P.A (1985), “Temporal Occurrence of Vibrio Species and Aeromonas hydrophila in Estuarine Sediments”, Applied and environmental microbiology, 50 (6), pp 1490– 1495 [60] Xiang-Hong, W., L Jun, J Wei-Shang, X Huai-Shu, 1998 Application of Probiotics in Aquaculture Ocean University of Qongdao Qingdao [61] Yang Y.T., Chen I.T., Lee C.T., Chen C.Y., Lin S.S., Hor L.I, Tseng T.C, Huang Y.T.2014, Sritunyalucksana K., Thitamadee S., Wang H.C., Lo C.F., 2014 Draft genome sequences of four strains of Vibrio parahaemolyticus, three of which cause early mortality syndrome/ acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp in China and Thailand Genome Announc, 2, (e00816-14) [62] Zhang T., Shi Z Q., Hu L B., Cheng L G., Wang F (2008), “Antifungal compounds from Bacillus subtilis B – FS06 inhibiting the growth of Aspergillus flavus”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 24(6), pp 783 – 788 INTERNET [37] TSVN6 (2013), “Đã xác định nguyên nhân gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp EMS/AHPNS”, http://www.vinhthinhbiostadt.com/vi/tin-tuc/nguyen- nhan-benh-gan-tu-hoai-tu-gan-tuy-tom-chet-som-ahpns-ems-24.html [38] Tổng cục thủy sản, http://www.fistenet.gov.vn/ 70 PHỤ LỤC Thuốc nhuộm  Crystal violet a Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10 mL b Phenol 1g Nước cất 100 mL Lƣu ý: Trộn hai dung dịch a b với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng  Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 mL Lƣu ý: Hòa tan 2g KI vào mL nước cất, sau thêm 1g Iod tinh thể Chờ cho Iod tinh thể tan hết thêm nước vào vừa đủ 300 mL  Safranin O Safranin O (dung dịch 2% cồn 96o) 25 mL Nước cất 75 mL Lƣu ý: Bảo quản chai màu Môi trƣờng  Thành phần môi trường NB: Cao thịt 5g 71 Pepton bột 10 g NaCl 5g Nước cất 1000 mL 7,4 – 7,6 pH :  Thành phần môi trường Peptone kiềm: Pepton bột 20 g NaCl 30 g Nước cất 1000 mL pH : 8,5  0.2  Thành phần môi trường TCBS: Peptone 10 g Yeast extract 5g Na2S2O3 10 g Na citrat 10 g Bile salt 8g Sucrose 20 g NaCl 10 g Fe.citrate 1g Bromothymol blue 0.04 g Thymol blue 0,04 g Agar 20g 72 Nước cất 1000 mL pH : 8,8  0,2  Môi trường Simmon’s Citrate Sodium citrate 2g K2HPO4 1g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18 g pH : 6,9 –  Môi trường Clark – lubs ( môi trường canh MR - VP) Pepton 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất 1000 mL pH : 6,9 ± 0,2  Môi trường lên men loại đường NB g Đường 10 g 73 Phenol red 0,01 g Nước cất 1000 mL pH : 7.4  Môi trường khử Nitrate NB 8g KNO3 ( NaNO3) 2g Nước cất 1000 mL pH : 7,2  Môi trường thạch bán lỏng di động: NB 8g Agar 5g Nước cất 1000 mL pH : 7,2  Môi trường Gelatine: NB 8g Gelatine 150 g Nước cất 1000 mL pH : 7,2 74 ... nhận số tôm chết ngày tôm ngưng chết liên tục ngày chết hoàn toàn thu nhận chủng vi khuẩn Vibrio sp có khả gây bẹnh hoại tử gan tụy mạnh 2.3.3 Gây cảm nhiễm lên tôm bệnh để xác định khả gây bệnh. .. NGHIÊN CỨU Thu nhận phân lập vi khuẩn V .parahaemolyticus từ mẫu tôm bệnh Sàng lọc sơ chủng vi khuẩn V .parahaemolyticus có khả gây bệnh mạnh tôm thẻ chân trắng Gây cảm nhiễm xác định khả gây bệnh. .. vi sinh vật gây bệnh ghi nhận nhiều khả đối kháng với Vibrio spp (Domrongpokkaphan cs., 2006; Ravi cs., 2007) Xuất phát từ lý định tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu chế phẩm vi sinh có khả kiểm