Đánh giá khả năng kiểm soát sinh học nấm corynespora cassiicola của chế phẩm sản xuất từ vi khuẩn bacillus sp t3 nghiên cứu khoa học

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM Corynespora cassiicola CỦA CHẾ PHẨM SẢN XUẤT TỪ VI KHUẨN Bacillus sp T3 Thuộc nhóm ngành khoa học: Nơng-Lâm-Ngƣ nghiệp Bình Dƣơng, 03/2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM Corynespora cassiicola CỦA CHẾ PHẨM SẢN XUẤT TỪ VI KHUẨN Bacillus sp T3 Thuộc nhóm ngành khoa học: Nơng-Lâm-Ngƣ nghiệp Sinh viên thực hiện: Phan Thị Hoài Thƣơng Nam, Nữ: Nữ Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: 11VS01, khoa Công nghệ sinh học Ngành học: Vi sinh- Sinh học phân tử Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh Bình Dƣơng, 03/2015 Năm thứ: 4/4 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em hồn thành khóa học Xin cảm ơn ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học thầy cô khoa truyền đạt kiến thức cho em suốt năm qua Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh hƣớng dẫn em tận tình dù thầy bận rộn Thời gian làm việc thầy, em rèn luyện thân nhiều Em cảm ơn cô Dƣơng Nhật Linh, dạy em kiến thức học tập, mang đến cho em nhiều điều làm ngƣời Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Bên cạnh đó, em xin cảm ơn chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh chị, bạn em phịng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh ln quan tâm, giúp đỡ em trình thực đề tài Con xin cảm ơn gia đình ln bên con, điểm tựa tinh thần vững lúc khó khăn Một lần nữa, em xin gửi đến tất thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn chân thành Sinh viên thực PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA TRÊN CÂY CAO SU THIÊN NHIÊN 1.1.1 Sơ lƣợc cao su 1.1.1 Bệnh rụng Corynespora 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM Corynespora cassiicola 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Đặc điểm .7 1.2.3 Con đƣờng xâm hại 10 1.2.4 Chu trình gây bệnh 10 1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm Corynespora cassiicola 11 1.3 TỔNG QUAN VỀ Bacillus .12 1.3.1 Phân loại 12 1.3.2 Đặc điểm 12 1.3.3 Chất chuyển hóa kháng nấm Bacillus 13 1.3.4 Tình hình nghiên cứu Bacillus 14 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 17 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .17 2.2.1 Chủng vi khuẩn thử nghiệm 17 2.2.2 Chủng nấm thử nghiệm .17 2.3 THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - MÔI TRƢỜNG 17 2.3.1 Thiết bị 17 2.3.2 Dụng cụ .17 2.3.3 Mơi trƣờng – hóa chất – thuốc nhuộm 18 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.4.1 Quy trình thí nghiệm 18 2.4.2 Tái phân lập chủng vi sinh vật thử nghiệm .19 2.4.3 Lên men 20 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 2.4.4 Xác định hoạt tính chất kháng nấm chủng Bacillus sp T3 phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch .20 2.4.5 Khảo sát nhiệt độ ảnh hƣởng đến hợp chất kháng nấm 22 2.4.6 Tách chiết hợp chất kháng nấm 22 2.4.7 Thử nghiệm ex-vivo 25 2.4.8 Phân tích tế bào xâm nhiễm nấm Corynespora cassiicola 27 2.4.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu .28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 TÁI PHÂN LẬP 30 3.2 THỬ KHẢ NĂNG KHÁNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN GIẾNG THẠCH 30 3.3 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT KHÁNG NẤM 31 3.4 TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT KHÁNG NẤM 33 3.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA NẤM C cassiicola TRÊN LÁ CẮT RỜI VÀ HIỆU QUẢ KIỂM SOÁT 37 3.6 PHÂN TÍCH TẾ BÀO XÂM NHIỄM 42 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1 KẾT LUẬN .45 4.2 ĐỀ NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC 53 PHỤ LỤC 55 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Cấp độ bệnh gây nhiễm tách rời 28 Bảng 3.1 Kết phân lập 30 Bảng 3.2 Khả kháng nấm phƣơng pháp khuếch tán giếng thạch .31 Bảng 3.3 Đánh giá khả kháng nấm qua dãy nhiệt độ khảo sát 32 Bảng 3.4 Kết tách chiết hợp chất kháng nấm dung môi thử nghiệm 33 Bảng 3.5 Kết vòng kháng nấm số mẫu lóng tách nƣớc 36 Bảng 3.6 Đánh giá cấp độ bệnh dòng cao su gây nhiễm 38 Bảng 3.7 Khả kiểm soát nấm bệnh điều kiện ex-vivo Bacillus sp T3 40 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Đánh giá khả kháng nấm qua dãy nhiệt độ khảo sát 32 Biểu đồ 3.2 Kết tách chiết hợp chất kháng nấm dung môi thử nghiệm 34 Biểu đồ 3.3 Đƣờng kính vết bệnh theo ngày gây nhiễm .38 Biểu đồ 3.4 Kết đánh giá cấp độ bệnh dòng cao su gây nhiễm 39 Biểu đồ 3.5 Kết đánh giá khả kiểm soát nấm bệnh điều kiện ex-vivo Bacillus sp T3 40 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình tồn thí nghiệm .18 Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết chất kháng nấm 24 SVTH: PHAN THỊ HỒI THƢƠNG DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Triệu chứng bệnh hại cao su Hình 1.2 Sự phát triển nấm Corynespora cassiicola môi trƣờng PDA Hình 1.3 Bào tử nấm Corynespora cassiicola nhuộm dung dịch Lactophenol Hình1.4 Chu trình gây nhiễm nấm Corynespora cassiicola .10 Hình 2.1 Kết kháng nấm vi khuẩn 21 Hình 2.2 Cấp độ bệnh gây nhiễm tách rời 27 Hình 3.1 Hình ảnh đại thể (A) vi thể (B) vi khuẩn Bacillus sp T3 (100X) .30 Hình 3.2 Thử khả kháng giếng khuếch tán 31 Hình 3.3 Kết tách chiết chất kháng nấm 35 Hình 3.4 Ảnh hƣởng loại dung mơi sử dụng tách chiết 36 Hình 3.5 Đánh giá cấp độ bệnh cao su bị lây nhiễm 37 Hình 3.6 Khả kiểm soát nấm bệnh điều kiện ex-vivo Bacillus sp T3 sau ngày 41 Hình 3.7 Sự phát triển vết bệnh tƣơng tác nấm Corynespora cassiicola với cao su 42 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One – way analysis of variance C cassiicola Corynespora cassiicola CFU Colony forming unit Cs Cộng NA Nutrent Agar NB Nutrient Broth nm nanomet OD Optical Density PTN Phịng thí nghiệm PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 4.1 KẾT LUẬN Sau thời gian nghiên cứu chúng tơi hồn thành mục tiêu đề thu đƣợc kết nhƣ sau: − Dung mơi dichloromethane có khả tách chiết hợp chất kháng nấm cao dung mơi cịn lại cao gấp 1,10 lần so với dịch chƣa tách chiết, cho đƣờng kính vịng kháng nấm 32,75 ± 1,35 mm − Cả dòng cao su RRIV 124 IAN 873 biểu bệnh xâm nhiễm nấm bệnh, dòng cao su IAN 873 mẫm cảm so với dòng cao su RRIV 124 − Gây nhiễm nấm bệnh cao su tách rời đạt cấp độ 5, dịch kháng nấm tách chiết với dung môi dichloromethane có khả ức chế tiêu diệt hồn toàn nấm bệnh tách rời sau xử lý 24 4.2 ĐỀ NGHỊ Để đề tài hoàn thiện hơn, chúng tơi có số kiến nghị: − Tiếp tục hồn thiện quy trình tách chiết hợp chất kháng nấm Corynespora cassiicola đƣợc sản xuất từ Bacillus sp T3 − Xác định chất hóa học hợp chất kháng nấm − Thử nghiệm quy mô thực nghiệm SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Phan Thành Dũng (2000), Bệnh rụng Corynespora cao su Việt Nam, Báo cáo tham luận trình bày Hội nghị TT & BVTV Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn tổ chức Thành phố Hồ Chí Minh [2] Phan Thành Dũng (2004), Kỹ Thuật bảo vệ thực vật cao su, Nhà xuất Nông nghiệp [3] Phan Thành Dũng (2009), Bài giảng bệnh cao su, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam [4] Phan Thành Dũng, Trần Ánh Pha, Nguyễn Anh Nghĩa, Nguyễn Thái Hoan, Nguyễn Đôn Hiệu (2010), Nghiên cứu bệnh rụng Corynespora cao su Việt Nam, Đề tài cấp tập đồn Cơng nghiệp cao su Việt Nam [5] Nguyễn Hải Đƣờng, Phan Thành Dũng (1997), “Sâu bệnh cao su Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo nghiên cứu khoa học hội thảo khoa học cao su thiên nhiên Hiệp hội nghiên cứu phát triển cao su quốc tế (IRRDB), tổ chức Thành phố Hồ Chí Minh 10/1997, Nhà xuất Nơng Nghiệp, tr 167 – 184 [6] Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [7] Nguyễn Văn Minh, Mai Hữu Phúc, Võ Ngọc Yến Nhi, Dƣơng Nhật Linh, Nguyễn Anh Nghĩa (2013), “Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cao su có khả kiểm sốt sinh học vi nấm Corynespora cassiicola”, Hội nghị cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía nam lần III, tr 35 [8] Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Thành Trung, Lại Thị Tâm, Đỗ Thị Thu Hà, Võ Ngọc Yến Nhị, Dƣơng Nhật Linh (2014), “Tối ƣu hóa mơi trƣờng lên men chủng Bacillus sp T3 nhằm nâng cao hoạt tính kháng nấm SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 46 Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei”, Hội nghị nấm học: Nghiên cứu ứng dụng khu vực phía Nam”, tr 53 [9] Nguyễn Anh Nghĩa, Phan Thành Dũng (2011), Phòng trị bệnh rụng Corynespora cao su Viện Nghiên cứu Cao Su Việt Nam, Hội nghị tổng kết nông nghiệp Viện Nghiên Cứu cao su Việt Nam [10] Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ (2008), Sàng lọc in vitro số chủng Bacillus làm probiotic cho thuỷ sản, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh [11] Tơ Hồng Sơn, Nguyễn Thị Đài Trang, Huỳnh Ngọc Trúc Nguyên, Võ Ngọc Yến Nhi, Dƣơng Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh (2013), ”Sàng lọc Bacillus có khả kiểm sốt sinh học nấm Corynespora cassiicola”, Hội nghị CNSH toàn quốc năm 2013 Quyển 2, tr.513517 [12] Nguyễn Văn Thanh, Trần Cát Đông (2009), Công nghệ sinh học Dược, Nhà xuất Y học [13] Nguyễn Đôn Thiệu (2011), Khảo sát đa dạng di truyền tính gây bệnh nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei phân lập từ cao su kí chủ khác, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nơng nghiệp, Trƣờng đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh [14] Trần Linh Thƣớc (2010), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất Giáo Dục Việt Nam [15] Nguyễn Hữu Trí (2004), Cơng nghệ cao su thiên nhiên, Nhà xuất trẻ, tr 17 – 20 [16] Trần Đức Viên (2008), Phát triển bền vững ngành cao su Việt Nam hội nhập kinh tế Quốc tế, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội TIẾNG ANH [17] Abraham A., Philip S., Jacob C K, Jayachandran K (2013), “Novel bacterial endophytes from Hevea brasiliensis as biocantrol agent against Phytophthora leaf fall disease”, International Organization for Biological Control (IOBC) 2013 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 47 [18] Bottone E J., Richard W (2003), “Production by Bacillus pumilus (MSH) of an antifungal compound that is active against Mucoraceae and Aspergillus species: preliminary report” Journal of Medical Microbiology 52, pp.69 – 74 [19] Chee K H (1988), “Corynespora Leaf Spot”, Planter’s Bull Rubb Res Ins Malaysia 194, pp – [20] Chen X H., Vater J., Piel J (2006), “Structural and functional aracterization of three polyketide synthase gene clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB 42”, J Bacteriol 188(11), pp 4024 – 36 [21] Cho K M., Math R K., Hong S Y., Islam S M A., Mandanna D K., Cho J J., Yun M G., Kim J M., Yun H D (2009), “Iturin produced by Bacillus pumilus HY1 from Korean soybean sauce (kanjang) inhibits growth of aflatoxin producing fungi”, Food Control 20,pp 402 – 406 [22] Déon M., Fumanal B., Gimenez S., Bieyssed D., Oliveirae R.R., Shuib S.S., Breton F., Elumalai S., Vida J.B., Seguinm M., Leroy T., Roeckel - Drevet P and V Pujade – Renaud (2013), “Diversity of the cassiicolin gene in Corynespora cassiicola and relation with the pathogenicity in Hevea brasiliensis”, Fungal Biol 118:32 - 47 [23] Déon M., Scomparin A., Tixier A., Mattos R.R., Thierry Leroy., Marc Seguin., Roeckel - Drevet P., V Pujade - Renaud (2012), “First characterization of endophytic Corynespora cassiicola isolates with variant cassiicolin genes recovered from rubber trees in Brazil”, Fungal Diversity 54: 87 - 99 [24] Dung P T (1995), “Studies on Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei on rubber Masters’ thesis”, University Pertanian Malaysia [25] Ebtsam M M., Abdel-Kawi K A., Khalil M N A (2009), “Efficiency of Trichoderma viride and Bacillus subtilis as Biocontrol Agents gainst Fusarium solani on Tomato Plants”, Egypt J Phytopathol 37(1) , pp 47 – 57 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 48 [26] Fernandol T.H.P.S., Jayasinghe C.K., Wijesundera R.L.C and D Siriwardane (2012), “Some factors affecting in vitro production, germination and viability of conidia of Corynespora cassiicola from Hevea brasiliensis”, J.Natn.Sci.Foundation Sri Lanka 40:241 - 249 [27] Fulmer A (2012), “The (Emerging) Reality of Corynespora cassiicola: Insights from a literature review”, Agricultural Research [28] George M K., EdathiJ I T (1980), “A report on Corynespora leaf s pot disease on mature rubber”, International Rubber Conference, Kottayam, India [29] Ingroff, Espinel A., Faleer M A (1995), “Antifungal Agents and Susceptibility Testing in Manual of clinical microbiology”, ASM PRESS, pp.1405 – 1414 [30] Kamar A S S (1994), “Distribution and disease severity of rubber disease in Malaysia”, Proceedings of the IRRDB symposiul11 on dIsease of HeveaL, Cochin, India, pp 16 – 22 [31] Kirk P M., Cannon P F., David J C., Stalpers J A (2001) Ainsworth & Bisby’s dictionary of the fungi 9th edition CABI Publishing, Wallingford [32] Kong Q., Shan S., Liu Q., Wang X., Yu F (2010), “ Biocontrol of Aspergillus flavus on peanut kernels by use of a strain of marine Bacillus megaterium”, Int J Food Microbiol 139, pp 31 – 35 [33] Kumar A., Saini P., Shrivastava J N (2009), “Production of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis”, Indian Journal of Experimental Biology 47(1), pp.57 – 62 [34] Liyanage A., De S., Jayasinghe C K., Liyanage N L S (1991), “Losses due to Corynespora leaf fall disease and its eradication”, Proceedings, Rubber Research Institute of Malaysia Rubber Growers' Conference, Malacca, Malaysia, pp 401 – 410 [35] Maheshwari D K (2010), “Plant growth and health promoting bacteria”, Heidelberg: Springer, 16, pp 445 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 49 [36] Malik A., Firoz A., Jha V., Sunderasan E., S Ahmad (2010), “Modeling the three - dimensional structures of an unbound single chain variable fragment (scFv) and its hypothetical complex with a Corynespora cassiicola toxin, cassiicolin”, Journal of Molecular Modeling 16: 1883 - 1893 [37] Manju M J., Idicula S P., Jacob C K., Vinod K K., Prem E E., Suryakumar M., Kothandaraman R (2001), “Incidence and severit y of corynespora leaf fall (clf)disease of rubber in coastal karnataka and north malabar region of Kerala”, Indian Joumal of Natural Rubber Research 14(2), pp 137 – 141 [38] Nghia N A., Kadir J., Sunderasan E (2008), “Morphological and inter simple seqquencerepeat (ISSR), markers analyses of cassiicola isolatesfrom Rubber plantions Corynespora in Malaysia” Mycopathologia 166(4), pp 189 – 201 [39] Purwantara A.A (1987), “Histological study of Hevea leaves infected by Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei”, Menara Perkebunan 55: 47-49 [40] Qi Y.X., Zhang Z.X., Pu J.J., Liu X.M., Lu, Y., Zhang H., Zhang H.Q., Lv Y.C, Y.X Xie (2011), “ Morphological and molecular analysis of genetic variability within isolates of Corynespora cassiicola from different hosts”, European Journal of Plant Pathology 130: 83 95 [41] Shrivastava A., Mahendra K G., Singhal P K (2013), “Nutritional and environmental optimization of antifungal potential of Bacillus strains”, International Journal of Advanced Research (1), pp – [42] Sihem B.M, Rafik E, Mathieu F, Mohamed C, Lebrihi A (2011), “Identification and partial characterization of antifungal and antibacteria activities of two Bacillus sp strans isolated from salt soil in Tunisia”, African Journal of Microbiology Research, vol.5, pp 1599- 1608 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 50 [43] Silva W.P., Karunanayake E.H., Wijesundera R.L., U.M Priyanka (2003), “Genetic variation in Corynespora cassiicola: A possible relationship between host origin and virulence”, Mycological Research 107: 567 - 571 [44] Sinulingga W., Suwarto, Soepena H (1996), “Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia”, Proceedings, Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea Rubber Medan, Indonesia, pp 29 – 36 [45] Sunderasan E., Kadir R.A., Pujade - Renaud V., Lamotte F.D., Yeang H.Y and N Sheila (2009), “Single-chain antibody specific variable to Corynespora cassiicola fragments toxin, cassiicolin, reduces necrotic lesion formation in Hevea brasiliensis”, Journal of General Plant Pathology 75: 19 - 26 [46] Souza L M., Gazaffi R., Mantello C C., Silva C C., Garcia D., Guen V L., Cardoso S E A., Franco Garcia A A F., Souza A P (2013), “QTL Mapping of Growth – Related Traits in a Full – Sib Family of Rubber Tree (Hevea brasiliensis) Evaluated in a Sub – Tropical Climate” , PLoS ONE 8(4): p e61238 [47] Sunderasan E., Kadir R.A., Pujade - Renaud V., Lamotte F.D., Yeang H.Y., N Sheila (2009), “Single-chain variable fragments antibody specific to Corynespora cassiicola toxin, cassiicolin, reduces necrotic lesion formation in Hevea brasiliensis”, Journal of General Plant Pathology 75: 19 - 26 [48] Yamada H., Takahashi N., Hori N., Asano Y., Mochizuki K., Ohkusu K, K.Nishimura (2013), “Rare case of fungal keratitis caused by Corynespora cassiicola”, Journal of Infection and Chemotherapy 19: 1167 - 1169 [49] Zhang T., Shi Z Q., Hu L B., Cheng L G., Wang F (2008), “Antifungal compounds from Bacillus subtilis B – FS06 inhibiting the growth of Aspergillus flavus”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 24(6), pp 783 – 788 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 51 [50] Zhao Z Z., Wang Q., Wang K B K., Liu C H., Gu Y (2010), “Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortis ZZ185 in vitro and identification of its antifungal components”, Bioresource Technolog 101, pp 292 – 297 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 52 PHỤ LỤC 1.1 THUỐC NHUỘM Crystal violet: a) Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10 mL b) Phenol 1g Nƣớc cất 100 mL Lưu ý: trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nƣớc cất 300 mL Lưu ý: hòa tan g KI vào mL nƣớc cất, sau thêm g Iod Chờ cho Iod tan hết thêm nƣớc vừa đủ 300 mL Safranin O Safranin O (dung dịch cồn 96o) 25 mL Nƣớc cất 75 mL Lƣu ý: Bảo quản chai màu 1.2 MƠI TRƢỜNG Mơi trƣờng NA: NB 8g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 mL Hấp khử trùng 121oC/ 15 – 20 phút Môi trƣờng NB: Cao thịt 5g Pepton bột 10 g NaCl 5g Nƣớc cất 1000 mL pH : 7,4 – 7,6 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 53 Môi trƣờng PDA: Dịch chiết khoai tây 20% D – Glucose 20 g/ L Agar 20 g Nƣớc cất 1000 mL Môi trƣờng PS: Dịch chiết khoai tây 20% Pepton 10 g Glucose 40 g Nƣớc cất 1000 mL Môi trƣờng tối ƣu Bacillus sp T3 Glucose 19,49 g NH4NO3 6,35 g MgSO4 0,76 g K2HPO4 6,33 g Nƣớc cất 1000 mL SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 54 PHỤ LỤC 2.1 Bảng tổng kết nhiệt độ sôi độ phân cực dung môi sử dụng tách chiết Nhiệt độ sôi (oC) Độ phân cực n- hexan 69 Không phân cực Dichloromethane 40 Không phân cực n-butanol 118 Không phân cực Diethyl ether 35 Không phân cực Acetone 56 Có độ phân cực Ethanol 79 Có độ phân cực Methanol 65 Có độ phân cực Dung môi 2.2 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm khảo sát nhiệt độ ảnh hƣởng đến dịch kháng nấm sản xuất từ Bacillus sp T3 sau SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 55 2.3 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm khảo sát nhiệt độ ảnh hƣởng đến dịch kháng nấm sản xuất từ Bacillus sp T3 sau 2.4 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định hiệu tách chiết cảu dung môi thông qua vịng kháng nấm SVTH: PHAN THỊ HỒI THƢƠNG 56 2.5 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định cấp độ bệnh gây nhiễm cao su tách rời dòng cao su IAN 873 2.6 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm xác định cấp độ bệnh gây nhiễm cao su tách rời dòng cao su RRIV 124 SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 57 2.7 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm kiểm tra khả kiểm soát sinh học dịch nguyên (chƣa tách chiết) lên nấm bệnh đƣợc gây nhiễm cao su tách rời 2.8 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm kiểm tra khả kiểm soát sinh học dịch tách chiết lên nấm bệnh đƣợc gây nhiễm cao su tách rời SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 58 2.9 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố kết xếp hạng thí nghiệm đối chứng nƣớc muối sinh lý (đối chứng) lên nấm bệnh đƣợc gây nhiễm cao su tách rời SVTH: PHAN THỊ HOÀI THƢƠNG 59 ... tài nghiên cứu: ? ?Đánh giá khả kiểm soát sinh học nấm Corynespora cassiicola chế phẩm sản xuất từ vi khuẩn Bacillus sp T3? ?? Mục tiêu đề tài: Đánh giá khả kiểm soát sinh học nấm Corynespora cassiicola. .. Corynespora cassiicola chế phẩm sản xuất từ vi khuẩn Bacillus sp T3 Nội dung nghiên cứu: − Lên men sản xuất hợp chất kháng nấm Corynespora từ điều kiện tối ƣu hóa chủng Bacillus sp T3 − Khảo sát ảnh hƣởng... ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VI? ?N THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC NẤM Corynespora cassiicola CỦA