Ghiên cứu khả năng kiểm soát sinh học tuyến trùng meloidogyne sp gây hại rễ hồ tiêu của một số chủng vi khuẩn, vi nấm và thực vật tiềm năng nghiên cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp GÂY HẠI RỄ HỒ TIÊU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, VI NẤM VÀ THỰC VẬT TIỀM NĂNG Mã số 31 Bình Dương, tháng năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp GÂY HẠI RỄ HỒ TIÊU CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN, VI NẤM VÀ THỰC VẬT TIỀM NĂNG Mã số 31 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thương Tồn Khoa: Cơng nghệ sinh học Các thành viên: Ngô Lập Vinh Lê Huỳnh Nhật Giao Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh Bình Dương, tháng năm 2018 MỤC LỤC PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Tổng quan hồ tiêu Đặc điểm công dụng Giá trị kinh tế Một số bệnh thường gặp tiêu 2 Tổng quan tuyến trùng ký sinh thực vật Tuyến trùng ký sinh thực vật Tác nhân Meloidogyne spp gây bệnh sần rễ hồ tiêu Đặc trưng sinh học Triệu chứng bệnh 10 Cơ sở phòng trừ tuyến trùng 10 Phòng ngừa 10 Luân canh 11 Biện pháp canh tác 11 Các biện pháp vật lý 13 Biện pháp sinh học 13 Tình hình nghiên cứu giới 15 Tình hình nghiên cứu nước 15 PHẦN II lý chọn đề tài 17 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 Vật liệu ………………………………………………………………………… 22 Thiết bị, dụng cụ, môi trường 22 Thiết bị 22 Dụng cụ 22 Mơi trường, hóa chất thuốc nhuộm 23 i Phương pháp nghiên cứu 24 Tái phân lập, phân lập chủng vi sinh vật 24 Thu nhận trứng tuyến trùng từ rễ bệnh, tạo nguồn tuyến trùng 24 4.2.1 Nguyên tắc 24 4.2.2 Cách tiến hành 24 Tạo nguồn tuyến trùng 25 Sàng lọc chủng vi khuẩn, dịch chiết thực vật có khả đối kháng tuyến trùng 25 4.4.1 Thử nghiệm ảnh hưởng dịch chiết thực vật 25 4.4.2 Thử nghiệm ảnh hưởng chủng vi khuẩn có khả kiểm soát nở trứng 25 4.4.3 Thử nghiệm ảnh hưởng chủng vi khuẩn có khả kiểm sốt đến q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 26 Đánh giá khả đối kháng tuyến trùng chủng vi khuẩn, vi nấm dịch chiết thực vật 26 4.5.1 Đánh giá khả kiểm soát nở trứng 26 4.5.2 Đánh giá ảnh hưởng đến trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 27 Thí nghiệm thử khả tương thích chủng lựa chọn 28 4.6.1 Nguyên tắc 28 4.6.2 Cách tiến hành 28 Đánh giá hiệu kiểm soát tuyến trùng chủng vi sinh vật tiềm dịch chiết thực vật hồ tiêu quy mô nhà lưới 29 Cơng thức tính tỉ lệ trứng nở, ấu trùng chết, đọc kết Nghiệm thức đối chứng, Abamectin 30 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32 Kết tái phân lập chủng vi khuẩn 33 Kết tái phân lập vi nấm 37 Kết phân lập vi nấm 40 Kết thu nhận, tạo nguồn tuyến trùng 42 Kết sàng lọc chủng vi khuẩn, vi nấm có khả đối kháng tuyến trùng 46 ii Kết thử nghiệm ảnh hưởng chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt nở trứng 46 Bảng kết tác động chủng vi sinh vật có khả kiểm soát nở trứng 46 Kết thử nghiệm ảnh hưởng chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 49 5.3.1 Kết đánh giá khả kiểm soát nở trứng 52 5.3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng đến trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 56 Kết thử khả tương thích chủng lựa chọn 59 PHẦN IV: 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 Kết luận 65 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 A Tài liệu Tiếng Việt: 67 B Tài liệu Tiếng Anh: 69 iii DANH MỤC BẢNG đặc điểm đại thể vi khuẩn 33 đặc điểm vi thể vi khuẩn 35 Quan sát đặc điểm đại thể, vi nấm chủng nấm NTI 37 Quan sát đặc điểm đại thể, vi nấm chủng nấm chủng TC 39 Quan sát điểm đại thể, vi nấm chủng nấm NTR 41 Bảng kết tác động chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt nở trứng 46 Bảng kết tác động chủng vi sinh vật có khả kiểm trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 49 Bảng kết kí sinh chủng vi nấm lên trứng tuyến trùng 52 Bảng kết tác động dịch chiết thực vật kiểm soát nở trứng 55 Bảng kết tác động chủng vi sinh vật kiểm sốt q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 56 Bảng kết tác động dịch chiết thực vật kiểm soát trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 58 Bảng kết đếm mật độ khả sống sót chủng vi khuẩn dịch chiết thực vật 61 DANH MỤC BIỂU ĐỒ phần trăm ức chế nở trứng chủng vi khuẩn 48 iv phần trăm kiểm soát đến trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 51 tỷ lệ phần trăm ký sinh trứng tuyến trùng chủng vi nấm 53 Phần trăm ức chế nở trứng dịch chiết thực vật 55 Phần trăm đánh giá kiểm sốt q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi chủng vi sinh vật 57 Phần trăm đánh giá kiểm sốt q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi dịch chiết thực vật 59 DANH MỤC HÌNH Rễ hồ tiêu bị tuyến trùng ký sinh Tuyến trùng Meloidogyne sp khối trứng Vòng đời tuyến trùng sần rễ Meloidogyne sp …………… ……….7 Diễn biến sau 72 ba tế bào khổng lồ sau Meloidogyne sp xâm nhiễm (Jones Pay, 1978; Perry Moens, 2006) kết quan sát đại thể số vi khuẩn (A) chủng S29, (B) chủng TĐ13 35 kết quan sát vi thể số chủng vi khuẩn (A) Chủng V18, (B) TĐ13 37 kết quan sát đại thể vi nấm chủng NTI 38 kết qua sát vi thể vi nấm chủng NTI 39 kết quan sát đại thể, vi thể vi nấm chủng 40 kết quan sát đại thể vi nấm chủng NTR 41 kết quan sát vi thể vi nấm chủng NTR 42 Hồ tiêu có triệu chứng bệnh (A) vàng từ lên trên, (B) vàng lá, (C) rễ bị nốt sần 43 (A) Tuyến trùng khối trứng, (B) Tuyến trùng 44 v Trứng tuyến trùng tách khỏi rễ bệnh 44 hồ tiêu trước sau gây bệnh (A) khỏe mạnh, (B) gây bệnh 45 rễ hồ tiêu bị nốt sần 46 trứng tuyến trùng bị nấm ký sinh (A) chủng TC, (B) chủng NTI, (C) chủng NTR 54 Kết thử khả tương thích chủng vi khuẩn 60 Thử khả tương thích chủng nấm TC vi khuẩn tuyển chọn 60 Thử khả tương thích chủng nấm NTI vi khuẩn tuyển chọn 61 Trang dịch chiết thực vật vô khuẩn 62 Khả sống sót chủng KT2 P20 dịch CH10% (A) 24h, (B) 48h 62 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth CFU Colony Forming Unit mL mililite cm centimet l lite heta mm milimet cs Cộng vii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu khả kiểm soát sinh học tuyến trùng meloidogyne sp gây hại rễ hồ tiêu số chủng vi khuẩn, vi nấm thực vật tiềm - Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thương Tồn - Lớp: DH14VS01 Khoa:Cơng nghệ sinh học Năm thứ: Số năm đào tạo: - Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Minh Mục tiêu đề tài: Tuyển chọn, đánh giá chủng vi khuẩn, vi nấm, thực vật có khả đối kháng tuyến trùng gây nốt sần rễ gây hại hồ tiêu Tính sáng tạo: Kết hợp chủng vi khuẩn, nấm, thực vật kiểm soát tuyến trùng Kết nghiên cứu: Chúng thu nhận vào tạo nguồn tuyến trùng thành công cách gây bệnh nhân tạo trực tiếp tiêu non mơ hình nhà lưới Từ 20 chủng vi khuẩn, thực 20 chủng kết thu đươc 20 chủng có khả kiểm sốt tuyến trùng giai đoạn trứng ấu trùng Trong chủng P20, TV6, Q16, SP1.1, CN1, KT2 có phần trăm ức chế nở trứng cao nhất, cụ thể P20 74,55 ± 3,59%, TV6 69,43 ± 7,62%, Q16 68,43 ± 7.74%, SP1.1 68,21 ± 7,61%, CN1 67,68 ± 4,16%, KT2 67,23 ± 3,42 Hầu hết chủng vi khuẩn thừ nghiệm gây chết ấu trùng (90,52 ± 13,5% đến 99,99 ± 0%) khác biệt so với đối chứng (7,75 ± 7,29%) lớn (82,77% đến 92,24%) chủng vi nấm thử nghiệm có khả ký sinh trứng tuyến trùng, chủng ký sinh trung bình chủng NTI 67,90 ± 15,93%, chủng TC 68,31 ± 5,01%, chủng ký sinh yếu NTR 43,64% Dịch chiết thử nghiệm nồng độ 5%, 10% loại có khả ức chế khả nở trứng tuyến trùng cao nghiệm thức CH10% đạt 95,17 ± 8,35% có khác biệt so với đối chứng 25,95 ± 2,25% viii [11] Govindan M., Joy M., Sreekumar K M (2003) “Viral diseases of black pepper and their management” Indian Journal of Arecanut, Spices and Medicinal Plants, 2003 (Vol 5) 3:96-102 [12] James K Nitao, Susan L F Meyer, and David J Chitwood (1999), “In-vitro Assays of Meloidogyne incognita and Heterodera glycines for Detection of Nematode-antagonistic Fungal Compounds”, Journal of Nematology 31(2):172-183 [13] Jang J Y., Choi Y H., Shin T.S., Kim T.H., Shin K S., Park H W., et al (2016), “Biological Control of Meloidogyne incognita by Aspergillus niger F22 Producing Oxalic Acid” Plos one, vol 11(6) [14] Khan M Q., Abbasi M W., Zaki M J., Khan S M (2010), “Evaluation of Bacillus thuringiensis isolates against root-knot nematodes following seed application in okra and mungbean”, Pakistan Journal of Botany, Vol 42(4): 29032910 [15] Koshy P K., Santhosh J., Eapen S J., Pandey R (2005), Nematode parasites of spices, condiments and medicinal plant, Wallingford (UK): CAB International p.751–792 [16] Koshy P.K and Geetha S.M (1992) “Nematode pests of spices and condiments Nematode pest of crops (D.S Bhatti and R.K Walia)” CBS Publishers and Distributors, India, pp 228-238 [17] Lindberg G S (1981), “An antibiotic lethal to fungi” Plant Dis.65: 680-683 [18] Loewenberg J R., Sullivan T and Schuster M L (1960), T”he effect of pH and minerals on the hatching and survival of Meloidogyne incognita incognita larvae” Phytopathology 50:215–217 [19] Luc M., Sikora R A, Bridge J., Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture, 2005 [20] Mai W.F (1985) Plant-parasitic nematodes: Their threat to agriculture In An Advanced Treatise on Meloidogyne Printed by North Carolina State University Graphics., pp 11-17 [21] Mathew P J., Mathew P M and Kumar V (2001), “Graph clustering of Piper nigram L (Black pepper)” Euphytica 118(3): 257-264 70 [22] Mokbel A A., Alharbi A A (2014), “Suppressive effect of some microbial agents on root-knot nematode, Meloidogyne javanica infected eggplant”, Australian Journal of Crop Science, Vol 8(10):1428-1434 [23] Mousa E M., Mahdy M E., Younis M., Dalia S (2011), Evaluation of some plant extracts to control root-knot nematode Meloidogyne spp On tomato plants Egypt J Agronematol 10(1):1-14 [24] Muzzarelli R A (1977), “Chitin”, Pergamon press, NewYork: NY pp 309 [25] Pau C G., Leong C T S., Wong S K., Eng L., Jiwan M., Kundat F R., Aziz Z F B A., Ahmed O H., Majid N M (2012), “Isolation of Indigenous Strains of Paecilomyces lilacinus with Antagonistic Activity against Meloidogyne incognita”, International Journal of Agriculture and Biology, Vol 14 Issue 2, p197 [26] Perry, R N., and Moens M (2006) Plant Nematology CABI Publishing: Wallingford, UK [27] Perry, R N., and Moens M (2013), Plant Nematology: 2nd Edition, CABI Publishing: Wallingford, UK [28] Ramana K.V., Eapen S J (2000), Nematode induced diseases of black pepper Boca Raton, FL: CRC Press Publishing p 269–296 [29] Samson, R.A 1974 “Paecilomyces and some allied Hyphomycetes” Studies in Mycology 6:1-119 [30] Sankaralingam A., and McGawley E C (1994), “Influence of Rhizoctonia solani on egg hatching and infectivity of Rotylenchulus reniformis” Journal of Nematology 26: 486–491 [31] Sasser, J.N (1979) “Economic importance of Meloidogyne in tropical countries In: Root-knot nematode (Meloidogyne Species) Systematics”, Academic press, pp.359-374 [32] Sasser, J.N and Freckman, D.W (1987), “A World Perspective on Nematology: The Role of the Society” Vistas on Nematology, Hyattsville, Maryland, 7-20 [33] Srinivasan K (2007), “Black pepper and its pungent principle-piperine: A review of diverse physiological effects” Critical Rev Food Nut 47: 735-748 71 [34] Sun M H., Gao L., Shi Y X., Li B J., Liu X Z (2006), “Fungi and actinomycetes associated with Meloidogyne spp Eggs and females in China and their biocontrol potential”, Journal of Invertebrate Pathology, Vol 93, p22–28 [35] Wong, Mee-Hua (2002) “Fungal diseases of black pepper and their management in Sarawak, Malaysia” Paper presented at the Symposium on Pests and Diseases on Pepper Sarawak, Malaysia, 24 Sep 2002 [36] Xiang N., Lawrence S K., Kloepper J W., Donald P A., McInroy J A (2017), “Biological Control of Meloidogyne incognita by Spore-forming Plant Growth-promoting Rhizobacteria on Cotton”, Plant Disease, Vol 101:774-784 [37] Zhao D., Liu B., Wang Y., Zhu X., Duan Y., Chen L (2013), “Screening for nematicidal activities of Beauveria bassiana and associated fungus using culture filtrate”, African Journal of Microbiology Research, Vol 7(11), pp 974-978 72 PHỤ LỤC PHỤ LỤC Môi trường  Môi trường NA (Nutrient agar) Cao thịt 5g Peptone 10g NaCl 5g Agar 15g Nước cất 1000ml  Môi trường PGA Potato 200 g Glucose 20 g Agar 20 g Nước cất 1000 mL Thuốc thử - thuốc nhuộm  Thuốc thử ∝ - naphtol 5% ∝ - naphtol 5g Ethanol 96o 100ml  Thuốc thử KOH 40% KOH 40g Nước cất 100ml  Thuốc thử Kovac’s Isoamyl alcohol (butyl ancohol) 150ml p- Dimethylaminobenaldehyde 10g HCl đậm đặc 50ml  Thuốc thử Gress A Sulfanilic acid 8g 73 Acetic acid (glacial) 30% 1000ml  Thuốc thử Gress B ∝ - naphthylamin 6,0g Acid acetic (glacial) 30% 1000ml  Thuốc thử H2O2 5% H2O2 5ml Nước cất 100ml  Thuốc nhuộm Crystal violet Dung dịch Crystal violet 2g Cồn 96o 20ml Dung dịch Amonium oxalate 0,8g Nước cất 80ml  Thuốc nhuộm lugol I2 1g KI2 2g Nước cất 300ml  Thuốc nhuộm Safranin O Safranin O 0,25g Ethanol 10ml Nước cất 90ml 74 PHỤ LỤC Kết xử lý số liệu Bảng kết tác động chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt nở trứng, trình sinh trưởng ấu trùng tuổi (bao gồm số liệu trước sau xử lý thống kê) Trứng thử nghiệm sau ngày Nghiệm thức Số trứng nở Số trứng Ức chế nở không trứng (%) nở 5,61 (17,92 ± 15,51)g 10,11 (28,5 ± 1,65)fg 13,94 (31,83 ± 2,76)f Ấu trùng nghiệm sau 48h Số ấu Số ấu trùng trùng sống chết 35 34 33 33 100 (99,99 ± 0)a Ấu Trùng chết (%) 2,86 (7,75 ± 7,29)b 4,3 (9,75 ± 8,60)b 6,34 (14,33 ± 3,45)b H2O(ĐC) 40 H2O+KS 30 NB + KS 25 17 19 TĐ13 30 45 57,58 (59,42 ± 6,72)bcde 35 100 (99,99 ± 0)a KT2 16 37 70,59 (67,23 ± 3,42)abc 37 100 (99,99 ± 0)a TC8 23 27 29 TV6 12 32 36 MB23 18 21 40 VS3 22 26 40 TĐ9 19 23 33 P20 10 44 27 Q16 12 30 51,94 (56,1 ± 7,94)cde 73,52 (69,43 ± 7,62)ab 50,54 (55,28 ± 7,62)cde 52,98 (56,78 ± 7,52)bcde 53,87 (57,26 ± 5,58)bcde 81,37 (74,55 ± 3,59)a 72,04 (68,43 ± 7,74)abc 42 Abamectin 20g/L 1% 52,8 (56,61 ± 3,62)bcde 98,04 (92,18 ±13,87)a 98,2 (90,52 ±13,53)a 96,67 (91,10 ±16,41)a 97,22 (99,99 ±15,46)a 100 (99,99 ± 0)a 100 (99,99 ± 0)a 100 (99,99 ± 0)a 75 PH3 24 35 SP1.1 25 LC9 21 29 CN1 19 KP23 17 35 RV1 17 18 DV7 18 14 59,05 (60,39 ± 10,73)bcde 71,77 (68,21 ± 7,61)abc 58,48 (59,88 ± 0,51)bcde 71,26 (67,68 ± 4,16)abc 67,61 (65,33 ± 2,2)abcd 52,04 (56,2 ± 7,92)cde 43,88 (51,48 ± 0,88)d 47,1 (53,33 ± 7,1)de 63,52 12 21 PL32 (63,1 ± 8,46)abcde 50,59 19 19 S29 (55,34 ± 2,53)cde 54 19 23 F27 (57,3 ± 2,28)bcde KS: chloramphenicol 0,05%, ĐC: đối chứng V18 17 15 31 32 34 30 36 37 36 33 33 28 37 100 (99,99 ± 0)a 100 (99,99 ± 0)a 100 (99,99 ± 0)a 100 (99,99 ± 0)a 100 (99,99 ± 0)a 100 (93,67 ± 0)a 99,19 (99,99 ±10,95)a 100 (93,67 ± 0)a 100 (93,67 ± 0)a 100 (93,67 ± 0)a 100 (93,67 ± 0)a Các số liệu nằm ngoặc “( )” chuyển đổi sang arcsine[(x) 1/2] trình thống kê Trong cột, trị số có mẫu tự khơng có khác biệt mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan Kết sàng lọc chủng vi khuẩn, vi nấm có khả đối kháng tuyến trùng Meloidogyne sp Thử nghiệm ảnh hưởng chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt nở trứng 76 Kết Thử nghiệm ảnh hưởng chủng vi sinh vật có khả kiểm sốt đến q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 77 Kết đánh giá khả đối kháng tuyến trùng chủng vi khuẩn, vi nấm dịch chiết thực vật kết kí sinh chủng vi nấm lên trứng tuyến trùng 78 79 Bảng kết tác động dịch chiết thực vật kiểm soát nở trứng Kết đánh giá ảnh hưởng chủng vi sinh đến trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 80 81 tác động dịch chiết thực vật kiểm sốt q trình sinh trưởng ấu trùng tuổi 82 83 84 ... đề tài: Nghiên cứu khả kiểm soát sinh học tuyến trùng meloidogyne sp gây hại rễ hồ tiêu số chủng vi khuẩn, vi nấm thực vật tiềm - Sinh vi? ?n thực hiện: Nguyễn Thương Toàn - Lớp: DH14VS01 Khoa: Công... VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VI? ?N NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC TUYẾN TRÙNG Meloidogyne sp GÂY HẠI RỄ HỒ TIÊU CỦA... Meloidogyne sp gây hại rễ hồ tiêu số chủng vi khuẩn, vi nấm thực vật tiềm năng? ?? nhằm xây dựng sưu tập chủng vi sinh vật tiềm cho sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng tiêu, hướng đến