Khảo sát khả năng làm giàu dha trong dầu cá basa của enzyme lipase ngoại bào từ vi khuẩn lactobacillus plantarum nghiên cứu khoa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIÀU DHA TRONG DẦU CÁ BASA CỦA ENZYME LIPASE NGOẠI BÀO TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Mã số đề tài Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Bình Dương, Tháng năm 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIÀU DHA TRONG DẦU CÁ BASA CỦA ENZYME LIPASE NGOẠI BÀO TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM Mã số đề tài Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ Sinh học Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thanh Hà Nam, Nữ: Nam Dân tộc: Kinh Lớp, khoa: SH10A1, Công nghệ Sinh học Năm thứ: Số năm đào tạo: Ngành học: Công nghệ Thực phẩm Người hướng dẫn: ThS Lý Thị Minh Hiền Bình Dương, Tháng năm 2014 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài, bên cạnh sự nỗ lực thân, tinh thần hoạt đợng nhóm, chúng tơi nhận nhiều sự quan tâm hỗ trợ, giúp đỡ quý Thầy, Cô bạn bè Đến quãng thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học kết thúc, công việc hoàn tất Chúng xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Lý Thị Minh Hiền tận tình hướng dẫn, hỗ trợ tạo điều kiện giúp hoàn thành đề tài Chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm – khoa Công nghệ Sinh học – đại học Mở Tp Hồ Chí Minh tận tình trùn đạt kiến thức kinh nghiệm thực tế vô bổ ích, tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học ứng dụng vào thực tế công việc lâu dài Cảm ơn tập thể lớp chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm SH10TP, bạn sinh viên khoa Công nghệ Sinh học sinh viên khóa K10, bạn phụ trách phịng thí nghiệm quan tâm giúp đỡ chúng tơi nhiệt tình suốt trình thực hiện nghiên cứu Gia đình, ba, mẹ, anh, chị, em người bạn thân thiết chúng tôi, cảm ơn mọi người nhiều ln bên cạnh quan tâm, động viên, cổ vũ tinh thần cho để chúng tơi vượt qua mọi khó khăn để hồn thành cơng việc Kính chúc q Thầy, Cơ, ba, mẹ tất bạn dồi sức khỏe gặt hái nhiều thành công công việc hạnh phúc cuộc sống Một lần xin chân thành cảm ơn! Trân trọng kính chào! Bình Dương, ngày 06 tháng năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thanh Hà MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cá basa .4 1.1.1 Phân loài khoa học 1.1.2 Đặc điểm hình thái, phân bố 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng 1.1.4 Tình hình ni cá basa Việt Nam 1.1.5 Tình hình phát triển ngành cá basa Việt Nam 1.1.6 Phụ phẩm cá basa và tình hình sử dụng .7 1.1.7 Giới thiệu về mỡ cá basa và một số ứng dụng 1.2 Tổng quan về dầu cá .9 1.2.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất dầu cá 1.2.2 Nguyên liệu sản xuất dầu cá 11 1.3 Tinh luyện dầu cá 11 1.3.1 Dầu cá tinh luyện 11 1.3.2 Các cơng đoạn và phương pháp kỹ thuật tinh lụn dầu 13 1.3.3 Một số nghiên cứu trước về tinh luyện dầu cá 21 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng dầu tinh luyện 21 1.4 Các acid béo bất bão hòa đa (PUFA) 21 1.4.1 Giới thiệu chung 21 1.4.2 Acid docosahexaenoic (DHA) 23 1.4.3 Một số phương pháp làm giàu DHA 26 1.5 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 31 1.5.1 Tổng quan 31 1.5.2 Trao đổi chất và khả sinh enzyme 32 1.6 Enzyme lipase 33 1.6.1 Tổng quan 33 1.6.2 Nguồn thu nhận lipase 33 1.6.3 Cấu trúc và đặc điểm lipase từ Lactobacillus plantarum 34 1.6.4 Cơ chế xúc tác lipase 34 1.6.5 Tính đặc hiệu lipase 36 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39 2.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 40 2.2 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 40 2.3 Quy trình thực hiện 42 2.3.1 Quy trình tinh luyện dầu dự kiến 42 2.3.2 Nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum và thu nhận enzyme lipase 45 2.3.3Quy trình dự kiến làm giàu DHA bằng phương pháp thủy phân chọn lọc nhờ lipase 47 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 49 2.5 Các thí nghiệm tiến hành 50 2.5.1 Khảo sát nguyên liệu dầu ban đầu 50 2.5.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng dd NaCl 0,3% quá trình thủy hóa đến chất lượng dầu tinh luyện 50 2.5.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ xử lý quá trình thủy hóa đến chất lượng dầu tinh luyện 51 2.5.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH sử dụng trình trung hòa đến chất lượng dầu tinh luyện 52 2.5.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng lượng kiềm sử dụng (tính theo khối lượng dầu) quá trình trung hòa đến chất lượng dầu tinh luyện 54 2.5.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian xử lý quá trình trung hòa đến chất lượng dầu tinh luyện 55 2.5.7 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng lượng chất hấp phụ (đất hoạt tính) sử dụng quá trình tẩy màu đến chất lượng dầu tinh luyện 56 2.5.8 Kiểm tra chất lượng dầu sau tinh luyện 57 2.5.9 Nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum và thu nhận enzyme lipase 58 2.5.10 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu làm giàu DHA theo phương pháp thủy phân chọn lọc bằng lipase 58 2.5.11 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hiệu làm giàu DHA theo phương pháp thủy phân chọn lọc bằng lipase 58 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Khảo sát nguyên liệu dầu ban đầu 61 3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng dd NaCl 0,3% quá trình thủy hóa đến chất lượng dầu tinh luyện 62 3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt đợ xử lý quá trình thủy hóa đến chất lượng dầu tinh luyện 63 3.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaOH sử dụng trình trung hòa đến chất lượng dầu tinh luyện 65 3.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng lượng kiềm sử dụng (tính theo khối lượng dầu) quá trình trung hòa đến chất lượng dầu tinh luyện 67 3.6 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian xử lý quá trình trung hòa đến chất lượng dầu tinh luyện 68 3.7 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng lượng chất hấp phụ (đất hoạt tính) sử dụng quá trình tẩy màu đến chất lượng dầu tinh luyện 70 3.8 Kiểm tra chất lượng dầu sau tinh luyện 71 3.9 Nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus plantarum và thu nhận enzyme lipase 72 3.10 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu làm giàu DHA theo phương pháp thủy phân chọn lọc bằng lipase 72 3.11 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng nồng đợ enzyme đến hiệu làm giàu DHA theo phương pháp thủy phân chọn lọc bằng lipase 74 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng 100g ăn cá basa Bảng 1.2 Tỷ lệ acid béo khơng bão hịa bão hịa có ngun liệu dầu mỡ so với mỡ cá basa thô .8 Bảng 1.3 Thành phần acid béo mỡ cá basa thô và sau tinh luyện 12 Bảng 1.4 Nhiệt độ kết tinh sáp dầu 15 Bảng 1.5 Qui định nồng độ dung dịch kiềm tương ứng với nhiệt độ số acid dầu mỡ 17 Bảng 2.1 Hóa chất và dụng cụ, thiết bị sử dụng 40 Bảng 2.2 Hóa chất chuẩn bị cho xác định hoạt tính lipase 45 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm 50 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm 51 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm 52 Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm 54 Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm 55 Bảng 2.8 Bố trí thí nghiệm 56 Bảng 2.9 Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 58 Bảng 2.10 Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 59 Bảng 3.1 Kết khảo sát nguyên liệu dầu ban đầu 61 Bảng 3.2 Lượng cặn phospholipid thu các hàm lượng dung dịch NaCl 0,3% khác thủy hóa 62 Bảng 3.3 Lượng cặn phospholipid thu thủy hóa mức nhiệt độ xử lý khác 63 Bảng 3.4 Chỉ số acid và lượng dầu thất trung hịa nồng độ dung dịch NaOH (C%) khác 65 Bảng 3.5 Chỉ số acid và lượng dầu thất trung hịa các hàm lượng dung dịch NaOH (tính theo khối lượng dầu) khác 67 Bảng 3.6 Chỉ số acid dầu cá basa trung hịa các điều kiện nhiệt đợ thời gian khác 68 Bảng 3.7 Chỉ số PCI dầu các hàm lượng chất hấp phụ (đất hoạt tính) khác so với mẫu đối chứng trình tẩy màu 70 Bảng 3.8 Kết khảo sát dầu sau tinh luyện 71 Bảng 3.9 Chỉ số iod các mẫu acylglycerol và các khoảng thời gian tương ứng 73 Bảng 3.10 Chỉ số iod hỗn hợp acylglycerol sau phản ứng các nồng độ enzyme (UI/ml) khác 75 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá basa .4 Hình 1.2 Khối lượng giá trị xuất khẩu cá tra, cá basa vào Mỹ 1996-2012 Hình 1.3 Sơ đồ cơng nghệ sản xuất mỡ lỏng từ mỡ cá basa .9 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử DHA 23 Hình 1.5 Hình thái Lactobacillus plantarum 31 Hình 1.6 Cấu trúc tinh thể lipase Lactobacillus plantarum 34 Hình 1.7 Cơ chế xúc tác bề mặt lipase 35 Hình 1.8 Quá trình acyl hóa và đề acyl hóa 36 Hình 2.1 Dầu cá basa thô 40 Hình 2.2 Quy trình tinh luyện dầu cá basa 42 Hình 2.3 Quy trình làm giàu DHA bằng phương pháp thủy phân dùng lipase 47 Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 49 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng cặn thu theo hàm lượng dung dịch NaCl 0,3% sử dụng thủy hóa dầu cá basa thơ 62 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khối lượng cặn thu theo nhiệt đợ xử lý q trình thủy hóa dầu cá basa thơ 64 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số acid (mg KOH/g dầu) và lượng dầu thất thoát (%) theo nồng đợ dd NaOH q trình trung hịa 65 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số acid (mg KOH/g dầu) và lượng dầu thất thoát (%) theo hàm lượng dd NaOH q trình trung hịa 67 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi số acid dầu cá basa theo nhiệt đợ thời gian trung hịa 69 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự khác biệt về số PCI dầu mức hàm lượng chất hấp phụ khác so với mẫu đối chứng 70 Hình 3.7 Chỉ số iod các nghiệm thức sau các thời gian phản ứng khác 73 12 TCVN 2627:1993, “Dầu thực vật – Phương pháp xác định màu sắc, mùi độ trong.”, Trung tâm tiêu chuẩn chất lượng, Tổng cục Tiêu chuẩn – Đo lường – Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, Hà Nội Tiếng Anh: 13 Ana Paula Antunes Corrêa et al (2008), “Fractionation of fish oil with supercritical carbon dioxide.”, Journal of Food Engineering 88, 381–387 14 Algis J Vingrys et al (2001), “The role of omega-3 polyunsaturated fatty acids in retinal function.”, Fatty Acids 15 A Robles Medina et al (1999), “Lipase-catalyzed esterification of glycerol and polyunsaturated fatty acids from fish and microalgae oils ”, Journal of Biotechnology 70, 379–391 16 Jiaqi Huang et al (2010), “Purifying salmon oil using adsorption, neutralization, and a combined neutralization and adsorption process.”, Journal of Food Engineering, 96, pp 51 - 58 17 Subramaniam Sathivel et al (2010), “Purification of marine fish oils using a pilot scale adsorption column.”, Departments of Agricultural and Biological Engineering and Food Science, Louisiana State University Agricultural Center, Baton Rouge, LA 70803 - 4300 18 Shucheng Liu et al (2006), “Concentration of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) of tuna oil by urea complexation: optimization of process parameters.”, Journal of Food Engineering 73, 203–209 19 John Spinelli et al (1987), “Purification of fish oils.”, United States Patent 20 Nuria Rubio-Rodríguez et al (2009), “Production of omega-3 polyunsaturated fatty acid concentrate: A review.”, Innovative Food Science and Emerging Technologies 11, 1-12 21 Rohit Sharma et al (2001), “Production, purification, characterization, and applications of lipases.”, Biotechnology Advances 19, 627-662 80 22 Roxana Rosu et al (1998), “Enzymatic synthesis of glycerides from DHA-enriched PUFA ethyl ester by glycerolysis under vacuum.”, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 4, 191–198 23 Lopes et al (1999), “Influence of environmental factors on lipase production by Lactobacillus plantarum.”, Appl Microbiol Biotechnol 51:249-254 24 Lopes et al (2001), “Characterization of a highly thermostable extracellular lipase from Lactobacillus plantarum.”, International Journal of Food Microbiology 76, 107-115 25 Nguyen Tien Luc and Nguyen Anh Minh (2014), “Determine the Factors that Affect the Enrichment Process of High Bioactive Substance from Pangasius Oil ”, Current Research Journal of Biological Sciences 6(1): 46-52 26 “Lipase activity test – 1% tributyrin assay.”, ChiralVision 27 “Lactobacillus plantarum.”, University of Ottawa IGEM, 2009 28 United States Patent, Patent Number: 4,792,418, Date of Patent: Dec 20, 1988 Internet: 29 Wikipedia.org 30 Enologyaccess.org 31 Thefishsite.com 32 http://gap.org.vn/Th%C6%B0vi%C3%AAnd%E1%BB%B1%C3%A1n/GlobalG APv%E1%BB%81C%C3%A1Basa/tabid/721/Default.aspx 33 http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-nghien-cuu-cong-nghe-san-xuat-bot-ca-dichdam-tu-phu-pham-ca-tra-va-ca-basa-10448/ 34 http://saomaiag.vn/saomai/news/detail/gia-tri-dinh-duong-cua-ca-tra-basa33.html 81 Phà n phụ lụ c MỘT SỐ HÌNH ẢNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Dầu thô Dầu sau thủy hóa Hình ảnh quá trình trung hòa dầu Quá trình rửa dầu Hình ảnh dầu trước và sau tẩy màu L plantarum MRS lỏng L plantarum MRS thạch Hệ nhũ tương PVA và dầu Erlen phản ứng thủy phân và chiết sản phẩm với dung môi KẾT QUẢ PHAN TICH BÀ NG PHẦN MỀM STATGRAPHICS PLUS 3.0 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dung dịch muối NaCl (nồng độ 0,03%) sử dụng q trình thủy hóa đến lượng cặn Phospholipid thu Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,00006667/ 0,056 * 100 = 14,58% Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dung dịch muối NaCl (nồng độ 0,03%) sử dụng q trình thủy hóa đến lượng cặn Phospholipid thu Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,0000667 / 0,0613 * 100 = 13,32% Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến chỉ số acid hiệu suất thu hời dầu trung tính của dầu cá basa sau q trình trung hịa Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,00515161 / 0,868847 * 100 = 8,26% Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,00173333/ 6,42733 * 100 = 0,65% Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng dung dịch NaOH 4% đến chỉ số acid hiệu suất thu hời dầu trung tính của dầu cá basa sau q trình trung hịa Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,00167851 / 1,01354 * 100 = 4,04% Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn toàn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,0126933 / 4,91333* 100 = 2,29% Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thời gian trung hòa đến chỉ số acid của dầu sau trung hịa Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,00139876/ 0,685667* 100 = 5,45% Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chất hấp phụ (đất hoạt tính) đến chất lượng màu dầu cá basa q trình tẩy màu Trình bày: Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên cv = √TBBP sai số / trung bình chung * 100 = √0,0179962 / 1,44774* 100 = 9,27% Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu quả làm giàu DHA theo phương pháp thủy phân chọn lọc lipase ANOVA Table for Chi so iod by Nong enzyme Analysis of Variance Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 21.5482 21.5482 158.70 0.0062 Within groups 0.271562 0.135781 Total (Corr.) 21.8197 Table of Means for Chi so iod by Nong enzyme with 95.0 percent LSD intervals -Stnd error Nong enzyme Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -G1 75.223 0.260558 74.4303 76.0157 G2 79.865 0.260558 79.0723 80.6577 -Total 77.544 Multiple Range Tests for Chi so iod by Nong enzyme -Method: 95.0 percent Duncan Nong enzyme Count Mean Homogeneous Groups -G1 75.223 X G2 79.865 X -Contrast Difference -G1 - G2 *-4.642 -* denotes a statistically significant difference ... BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VI? ?N THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG SINH VI? ?N NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM GIÀU DHA TRONG DẦU CÁ BASA CỦA ENZYME. .. tiêu đề tài khảo sát khả làm giàu DHA và EPA có dầu cá basa bằng enzyme lipase ngoại bào thu nhận từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum, rút kết luận về hoạt tính lipase loại enzyme này,... tài nghiên cứu “Khảo sát khả làm giàu DHA dầu cá basa của enzyme lipase ngoại bào từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum? ?? MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Mục tiêu đề tài là khảo sát khả làm giàu DHA