Bài viết trình bày việc lựa chọn Delftiaacidovorans (NCCB 28024) làm chủng tham khảo (RDA) được mua từ Viện CBS của Hà Lan để so sánh với 2 phân lập Delftia giả định (Sh2-4 và So1-40) được sàn lọc từ các trại nuôi tôm ở Thái Lan bằng nuôi cấy và phân tích PCR.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II NGHIÊN CỨU VI KHUẨN KHƠNG THUỘC NHĨM Vibrio CĨ KHẢ NĂNG KẾT HỢP VỚI Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ở THÁI LAN Trương Hồng Việt1*, Ajaree Nilawongse2, Kallaya Sritunyalucksana2, Timothy W Flegel3, Siripong Thitamadee2,3 TĨM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease: AHPND) tôm nuôi nước lợ báo cáo Thái Lan từ năm 2012 Phân tích đoạn trình tự gen 16S rRNA thu từ mẫu tơm bình thường tơm bệnh cho thấy có diện số vi khuẩn khác nhóm Vibrio, bao gồm Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp., Acidovorax sp., Sphingomonas sp., Leifsonia sp., Rhodococcus sp ao tôm bị AHPND nhiều so với ao tơm bình thường Trong nghiên cứu này, chúng tơi chọn Delftiaacidovorans (NCCB 28024) làm chủng tham khảo (RDA) mua từ Viện CBS Hà Lan để so sánh với phân lập Delftia giả định (Sh2-4 So1-40) sàn lọc từ trại nuôi tôm Thái Lan ni cấy phân tích PCR Kết phân tích trình tự phần đoạn gen 16S rRNA cho thấy có tương đồng cao phân lập Sh2-4 RDA (92,6%), điều cho thấy phân lập lồi Delftia Ngược lại, So1-40 có tỷ lệ tương đồng 78,9%, chủng khác Đối với cảm nhiễm kết hợp, tôm tiêm Sh2-4 với mật độ 103 CFU/3g tôm theo dõi ngày, sau ngâm với Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) mật độ 104 CFU/ml (thấp 10 lần so với LC50=105 CFU/ml) Kết cho thấy phân lập nhiễm cộng hợp với VPAHPND gây dấu hiệu mô bệnh học khác với AHPND (với biểu bong tróc hàng loạt tế bào biểu mô ống gan tụy) Các dấu hiệu bao gồm tế bào biểu mô ống gan tụy bị tan vỡ, hình thành khơng bào tế bào E ống gan tụy không bào tế bào kẻ quan lymphô, có diện thể vùi bắt màu eosin tế bào chất tế bào thuộc mơ tạo máu Từ khóa: 16S rRNA, AHPND, EMS, Delftiaacidovorans, Vibrio parahaemolyticus I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) tơm ni tìm thấy lần miền Nam Trung Quốc (NACA-FAO, 2011) vào năm 2009 Sau đó, trường hợp tương tự báo cáo Việt Nam năm 2010 (Mooney, 2012), Malaysia năm 2011 (Lightner & ctv., 2012), Thái Lan năm 2012 (Flegel, 2012), (Leaño Mohan, 2012) Tại Thái Lan, EMS/AHPND xảy trại nuôi tôm miền Đông Thái Lan bao gồm tỉnh Chonburi, Rayong, Chantaburi, Trad vào cuối năm 2011 Tuy nhiên, dịch bệnh báo cáo thức vào đầu năm 2012 bao gồm hai tỉnh miền Nam (Surattani Songkhla) (FAO, 2013) Các dấu hiệu chung tôm bị AHPND bao gồm vỏ bị mềm, gan tụy bị teo sắc tố (FAO, 2013) Ở mức độ mơ bệnh học, gan tụy có biểu bong tróc hàng loạt tế bào biểu mô ống gan tế bào tiết (tế Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Khoa Công Nghệ Sinh học - Đại học Mahidol - Thái Lan Centex Shrimp - Đại học Mahidol - Thái Lan * Email: truonghongviet@yahoo.com 26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bào B), tế bào sợi (tế bào F), tế bào hấp thụ dự trữ (tế bào R), tế bào phôi hay tế bào mầm (tế bào E) (www.enaca.org) Mặc dù chủng phân lập Vibrio parahaemolyticus xác định tác nhân EMS/AHPND (Tran & ctv., 2013)first reported in 2009, was initially named early mortality syndrome (EMS, nhiên kết phân tích trình tự 16S rRNA nhiều chủng vi khuẩn khác Ralstonia sp., Delftia sp., Pelomonas sp., Acidovorax sp., Sphingomonas sp., Leifsonia sp., Rhodococcus sp diện mẫu tôm bệnh EMS cao mẫu tơm bình thường (Prachumwat ctv., 2012)then Vietnam since 2010 and more recently in 2011 to the eastern coast of Malaysia and the eastern coast of the gulf of Thailand So far no potential causative pathogen has been found and possible etiologies include toxins (biotic or abiotic Điều gợi ý chúng liên quan đến EMS Bởi Delftia sp chiếm tỷ lệ tương đối cao so sánh với vi khuẩn khác (Prachumwat ctv., 2012)then Vietnam since 2010 and more recently in 2011 to the eastern coast of Malaysia and the eastern coast of the gulf of Thailand So far no potential causative pathogen has been found and possible etiologies include toxins (biotic or abiotic, chủng chuẩn Delftia acidovorans (NCCB 28024) mua từ Viện CBS Hà Lan làm chủng tham khảo (RDA) để nghiên cứu đặc tính sâu Kết sơ từ gây nhiễm thực nghiệm phương pháp tiêm vào bụng Penaeus vannamei RDA gây thay đổi mơ bệnh học tơm thí nghiệm bao gồm tan vỡ tế bào biểu mô ống gan tụy, xuất không bào tế bào E ống gan không bào tế bào kẻ quan lymphô, có diện thể vùi bắt màu eosin tế bào chất tế bào thuộc mơ tạo máu Tuy nhiên, chưa có chủng phân lập Delftia phân lập từ trại tôm Thái Lan mà có dịch bệnh EMS hay AHPND Vì vậy, nghiên cứu nhóm vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng việc xác định tác nhân góp phần gây bệnh EMS II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chuẩn bị vi khuẩn Chủng tham khảo Delftia acidovorans (RDA) cấy ria môi trường TSA (tryptic soy agar) bổ sung 0,5% NaCl, ủ 30oC, 18-20 Một khuẩn lạc đơn chọn để tăng sinh ml môi trường TSB (tryptic soy broth) có bổ sung 0,5% NaCl, ủ 30oC, lắc 230 rpm 18 Dịch vi khuẩn giữ 15% glycerol nhiệt độ -80oC đến sử dụng Đối với chủng Vibrio parahaemolyticuscũng nuôi cấy tương tự Tuy nhiên, môi trường TSA TSB bổ sung 1,5% NaCl 2.2 Tách chiết ADN vi khuẩn Quy trình tách chiết ADN phương pháp phenol-chloroform (Sambrook ctv., 1989) dịch nuôi cấy vi khuẩn gan tụy tôm Dịch vi khuẩn ly tâm 12.000 rpm 10 phút để thu hạt vi khuẩn Các hạt vi khuẩn tái huyền phù 1000 μl đệm tách chiết ADN (pH = 8,0) có chứa 10 μl enzym proteinase K Đối với mẫu gan tụy cố định dung dịch RNA-later trước chuyển sang đệm tách chiết ADN Hỗn hợp huyền phù ủ 56oC Sau phenol thêm vào (1:1) tiếp tục ủ 56oC trước ly tâm 12.000 rpm 15 phút Thu nhận dịch thêm Chloroform (1:1) vào Hỗn hợp trộn ly tâm 12.000 rpm 15 phút Dịch thu nhận tiến hành kết tủa ADN isopropanol lạnh (1:1) Hỗn hợp làm lạnh -20oC 20 phút trước ly tâm 12.000 rpm 4oC 15 phút Hạt ADN rửa với ethanol 75% để khô nhiệt độ phòng trước tái huyền phù 30 μl đệm TE (pH = 8,0) Nồng độ ADN xác định nồng độ máy quang phổ bước sóng 260 nm Dung dịch ADN bảo quản -20oC đến sử dụng 2.3 Khuyếch đại ADN PCR Các mồi xuôi (F) mồi ngược (R) (Bảng 1) cho phân tích PCR thiết kế để khuyếch đại ADN chủng RDA (F1 R1) mồi dùng để xây dựng phát sinh loài (F6 R6) dựa vào trình tự đoạn gene 16S rRNA Delftia từ ngân hàng gene (NCBI) Dựa vào trình tự IGS TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 27 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II (intergenic spacer) để thiết kế mồi bao gồm khuyếch đại ADN để sàng lọc loài Delftia giả định thu từ trại tôm (F2 R2); khuyếch so sánh phân loại (F3 R3); khuyếch đại ADN đặc hiệu cho RDA (F4 R4) Delftia giả định (Sh2-4) (F5 R5) Bảng 1: Các cặp mồi dùng để khuyếch đại Mồi Trình tự (5’ -3’) F1 Random primer (oligohexamer) R1 CCG AGG CAT TAC TCA CCC G F2 CTT GCG AGA TTT CGC CGT TT R2 GGA GGG AGC GAA AAG AGC AT F3 CTC TTT CCG TCA GCA ACG CTG ATT R3 AGT CGT AAC AAG GTA GCC GTA TCG F4 CTT GCG AGA TTT CGC CGT TTC R4 TGG TGG CAG CAG CTT GAA AA F5 CAG ACG CTC AAC AAC TTG AG R5 ATG AGC AAG GTC CAC AAA CG F6 CAC GAC TAC CAG GGT ATC TA R6 GCC TAA ACA CAT GCA AGT CG 2.4 Phân lập lồi Delftia từ tơm mẫu mơi trường Để sàng lọc Delftia sp giả định từ trại tôm, môi trường TSA khơng chứa NaCl sử dụng, mơi trường thích hợp cho tăng trường RDA ức chế tăng trưởng Vibrio parahaemolyticus Mẫu tôm mẫu môi trường từ tỉnh Samutsakorn Trad (3 mẫu tôm EMS, mẫu cặn, mẫu đất) cấy ria trực tiếp môi trường TSA không chứa NaCl Đĩa cấy ủ 30oC vòng 24-48 Các khuẩn lạc đơn chọn cấy tăng sinh TSB, giữ glycerol 15% bảo quản -80oC cho thí nghiệm sâu 2.5 Thí nghiệm sinh học - Chuẩn bị tơm Tơm thẻ SPF (specific-pathogen free) bệnh có trọng lượng 2-3g mua từ trại giống nuôi bể nhựa chứa nước biển nhân tạo 20 ppt (Marinium) có sục khí từ 3-5 ngày 28 Kích thước 1000 bp 347 bp 515 bp (RDA) 598 bp (Sh2-4) 373 bp 360 bp 756 bp - Chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm gây nhiễm Vi khuẩn từ ống giữ giống cấy ria TSA+0,5% NaCl, ủ 30oC 24 Một khuẩn lạc đơn tăng sinh ml TSB+0,5% NaCl, ủ 30oC, lắc 230 rpm Sau chuyển tất dịch nuôi cấy vào 50 ml TSB+0,5% NaCl mới, ủ điều kiện Kiểm tra OD bước sóng 600nm máy quang phổ đạt OD600nm = 0,65 (2,01 x 108 CFU/ml) RDA OD600nm = 0,7 (2,02 x 108 CFU/ml) 5HP - Xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) V parahaemolyticus Thí nghiệm thực mơ tả Joshi ctv., 2014 Gây nhiễm cách ngâm với nồng độ vi khuẩn khác bao gồm 103, 104, 105, 106 CFU/ml 15 lít nước biển nhân tạo có độ mặn 20 ppt Mỗi mật độ vi khuẩn lặp lại lần với 10 tơm/bể Hai bể nhóm đối chứng ngâm với 150 ml TSB+1,5% NaCl vô trùng Tôm chết TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ghi nhận cố định dung dịch Davidson để phân tích mơ bệnh học - Thí nghiệm gây nhiễm đơn gây nhiễm kết hợp * Thí nghiệm gây nhiễm đơn chia làm nhóm Nhóm tiêm với 100 μl RDA với nồng độ 103 CFU/3g tơm Nhóm tiêm với 100 μl PBS làm nhóm đối chứng Thí nghiệm thực với lần lặp lại bể chứa 10 tôm Tôm chết cố định dung dịch Davidson để phân tích mơ bệnh học * Thí nghiệm gây nhiễm kết hợp chia làm nhóm Nhóm tiêm với 0,1 ml PBS làm đối chứng âm; nhóm tiêm 0,1 ml Delftia giả định (Sh2-4) với nồng độ 103 CFU/3g tôm Sau tiêm, tôm nuôi ngày trước gây nhiễm ngâm V parahaemolyticus (5HP) với mật độ 104 CFU/ml Mỗi bể chứa 10 tơm 15 lít nước biển nhân tạo có độ mặn 20 ppt Mỗi nhóm thí nghiệm lặp lại bể Tôm hấp hối chết vớt cố định dung dịch Davidson để phân tích mơ bệnh học - Phương pháp mơ học Quy trình dựa theo phướng pháp Bell & Lightner (1998) Tôm hấp hối chết cố định 24 dung dịch Davidson (Cồn 95%: 330 ml; Formalin 100%: 220 ml; axit acetic 115 ml; nước cất: 335 ml), chuyển qua cồn 70% để bảo quản lâu Mô tôm khử nước, đúc vào khối paraffin, cắt thành miếng mỏng μm, nhuộm với hematoxylin eosin 2.6 Phân tích thống kê Số liệu thí nghiệm phân tích thống kê phần mềm SPSS 20.0 Thống kê thực bao gồm phân tích ANOVA để tìm khác tỷ lệ chết nồng độ vi khuẩn theo thời gian thí nghiệm xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính để xác định LC50 III KẾT QUẢ 3.1 Kết gây nhiễm Delftia acidovorans (RDA) Để xác định xem Delftia acidovorans (NCCB 28024) gây chết tôm hay không, vi khuẩn tiêm vào tôm thẻ với nồng độ 103 CFU/3g tôm Kết thí nghiệm tơm bắt đầu chết sau ngày tiêm đạt đến tỷ lệ chết tích lũy 100% sau 12 ngày, nghiệm thức đối chứng có tỷ lệ chết 10% (Hình 1) Hình Tỷ lệ chết tích lũy (%) tôm sau gây nhiễm với D acidovorans - Kết phân tích mơ học Gan tụy tơm hấp hối chết cho thấy khơng có dấu hiệu điển hình bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) bong tróc tế bào biểu mơ ống gan Thay vào đó, tế bào biểu mơ ống gan có biểu bị tan vỡ, xuất nhiều u hạt ống gan nhiễm khuẩn, xuất nhiều không bào tế bào E (hình 2A, B, C) Ngược lại, gan tụy tơm đối chứng có biểu bình thường (Hình 2D) Nhìn chung, kết D acidovorans gây chết tôm thay đổi cấu trúc mô bệnh học TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 29 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Vi ảnh mơ gan tôm bị tiêm D acidovorans Các biểu mô bị tan vỡ (A), hình thành nhiều u hạt (B), nhiều khơng bào tế bào E (C), gan bình thường tôm đối chứng (D) Các mũi tên dấu hiệu mơ bệnh học Hình A (độ phóng đại 10X), hình B, C, D (độ phóng đại 20X) 3.2 Dịng hố đoạn trình tự gen 16S rRNA vùng IGS Delftia acidovorans Để phát triển phương pháp phát D acidovorans dựa vào PCR, cặp mồi F1 R1 (Bảng 1) thiết kế để phát đặc hiệu dựa vào trình tự gen 16S rRNA vùng IGS (đoạn trình tự nằm gen 23S 16S) Kích thước sản phẩm thu khoảng 1.000 bp (Hình 3A) Đoạn DNA thu làm đối tượng để dịng hố cách nối vào vector pGEM-T chuyển vào chủng E coli (DH5α) Ba dòng thu nhận khẳng định lại PCR với mồi T7 SP6 vector (Hình 3B) Hình Kết điện di gel agarose sản phẩm PCR (giếng 1) kích thước sản phẩm 1.000 bp; (giếng 2) đối chứng âm; (giếng 3, 4, 5) sản phẩm PCR sau dịng hố 1.100 bp Giếng M thang thị phân tử - Phân tích trình tự Ba dịng có chứa đoạn ADN với kích thước khoảng 1100 bp gửi đến cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự Kết giải trình tự thu đoạn trình tự có kích thước 945 bp Khi so sánh trình tự với ngân hàng gen (GenBank) Blastn, kết có 30 tương đồng với đoạn trình tự chứa phần trình tự gen 23S, vùng trình tự IGS, phần gen 16S rRNA Delftia acidovorans SPH-1 (CP000884.1) Delftia sp Cs1-4 (CP002735.1) với độ tương đồng 99%, độ phủ đoạn trình tự 98%, giá trị kỳ vọng E=0,0 (Hình 5) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCCAAGGCATCCACCACATGCTCTTAGTC 53 ACTTGACCCTATAACTTTGATCTCTCTTGCGAGATTTCGCCGTTTTCTTTCAA 106 GGACTTGCGAGGTCTCTCACCTCGCGCGTTATGCCGTAATGTGAATGAATTCT 159 TTGACATTTCTGCCAAGAGAACAATTCGTCATTACTTGAATAAAACAAAGTTT 212 CATTCGTTTTGACGCAATCAAAATGTTGCTGACGGCACGGTGAGATTGAAATC 265 TCTTTCCGTCAGCAACGCTGATTTCGACTCTATGAATTTTTAAAGAACAGCCG 318 ATTGATGGTTAGATAACTATCAACACTAAAGCAGTCTCACACGAGACTGCTTT 371 AGTGTTGAGTCAAATATTATAGCACGCTTTTTTCATGCTCTTTTCGCTCCCTC 424 CAGCCGCTTTTTCAAGCTGCTGCCACCAGCGCGATCTTGGTGGAGGATGACGG 477 GATCGAACCGACGACCCCCTGCTTGCAAAGCAGGTGCTCTCCCAGCTGAGCTA 530 ATCCCCCGGGATCCTCGACAACCAGATATTGGAATCTTGGTGGGTCTAGTTGG 583 GCTCGAACCAACGACCCCCGCCTTATCAAGACGGTGCTCTAACCAGCTGAGCT 636 ACAGACCCAGTCCACCCACCCTGCAACCAGGGCACATGGCTTGTTCCAACAAC 689 CGATAAGTGTGGGCGTTCAACTTGAACAGCAGTTTTCCAGAAAGGAGGTGATC 742 CAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCACGAA 795 CCCCGCCGTGGTAAGCGCCCTCCTTGCGGTTAGGCTACCTACTTCTGGCGAGA 848 CCCGCTCCCATGGTGTGACGGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGGAACGTATTC 901 ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCAT 945 Hình Trình tự 945 bp thu từ PCR D acidovorans bao gồm phần trình tự gen 23S (1 gạch dưới), vùng IGS (không gạch dưới), phần trình tự gen 16S (2 gạch dưới) Hình Kết Blastn đoạn trình tự 945 bp GenBank 3.3 Các mồi phát đặc hiệu cho Delftia acidovorans Kết Blastn đoạn trình tự vị trí 350 đến 450 nucleotide khác biệt với lồi vi khuẩn khác (Hình 5) Dựa vào vùng để thiết kế mồi phát đặc hiệu cho Delftia (F2 R2) (Bảng 1) PCR Kết cho thấy sản phẩm PCR với kích thước 347 bp phát đặc hiệu với D acidovorans (Hình 6) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 31 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn điện di gel agarose Ảnh trên, Đối chứng âm (giếng 1), Sản phẩm khếch đại DNA gen D acidovorans(giếng 2), Leifsonia sp (3), Rhodococcus sp.(4), Shewanella sp (5), V parahaemolyticus (VPAHPND) (6) Ralstonia sp (lane7) Ảnh kết PCR đối chứng nội gen 16S rRNA vi khuẩn với mồi chung (40F 802R) Giếng M thang thị phân tử 3.4 Tối ưu môi trường nuôi cấy để sàn lọc Delftia sp trại tôm Thái Lan - Môi trường MacConkey (MAC) môi trường phân lập Pseudomonas (PIA) D acidovorans cho quan hệ gần với nhóm Pseudomonas có tên trước Pseudomonas acidovorans Comamonas acidovorans (Jong, 1926) MAC PIA môi trường chọn lọc để sàn lọc vi khuẩn đường ruột vi khuẩn Pseudomonas Vì vậy, hai mơi trường sử dụng để sàn lọc Deftia sp từ trại tôm Tuy nhiên, kết V parahaemolyticus mọc môi trường, D acidovorans mọc (Hình 7) Hình Sự phát triển V parahaemolyticus (5HP) D acidovorans (NCCB 28024) nuôi cấy 30oC 24 MAC (A) PIA (B) - Môi trường TSA không chứa NaCl Môi trường TSA không chứa NaCl rõ ràng thúc đẩy phát triển D acidovorans sau 24 nuôi cấy 30oC phát triển 32 V parahaemolyticus bị ức chế (Hình 8A) Ngược lại, TSA bổ sung 1,5% NaCl ức chế phát triển Delftia so sánh với phát triển V parahaemolyticus (Hình 8B) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình Sự phát triển V parahaemolyticus (chủng 5HP) D.acidovorans (NCCB 28024) nuôi cấy 30oC 24 (A) TSA không chứa NaCl, (B) TSA bổ sung 1,5% NaCl 3.5 Phân lập Delftia sp từ ao tôm bị EMS Thái Lan Môi trường TSA không chứa NaCl dùng để sàn lọc Delftia sp từ mẫu thu trại tôm bị EMS Các chủng phân lập sàn lọc PCR với mồi đặc hiệu cho Delftia (F2 R2) Những dịng cho kết dương tính PCR bao gồm chủng phân lập từ mẫu đất (So140), chủng phân lập từ mẫu cặn (Se1-91), chủng phân lập từ tơm (Sh2-4) (Hình 9) Chủng phân lập Se1-91 bị loại khỏi nghiên cứu khuẩn lạc có màu xanh mơi trường chứa X-gal thay màu vàng Delftia Hình Sàn lọc Delftia sp giả định dựa vào PCR từ mẫu tôm môi trường thu từ trại tôm Đối chứng (-) (giếng 1), D acidovorans(+) (2), Sh2-4 (+) (3), Se1-46 (-) (4), So1-87 (-) (5), Se1-91 (+) (6), So2-108 (-) (7), So1-40 (+) (8) Chỉ thị phân tử (M) 3.6 Xác định chủng phân lập So1-40 Sh2-4 trình tự gen 16S rRNA Để thực phân loại chủng phân lập So1-40 Sh2-4, đoạn gen 16S rRNA khuyếch đại PCR gửi giải trình tự với mồi (F6 R6) (Bảng 1) Chủng RDA dùng đối chứng Các đoạn khuyếch đại thu từ RDA Sh2-4 có kích thước 756 bp đoạn khuyếch đại So1-40 770 bp (Hình 10, 11, 12) So sánh NCBI Blastn RDA tương đồng 99% với chủng D acidovorans B201, Sh2-4 tương đồng 99% với vi khuẩn không nuôi cấy cD0267 (AJ617899.1), So1-40 tương đồng 99% với Bacillus (KU921070.1) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 33 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 10 Đoạn gen 16S rRNA RDA (756 bp) Các mồi giải trình tự (gạch dưới) Hình 11 Đoạn gen 16S rRNA Sh2-4 (756 bp) Các mồi giải trình tự (gạch dưới) Hình 12 Đoạn gen 16S rRNA So1-40 (770 bp) Các mồi giải trình tự (gạch dưới) So sánh đoạn trình tự 16S RDA Sh2-4 So1-40 cách thẳng hàng trình tự phần mềm CLUSTAL 2.1 Kết điểm số thẳng hàng 92,6% 78,9% (Hình ảnh thẳng hàng trình tự khơng trình bày) Điều gợi ý Sh2-4 lồi Delftia - Xây dựng phân lồi dựa vào trình tự gen 16S rRNA Cây phân lồi xây dựng từ trình tự đoạn gen 16S rRNA thu RDA, Sh2-4, So1-40 phần mềm MEGA 6.06 Kết cho thấy RDA thành viên nhánh loài Delftia gồm D acidovorans Tuy nhiên, chủng phân lập Sh2-4 nằm vị trí 34 nhánh Delftia Ralstonia Kết gợi ý Sh2-4 loài Delftia thuộc họ Comamonadaceae, Burkhodariales với số bootstrap 86% Ngược lại, So1-40 nằm nhánh với họ Bacillaceae với số bootstrap 100% (Hình 13) Vì vậy, So1-40 khơng tiếp tục nghiên cứu sâu TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 13 Cây phân lồi lồi vi khuẩn dựa trình tự 16S rRNA RDA nhánh loài Delftia, Sh2-4 rơi vào nhánh Delftia Ralstonia Chủng So1-40 nhánh loài Bacillus Các số nốt nhánh thể tỷ lệ phần trăm số bootstrap Chiều dài thước (bên phân loại) biểu thị số khác biệt nucleotide 3.7 Thiết kế mồi đặc hiệu riêng biệt cho RDA Sh2-4 dựa vào vùng IGS Để kiểm tra vùng IGS dùng để phân loại chủng riêng biệt hay không, trình tự đoạn IGS RDA Sh2-4 khếch đại PCR với cặp mồi F3 R3 (Bảng 1) Kết giải trình tự sản phẩm PCR thu trình tự có độ dài 515 bp RDA (Hình 14) 598 bp Sh2-4 (Hình 15) Hai trình tự dùng để thiết kế mồi đặc hiệu để phát riêng biệt cho RDA với cặp mồi F4 & R4 (Bảng 1) cho kích thước sản phẩm 373 bp (Hình 16) Sh2-4 với cặp mồi F5 & R5 (Bảng 1) cho kích thước sản phẩm 360 bp (Hình 17) CTCTTTCCGTCAGCAACGCTGATTTCGACTCTATGAATTTTTAAAGAACAGCCGATTGATAGTTAGATAACTATCAACACTAAAG CAGTCTCACACGAGACTGCTTTAGTGTTGAGTCAAATATTATAGCACGCTTTTTTCGTGCTCTTTTCGCTTCCTCCAGCTGCTTTTTC AAGCTGCTGCCACCAGCGCGATCTTGGTGGAGGATGACGGGATCGAACCGACGACCCCCTGCTTGCAAAGCAGGTGCTCTCCCAGCTG AGCTAATCCCCCGGGATCCTCGACAACCAGATATTGGAATCTTGGTGGGTCTAGTTGGGCTCGAACCAACGACCCCCGCCTTATCAAG ACGGTGCTCTAACCAGCTGAGCTACAGACCCAGTCCACCCACCCTGCAACCAGGGCACATGGCTTGTTCCAACAACCGATAAGTGTGG GCGTTCAACTTGAACAGCAGTTTTCCAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACT Hình 14 Trình tự đoạn khuyếch đại vùng IGS RDA (515 bp.) Đoạn trình tự gạch trình tự mồi cho PCR giải trình tự Hình 15 Trình tự đoạn khuyếch đại vùng IGS Sh2-4 (598 bp.) Đoạn trình tự gạch trình tự mồi cho PCR giải trình tự TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 02/2017 35 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 16 Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn điện di gel agarose Đối chứng âm (giếng 1), Sản phẩm khuyếch đại ADN gen Sh2-4 (2), RDA(3), So1-40 (4), V parahaemolyticus gây AHPND (5), Leifsonia sp (6), Rhodococcus sp.(7), Ralstonia sp (8), Shewanella sp (9) Giếng M thang thị phân tử Kích thước sản phẩm 373 bp Hình 17 Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn điện di gel agarose Đối chứng âm (giếng 1), Sản phẩm khuyếch đại ADN gen Sh2-4 (2), RDA(3), So1-40 (4), V parahaemolyticus gây AHPND (5), Leifsonia sp (6), Rhodococcus sp (7), Ralstonia sp (8), Shewanella sp (9) Giếng M thang thị phân tử Kích thước sản phẩm 360 bp 3.8 Xác định nồng độ gây chết 50% (LC50) Vibrio parahaemolyticus (VPAHPND) LC50 VPAHPND xác định trước thực gây nhiễm kết hợp vớ Sh2-4 nghiên cứu Kết thời gian chết tơm thí nghiệm 48 có khác biệt ý nghĩa thống kê (P