Mục tiêu của nghiên cứu này là khảo sát tỷ lệ nhiễm Vibrio parahaemolyticus và đánh giá hiện trạng kháng kháng sinh của V. parahaemolyticus tại ĐBSCL. Nghiên cứu được thực hiện qua điều tra việc sử dụng kháng sinh tại 76 ao tôm thẻ và tôm sú nuôi thương phẩm và xác định sự hiện diện của V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND trong tổng số 396 mẫu tôm, nước và bùn thu ở ĐBSCL.
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II SỰ HIỆN DIỆN CỦA Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH VÀ HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG KHÁNG SINH VÀ KHÁNG KHÁNG SINH TRÊN TÔM NUÔI TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Nguyễn Diễm Thư1*, Lê Hồng Phước1, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Mã Tú Lan1 TÓM TẮT Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) gây vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây thiệt hại kinh tế đáng kể nghề nuôi tôm Việt Nam Nghiên cứu trước cho thấy V parahaemolyticus kháng với nhiều loại kháng sinh việc lạm dụng thuốc kháng sinh để kiểm sốt bệnh nhiễm khuẩn ni trồng thủy sản Hiện có thơng tin trạng sử dụng thuốc kháng sinh tần số xuất V parahaemolyticus tôm nuôi Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL), Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu khảo sát tỷ lệ nhiễm Vibrio parahaemolyticus đánh giá trạng kháng kháng sinh V parahaemolyticus ĐBSCL Nghiên cứu thực qua điều tra việc sử dụng kháng sinh 76 ao tôm thẻ tôm sú nuôi thương phẩm xác định diện V parahaemolyticus gây bệnh AHPND tổng số 396 mẫu tôm, nước bùn thu ĐBSCL 47 chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập thử kháng sinh đồ với 13 loại kháng sinh Kết cho thấy diện V parahaemolyticus gây bệnh AHPND 12,37% tổng số 396 mẫu (tôm, nước bùn) Kết điều tra cho thấy oxytetracycline, doxycycline enrofloxacin ba loại kháng sinh sử dụng phổ biến tôm nuôi Các chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND có tỉ lệ kháng cao với amoxicillin (80,85%) ampicillin (78,72%), khơng nên sử dụng hai loại kháng sinh điều trị bệnh AHPND V parahaemolyticus Từ khóa: Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND, kháng sinh, kháng kháng sinh, tôm nuôi I ĐẶT VẤN ĐỀ Vibrio parahaemolyticus mang gen độc, tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) hay hội chứng chết sớm (EMS), gây thiệt hại kinh tế đáng kể trang trại nuôi tôm Bệnh thường xảy khoảng ngày sau thả giống, phát triển cách nhanh chóng gây chết nghiêm trọng 20 đến 30 ngày nuôi đầu (Han et al., 2015) Triệu chứng lâm sàng tôm bệnh bao gồm tăng trưởng chậm, ruột rỗng ruột bị đứt đoạn, bơi xoắn ốc, lỏng vỏ, màu sắc nhợt nhạt Tôm bệnh cho thấy dấu hiệu gan bất thường gan teo, nhỏ, gan sưng, màu đen nhạt màu (Lightner et al., 2013; Zorriehzahra & Banaederakhshan, 2015) Tần suất nhiễm bệnh thường xảy nhiều hệ thống ni tơm thâm canh nên thường địi hỏi việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh Sử dụng kháng sinh khơng liều lượng phịng trị bệnh nhiễm khuẩn Trung tâm Quan trắc Môi trường & Bệnh Thủy sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II * Email: thu_seven@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 75 VIỆN NGHIÊN CỨU NI TRỒNG THỦY SẢN II ni trồng thủy sản cho có liên quan dẫn đến kháng thuốc vi khuẩn (Elmahdi et al., 2016) Các thông tin việc sử dụng thuốc kháng sinh tôm nuôi tần suất diện V parahaemolyticus gây bệnh AHPND hạn chế ĐBSCL, Việt Nam Nghiên cứu nhằm xác định tần suất xuất V parahaemolyticus gây bệnh AHPND mẫu tôm, mẫu nước mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm; đánh giá việc sử dụng kháng sinh phịng trị bệnh cho tơm ni; việc thử kháng sinh đồ chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND nhằm lựa chọn kháng sinh phù hợp cho việc điều trị loại bệnh tôm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Điều tra việc sử dụng kháng sinh thu mẫu Điều tra vấn thực với chủ trang trại nhân viên kỹ thuật 76 ao nuôi tôm nuôi thương phẩm gồm 37 ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) 39 ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu Bến Tre vào năm 2015 Điều tra vấn tiến hành qua việc sử dụng phiếu điều tra soạn sẵn gồm hai phần: i) Đặc điểm ao nuôi kỹ thuật quản lý ao, ii) Dịch bệnh việc sử dụng thuốc kháng sinh Tổng cộng 396 mẫu thu gồm 131 mẫu tôm, 131 mẫu nước 134 mẫu bùn thu 131 ao nuôi tỉnh Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Kiên Giang Bến Tre năm 2015 Mẫu tôm thu từ ao ni tơm có dấu hiệu chết nghi ngờ nhiễm V parahaemolyticus Các ao có thu mẫu tôm thu thêm mẫu nước mẫu bùn để kiểm tra diện V parahaemolyticus 2.2 Phân lập định danh vi khuẩn Khuẩn lạc nghi ngờ V parahaemolyticus với đặc điểm màu tím hoa cà môi trường CHROMagarTM Vibrio màu xanh 76 môi trường TCBS (thiosulfate citrate bile salts sucrose agar) lựa chọn xác nhận V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phương pháp duplex PCR Quy trình duplex PCR sử dụng theo phương pháp Han et al., (2015) nhằm phát hai gen gây độc pirA pirB với cặp mồi VpPirA-284F/R (VpPirA-284F: 5’-TGACTATTCTCACGATTGGACTG-3’, VpPirA-284R: 5’-CACGACTAGCGCCATTG TTA-3’) VpPirB-392F/R (VpPirB-392F: ’ - T G AT G A A G T G AT G G G T G C T C - ’ , VpPirB-392R: 5’-TGTAAGCGCCGTTTAAC TCA-3’) Quy trình duplex PCR gồm giai đoạn biến tính ban đầu 94°C phút, 35 chu kỳ 94°C 30 giây, 60°C 30 giây, 72°C 30 giây; giai đoạn cuối 72°C phút 2.3 Phương pháp thử kháng sinh đồ Thử nghiệm kháng sinh đồ V parahaemolyticus thực theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Tendencia, 2004), theo hướng dẫn Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2014) Các kháng sinh thử nghiệm là: ampicillin (AMP), amoxicillin (AM), gentamicin (GM), kanamycin (KA), oxytetracycline (OTC), tetracycline (TC), doxycycline (DOX), ciprofloxacin (CIP), trimethoprim sulfamethoxazol (bactrim), norfloxacin (NOR), florfenicol (FLO), neomycin (NEO), erythromycin (ERY) 2.4 Phương pháp phân tích số liệu Dữ liệu nhập phân tích thống kê phần mềm SPSS 16.0 (SPSS Inc., USA) III KẾT QUẢ 3.1 Sự diện V parahaemolyticus gây bệnh AHPND Trong 396 mẫu thu, tổng cộng 226 khuẩn lạc nghi ngờ V parahaemolyticus với đặc điểm màu tím hoa cà mơi trường CHROMagarTM Vibrio màu xanh môi trường TCBS phân lập 49 mẫu V parahaemolyticus TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II mang gen độc pirA gen pirB xác nhận phương pháp duplex PCR (Bảng 1) Tỷ lệ V parahaemolyticus gây bệnh AHPND 396 mẫu 12,37% (49/396) Bảng Tần suất xuất V parahaemolyticus gây bệnh AHPND ĐBSCL Tỉnh Số khuẩn lạc/mẫu nghi ngờ V parahaemolyticus Số khuẩn lạc/mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND Tôm Nước Bùn Tôm Nước Bùn Bạc Liêu 7/35 10/35 15/35 0 Bến Tre 1/4 1/4 5/9 0 Sóc Trăng 12/27 5/27 26/25 6 Kiên Giang 27/38 29/38 23/38 11 Cà Mau 19/27 19/27 27/27 Tổng mẫu 66/131 64/131 96/134 18 13 18 Tần suất (%) 50,38 48,85 71,64 13,74 9,92 13,43 3.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh ao nuôi tôm Kết khảo sát trang trại cho thấy 16 loại kháng sinh khác sử dụng (Hình 1) 68,9% số nơng hộ báo cáo có sử dụng kháng sinh Hơn nửa số nông hộ (62%) cho biết sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh xảy ra, 38% số nông hộ báo cáo sử dụng kháng sinh để phòng bệnh Oxytetracycline (31,7%), doxycycline (12,7%) enrofloxacin (7,9%) ba loại kháng sinh sử dụng phổ biến Hình Tỷ lệ sử dụng kháng sinh tỉnh Đồng sông Cửu Long TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 77 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.3 Hiện trạng kháng kháng sinh AHPND gây bệnh Vibrio parahaemolyticus Khả nhạy cảm kháng sinh 47 mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập thử kháng sinh đồ với 13 loại kháng sinh Tỉ lệ nhạy, kháng trung gian kháng loại kháng sinh với vi khuẩn phân lập trình bày Bảng Hầu hết tất chủng V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập tìm thấy có khả kháng với amoxicillin (80,85%), 78,72% kháng với ampicillin, 27,66% kháng với florfenicol, 23,40% kháng với kanamycin 21,28% kháng với oxytetracycline Norfloxacin loại kháng sinh nhạy cao (97,87%) số mẫu vi khuẩn phân lập nghiên cứu Bảng Tỉ lệ mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND nhạy, kháng trung gian kháng loại kháng sinh (n = 47) Kháng STT Kháng sinh Nhạy n % n % n % Ampicillin 37 78,72 14,89 6,38 Amoxicillin 38 80,85 17,02 2,13 Gentamicin 6,38 10,64 39 82,98 Kanamycin 11 23,40 23 48,94 13 27,66 Oxytetracycline 10 21,28 28 59,57 19,15 Tetracycline 12,77 12,77 35 74,47 Doxycycline 6,38 2,13 43 91,49 Ciprofloxacin 0 6,38 44 93,62 Bactrim 19,15 10,64 33 70,21 10 Norfloxacin 0 2,13 46 97,87 11 Florfenicol 13 27,66 2,13 33 70,21 12 Neomycin 14,89 38 80,85 4,26 13 Erythromycin 2,13 42 89,36 8,51 45 mẫu tổng số 47 mẫu V parahaemolyticus (95,7%) cho thấy kháng với loại kháng sinh 42 mẫu (98,4%) cho thấy kháng với hai loại kháng sinh trở lên 23 mẫu (70,2%) kháng với ba loại kháng sinh trở lên 6,4% 78 Kháng trung gian chủng phân lập kháng với năm sáu loại thuốc kháng sinh Hai số chủng gây bệnh AHPND (4,3%) nhạy với 13 loại kháng sinh thử kháng sinh đồ (Bảng 3) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng Tần số kháng kháng sinh mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND Loại Số chủng vi khuẩn Tỉ lệ (%) Không kháng 4,3 Kháng loại kháng sinh 6,4 Kháng loại kháng sinh 19,1 Kháng loại kháng sinh 25 53,2 Kháng loại kháng sinh 4,3 Kháng loại kháng sinh 6,4 Kháng loại kháng sinh 6,4 Tổng 47 100 IV THẢO LUẬN Nghiên cứu cho thấy V parahaemolyticus gây bệnh AHPND diện với tỉ lệ 12,37% mẫu thu tỉnh ven biển ĐBSCL Nghiên cứu Huỳnh Ngọc Trưởng ctv., (2015) cho thấy tần số xuất V parahaemolyticus mẫu cá nước Tiền Giang chiếm tỉ lệ cao 13,97% Oxytetracycline, doxycycline enrofloxacin ba loại kháng sinh sử dụng nhiều tỉnh khảo sát Cà Mau, Sóc Trăng, Bạc Liêu Bến Tre Kết phù hợp với kết Mai Văn Tài ctv., (2004) cho thấy oxytetracycline doxycycline loại kháng sinh sử dụng phổ biến nuôi trồng thủy sản Đáng ý, việc sử dụng enrofloxacin nuôi trồng thủy sản bị cấm Việt Nam enrofloxacin sử dụng nuôi tôm ĐBSCL Kết nghiên cứu cho thấy hầu hết mẫu V parahaemolyticus gây bệnh AHPND phân lập kháng với amoxicillin ampicillin Các nghiên cứu trước cho thấy V parahaemolyticus đề kháng cao với ampicillin Malaysia (63,1%), Thái Lan (72%) Indonesia (98%) (Al-Othruvi et al, 2014; Lesmana et al, 2001; Yano et al., 2011) Đa số mẫu V parahaemolyticus phân lập (95,7%) cho thấy kháng với loại kháng sinh số chủng V parahaemolyticus kháng với năm sáu loại thuốc kháng sinh Kết nghiên cứu tương tự với kết Đặng Thị Hoàng Oanh ctv., (2006) Huỳnh Ngọc Trưởng ctv., (2015) báo cáo V parahaemolyticus kháng với bốn, năm sáu loại thuốc kháng sinh V KẾT LUẬN Sự diện V parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy 12,37% tổng số mẫu 396 mẫu tôm, mẫu nước mẫu bùn thu tỉnh ĐBSCL Oxytetracycline, doxycycline enrofloxacin báo cáo sử dụng nhiều tôm nuôi Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ cao V parahaemolyticus gây bệnh AHPND kháng với amoxicillin ampicillin, khuyến cáo khơng nên sử dụng amoxicillin ampicillin điều trị bệnh TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 79 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng Nguyễn Thanh Phương, 2006 Xác định vị trí phân loại khả kháng kháng sinh vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) Tạp chí nghiên cứu khoa học, tr 42 – 52 Huỳnh Ngọc Trưởng, Trần Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Tiến Dũng, 2015 Tình hình nhiễm tỉ lệ kháng thuốc Vibrio spp phân lập từ thủy sản nước nuôi Tiền Giang Tạp chí Khoa học (67): 157 Mai Văn Tài ctv., 2004 Báo cáo tóm tắt đề tài: Đánh giá trạng loại thuốc, hóa chất chế phẩm sinh học dùng nuôi trồng thủy sản nhằm đề xuất giải pháp quản lý Tài liệu tiếng Anh Al-Othrubi, S M., Kqueen, C Y., Mirhosseini, H., Hadi, Y A., & Radu, S., 2014 Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from cockles and shrimp sea food marketed in Selangor, Malaysia Clinical Microbiology: Open Access, 2014 Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 24th informational supplement Approved standard M100-S24 Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 226 pp Elmahdi, S., DaSilva, L V., & Parveen, S., 2016 Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in various countries: A review Food microbiology, 57, 128-134 Han, J E., Tang, K F., Tran, L H., & Lightner, D V., 2015 Photorhabdus insect-related 80 (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp Diseases of aquatic organisms, 113(1), 33-40 Lesmana, M., Subekti, D., Simanjuntak, C H., Tjaniadi, P., Campbell, J R., & Oyofo, B A., 2001 Vibrio parahaemolyticus associated with cholera-like diarrhea among patients in North Jakarta, Indonesia Diagnostic microbiology and infectious disease, 39(2), 71-75 Lightner D.V., Redman C.R., Pantoja B.L., Noble L.M., Nunan, Loc Tran, 2013 Documentation of an Emerging Disease (Early Mortality Syndrome) in SE Asia & Mexico OIE Reference Laboratory for Shrimp Diseases, Department of Veterinary Science & Microbiology, School of Animal and Comparative Biomedical Sciences Ruangpan, L., & Tendencia, E A., 2004 Laboratory manual of standardized methods for antimicrobial sensitivity tests for bacteria isolated from aquatic animals and environment Southeast Asian Fisheries Development Center, Aquaculture Department Yano, Y., Hamano, K., Satomi, M., Tsutsui, I., & Aue‐umneoy, D., 2011 Diversity and characterization of oxytetracycline‐resistant bacteria associated with non‐native species, white‐leg shrimp (Litopenaeus vannamei), and native species, black tiger shrimp (Penaeus monodon), intensively cultured in Thailand Journal of applied microbiology, 110(3), 713722 Zorriehzahra, M J., & Banaederakhshan, R., 2015 Early mortality syndrome (EMS) as new emerging threat in shrimp industry Adv Anim Vet Sci, 3(2s), 64-72 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II OCCURRENCE, ANTIBIOTIC USAGE AND ANTIBIOTIC RESISTANCE OF Vibrio parahaemolyticus FROM FARMED SHRIMPS IN THE MEKONG DELTA, VIETNAM Nguyen Diem Thu1*, Le Hong Phuoc1, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Ma Tu Lan1 ABSTRACT Acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus has resulted in significant economic losses in shrimp production in Vietnam Previous studies reported that V parahaemolyticus showed multiple-antibiotic resistance due to the misuse of antibiotics to control pathogenic infections in aquaculture There is a lack of information on the use of antibiotics by shrimp farmers as well as knowledge regarding the presence of V parahaemolyticus in the Mekong Delta, Vietnam This study aimed to investigate the incidence of pathogenic Vibrio parahaemolyticus and to assess the antibiotic resistance profile as well as to perform the antimicrobial susceptibility test in V parahaemolyticus isolates in the Mekong Delta The study was carried out through a survey on the use of antibiotics in 76 grow-out shrimp farms and identification of the occurrence of AHPND pathogenic V parahaemolyticus isolates in a total of 396 shrimp, water and mud samples collected in the Mekong Delta Forty seven AHPND-causing V parahaemolyticus isolates were tested for sensitivity to 13 antibiotics The results showed that the incidence of AHPND-causing V parahaemolyticus isolates was 12.37% in the total of 396 samples Oxytetracycline, doxycycline and enrofloxacin were the most commonly used antibiotics in the shrimp farms The study showed high percentage of amoxicillin and ampicillin resistance (80.85% and 78.72%, respectively) by AHPND-causing V parahaemolyticus isolates, suggesting these two antibiotics should be excluded in the treatment of V parahaemolyticus Keywords: AHPND pathogenic Vibrio parahaemolyticus, antibiotic, antibiotic resistance, farmed shrimps Người phản biện: TS Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Ngày nhận bài: 27/6/2016 Ngày thông qua phản biện: 08/8/2016 Ngày duyệt đăng: 05/9/2016 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemics, Research Institute for Aquaculture No.2 *Email: thu_seven@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 81 ... lệ sử dụng kháng sinh tỉnh Đồng sông Cửu Long TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SƠNG CỬU LONG - SỐ - THÁNG 9/2016 77 VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.3 Hiện trạng kháng kháng sinh AHPND gây bệnh Vibrio parahaemolyticus. .. 13,74 9,92 13,43 3.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh ao nuôi tôm Kết khảo sát trang trại cho thấy 16 loại kháng sinh khác sử dụng (Hình 1) 68,9% số nơng hộ báo cáo có sử dụng kháng sinh Hơn nửa số nông... parahaemolyticus gây bệnh AHPND mẫu tôm, mẫu nước mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm; đánh giá việc sử dụng kháng sinh phịng trị bệnh cho tơm ni; việc thử kháng sinh đồ chủng V parahaemolyticus gây bệnh