Nghiên cứu này được thực hiện nhằm sàng lọc in vitro (phương pháp Khuếch tán đĩa thạch, xác định Nồng độ ức chế và diệt khuẩn tối thiểu MIC/MBC) một số cây bản địa có hoạt tính cao kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus pVPA3-1.
Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2019 THÔNG BÁO KHOA HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ THẢO DƯỢC KHÁNG Vibrio parahaemolyticus pVPA3-1 GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH TRÊN TƠM NI EVALUATION OF SOME HERBS THAT ARE RESISTANT TO Vibrio parahaemolyticus pVPA3-1 CAUSES ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE AHPND IN FARMED SHRIMP Nguyễn Thị Diễm Phương¹, Trần Phạm Vũ Linh¹, Bùi Thị Thanh Tịnh¹, Bùi Thị Mỹ Hạnh¹, Trần Thị Yến Nhi¹, Ngơ Huỳnh Phương Thảo¹ Ngày nhận bài: 28/6/2019; Ngày phản biện thông qua: 12/9/2019; Ngày duyệt đăng: 19/9/2019 TÓM TẮT Vibrio parahaemolyticus pVPA3-1 tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND tôm thẻ tôm sú, gây tỷ lệ chết cao 90 – 100% vòng tuần nhiễm bệnh Nghiên cứu thực nhằm sàng lọc in vitro (phương pháp Khuếch tán đĩa thạch, xác định Nồng độ ức chế diệt khuẩn tối thiểu MIC/MBC) số địa có hoạt tính cao kháng vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 Ngoài ra, nghiên cứu bước đầu tiến hành kiểm tra tơm (Liều gây độc LD50, độ an tồn) để từ xây dựng phương pháp đánh giá in vivo hoạt tính cao thảo dược phòng trị bệnh AHPND Nồng độ ức chế tối thiểu MIC nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC loại cao chiết V parahaemolyticus pVPA3-1 cho giá trị dao động từ 6,25 đến 12,5 mg mL-1, kết tiền đề cho đánh giá in vivo tơm Bên cạnh đó, kết ổn định từ kiểm tra liều gây chết trung bình LD50 V parahaemolyticus pVPA3-1 độ an toàn thức ăn thảo dược góp phần quan trọng cho đánh giá in vivo sau tơm thẻ Từ khóa: bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, bệnh chết sớm, cao thảo dược, V parahaemolyticus pVPA3-1, ABSTRACT Vibrio parahaemolyticus pVPA3-1 is the causative agent of Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease AHPND in both Litopenaeus vannamei and Penaeus monodon, causing a high mortality rate of 90 - 100% within about one week of infection This study aims to in vitro screening (Agar Disk Diffusion, Minimum Inhibitory and Minimum Bactericidal Concentration MIC/MBC) some indigenous plants with high antimicrobial activity against V parahaemolyticus pVPA3-1 Also, the study initially conducted tests on shrimp (LD50, the safety) to develop an in vivo assessment method Minimum Inhibition Concentration MIC and Minimum Bactericidal Concentration MBC of herbal extracts on V parahaemolyticus pVPA3-1 are ranging from 6.25 to 12.5 mg mL-1, which is a prerequisite for further in vivo assessments In addition, stable results from the Lethal Dose LD50 and the safety of herbal foods might contribute significantly to in vivo evaluation in shrimp Key words: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, Early mortality syndrome, herbal extract, V parahaemolyticus pVPA3-1 I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND xuất hai lồi tơm sú tơm thẻ, báo cáo chi tiết lần nhóm J.E Han 2015 (Mỹ), báo cáo nêu rõ xuất lần bệnh Bắc Trung Quốc ¹ Phòng Cơng nghệ Sinh học Thủy sản, Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh đảo Hainan vào năm 2009 sau Việt Nam Malaysia năm 2011 Tác nhân gây bệnh AHPND vi khuẩn V parahaemolyticus mang plasmid pVPA3-1 chứa gen gây độc PirA PirB (Jee Eun Han, Tang, Tran, & Lightner, 2015) Từ năm 2010 đến năm 2012, diện tích thiệt hại bệnh Chết sớm gây 7.068 (Bộ NN&PTNT, 2013) Theo thống TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 107 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản kê Chi cục Chăn nuôi Thú Y tỉnh Quảng Trị, nửa đầu năm 2019 tồn tỉnh Quảng Trị có 15 héc ta diện tích ao ni tơm bị nhiễm bệnh hoại tử gan tụy cấp tính Hiện dịch bệnh diễn biến phức tạp, có chiều hướng gia tăng, gây thiệt hại lớn cho người nuôi tôm Giải pháp phổ biến để phòng trị bệnh tơm sử dụng kháng sinh hay hóa chất, nhiên bộc lộ nhiều bất cập tượng kháng thuốc tồn lưu tôm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến điều trị bệnh dịch bùng phát gây hạn chế tiềm xuất Thời gian gần đây, thảo dược nghiên cứu sử dụng nhiều để phòng điều trị bệnh ni trồng thủy sản, xem thay có tiềm cao cho loại kháng sinh Xuất phát từ cấp thiết trình bày, nhóm nghiên cứu chọn lọc sử dụng số loài thảo dược địa để đánh giá hoạt tính in-vitro vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus pVPA3-1 gây hoại tử gan tụy cấp tính tơm, đồng thời tiến hành kiểm tra độ an tồn thảo dược cho tơm ăn trực tiếp nhằm xây dựng quy trình đánh giá in-vivo hoạt tính thảo dược tơm II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thu nhận thảo dược chiết cao Các thảo dược thu nhận toàn phận riêng lẻ lá, thân/ cành quả/củ Sau đó, rửa sạch, cắt nhỏ, phơi/sấy khơ bảo quản nơi khơ ráo, thống mát – Bảng Thảo dược thu cao chiết phương pháp chiết ngâm (Vongsak et al., 2013) sau: 25 g bột thảo dược ngâm với lít ethanol 70% (VNChemsol, Việt Nam) erlen dung tích lít (Duran, Đức) 72 điều kiện 28ºC, khuấy 2-3 lần/ngày Hỗn hợp ngâm sau lọc qua giấy lọc Φ2,5 µm (Whatman, Anh) để thu dịch chiết, phần cặn lại tiếp tục ngâm thu dịch chiết lần thứ hai sau loại bỏ cặn Dịch chiết cô quay chân không máy Buchi R-300 (Phoenix, Đức) với thơng số kỹ 108 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Số 3/2019 thuật sau: cô quay ethanol điều kiện vacuum start/ end 112 mbar/ 45 phút/ 150 rpm/ heating 50ºC/ chiller 10ºC cô quay nước điều kiện vacuum start/ end 46 mbar/ 30 phút/150 rpm/ heating 50ºC/ chiller 10ºC Dịch sau cô quay sấy khô tủ sấy (Memmert, Đức) từ 3-4 ngày tùy loại thảo dược Khi cao khơ hồn tồn, có khối lượng khơng đổi bảo quản tủ 4ºC Đánh giá in-vitro hoạt tính kháng vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 cao chiết 2.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch: Cao chiết thảo dược pha loãng 100 mg/mL DMSO (BioBasic, Canada) bảo quản tủ 4ºC, Doxycycline (Biobasis, Canada) pha loãng tới nồng độ 10 mg/mL nước vô khuẩn (Milli-Q IQ7000, Anh) dùng làm đối chứng dương cho thí nghiệm Vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 (bảo quản - 80ºC MDF-U55V, Panasonic, Nhật Bản) ria kích hoạt đĩa mơi trường LBagarNaCl3% (LabM, Anh) nuôi ủ tủ nuôi cấy tĩnh 28ºC (Panasonic Cooled Incubator MIR – 254, Nhật Bản) thời gian từ 1618 Một khuẩn lạc đơn sau chọn để tăng sinh khối tủ nuôi cấy lắc 28ºC (Innova 42, Canada) môi trường lỏng LBbrothNaCl3% (LabM, Anh) từ 16-18 Vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 kiểm tra PCR với cặp primer đặc hiệu AP3 F/R(336 bp):F – ATGAGTAACAATATAAAAC ATGAAAC/R'- GTGGTAATAGATTGTACAGAA (336 bp) (TY-TS, 2014) trước dùng thí nghiệm Tương tự, chủng vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922 sử dụng song song để kiểm sốt q trình thực đảm bảo độ xác cho thí nghiệm Doxycycline theo dãy nồng độ từ 30 100 µg/100 µl vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 khảo sát theo 0.5 McFarland nhằm xác định nồng độ Doxycycline mật độ V parahaemolyticus pVPA3-1 phù hợp cho thí nghiệm Thí nghiệm khảo sát in vitro hoạt tính kháng V parahaemolyticus pVPA3-1 thảo dược gồm nghiệm thức, đối chứng dương Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Doxycycline với nồng độ khảo sát thí nghiệm trước đó, đối chứng âm DMSO, nghiệm thức lại cao chiết thảo dược nồng độ 1, 5, 10 15 mg/ 100 µL Dịch vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 tăng sinh qua đêm trải đĩa môi trường MHANACl3% (Merck, Đức) que tăm tiệt trùng Sau đó, giếng chứa thảo dược (gồm giếng/đĩa) tạo đĩa thạch dụng cụ đục lỗ tiệt trùng Dịch cao chiết mẫu thảo dược nồng độ khảo sát, kháng sinh Doxycycline DMSO (100 µL/giếng) bổ sung vào giếng Đĩa ủ điều kiện nhiệt độ 28ºC Đường kính vòng kháng khuẩn thảo dược nồng độ vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA31được so sánh với nghiệm thức Doxycycline DMSO để đánh giá hoạt tính thảo dược (CLSI M100, 2017) 2.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn thảo dược phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal inhibitory concentration MIC) nồng độ thấp dịch thảo dược ức chế phát triển vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 (>80%) – nghĩa không làm đổi màu thuốc thử Resazurin, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimal bactericidal concentration MBC) nồng độ thấp dịch thảo dược mà vi khuẩn bị tiêu diệt hoàn toàn (100%) MIC MBC kiểm tra theo phương pháp pha loãng bậc cao chiết đĩa 96 giếng (Costar 3596, Corning, Mỹ) (My Ngan, Linh, Quy, & Thanh Ho, 2016; CLSI M45, 2016) Dịch vi khuẩn cao chiết thảo dược chuẩn bị tương tự thí nghiệm khảo sát hoạt tính thảo dược đĩa thạch Bao gồm nghiệm thức: đối chứng dương Doxycycline, đối chứng âm DMSO, nước vô khuẩn, nghiệm thức cao thảo dược (nồng độ 100 mg/ mL) Chủng E coli ATCC 25922 (chủng đối chứng, control strain) sử dụng song song để kiểm sốt tính ổn định độ xác thí nghiệm Thí nghiệm thực sau, môi Số 3/2019 trường MHBNaCl1% (Merck, Đức) bổ sung 100 µL vào giếng đĩa 96 giếng pipet kênh (Eppendorf, Đức), sau loại cao thảo dược/kháng sinh Doxycycline/ DMSO/nước vơ khuẩn thêm 100 µL loại vào giếng khác nhau, giếng pha loãng bậc cách trộn chuyển 100 uL hỗn hợp sang cột bên cạnh Quy trình pha lỗng bậc lặp lại giếng thứ mười hai hàng, 100 µL dịch sau trộn giếng cuối hút bỏ Dịch vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 (OD600nm 0,5) bổ sung 100 µL vào giếng ủ điều kiện nhiệt độ 28ºC từ 16 đến 18 Thuốc thử Resazurin 0,01% (Sigma, Đức) bổ sung 40 µL vào tất giếng để đánh giá tỷ lệ sống vi khuẩn (màu xanh chuyển sang màu hồng nghĩa có tồn vi khuẩn) giếng Để xác định giá trị MBC, 100 µL mẫu giếng khơng làm đổi màu thuốc thử trải LBagarNaCl3% (LabM, Anh), sau tiếp tục ủ điều kiện nhiệt độ 28ºC Sự xuất hay không vi khuẩn đĩa thạch quan sát để xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu thảo dược (CLSI M45, 2016) Đánh giá độ an toàn thức ăn chứa thảo dược Thử nghiệm tiến hành nhằm chọn tỷ lệ trộn phù hợp từ đánh giá độ an tồn thức ăn tơm phương pháp cho ăn Thức ăn chứa thảo dược chuẩn bị cách trộn thảo dược vào thức ăn công nghiệp (UniPresident, Việt Nam) đĩa thủy tinh, thảo dược dược dùng dạng lỏng nhằm giúp hấp thụ dễ dàng vào thức ăn (Balasubramanian cs, năm 2008) Nồng độ cuối cao thảo dược thức ăn giữ cố định 1,5×10-3 Kg/ Kg thức ăn, thí nghiệm gồm nghiệm thức tương ứng với tỷ lệ phối trộn 1:2.000, 1:4.000, 1:5.000 1:10.000 Thức ăn trộn thảo dược để nhiệt độ phòng 15 phút phủ bên lớp dầu gan mực (4%) nhằm giữ cố định thảo dược thức ăn, tránh bị thấm ngược môi trường nước nuôi cho tơm ăn, sau để khơ nơi thống mát (26-27ºC) Quan sát TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 109 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2019 đánh giá độ kết dính độ bền thử đánh giá độ an toàn thức ăn thảo dược tay thức ăn thảo dược để chọn tỷ lệ phối III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO trộn tốt LUẬN Thử nghiệm độ an toàn thức ăn Thu nhận thảo dược chiết cao tơm bố trí gồm nghiệm thức đối chứng Thảo dược gồm nhóm chia theo phận âm nghiệm thức thức ăn thảo dược (theo tỷ thu nhận: nhóm Lá, nhóm Thân/ lệ phối trộn thu trước đó) Thức ăn thảo cành, nhóm Quả/ hạt nhóm Củ/ rễ - Bảng dược dùng cho tôm ăn liên tục 14 Các phận cần thiết nhóm ngày với liều lượng 5-7% trọng lượng tôm, thu thập, rửa phơi khô, bảo quản nơi nghiệm thức gồm 10 tôm lặp lại khơ thống mát phòng CNSH Thủy sản, lần, theo dõi đánh giá tỷ lệ sống suốt Trung tâm Cơng nghệ Sinh học Tp Hồ Chí thời gian thử nghiệm Dựa kết theo dõi Minh lượng thức ăn tiêu thụ tỷ lệ sống tơm để Bảng Danh sách lồi thảo dược thu thập cao chiết thu nhận Nhóm Lá Thân/cành Quả/hạt Củ/rễ Tên cây/Nguồn tham khảo Thu cao chiết tổng số (g/cây) Bàng (Huỳnh Kim Diệu et al., 2010) Chùm ngây (Ali et al., 2004) Cọc trắng (D’Souza et al., 2010) Dà quánh (Chandrasekaran et al., 2009) Dà vôi (ASudheer et al., 2012) Đưng (Gurudeeban et al., 2015) Đước (S.H.Lim et al., 2011) Lốt (Zaidan et al., 2005) Mấm đen (Gnanadesigan et al., 2012) 10 Mấm trắng (Gnanadesigan et al., 2012) 11 Ơ rơ hoa tím (Huyền, Huy, & Hoa, 2018) 12 Ổi Manikandan & Anand, 2015) 13 Trầu không (An et al., 2016) 14 Cỏ đuôi gà (Balasubramanian et al., 2007) 15 Cỏ mực (Karthikumar et al., 2007) 16 Cỏ sữa (Tai Nang & Quyen, 2015) 17 Hẹ (Kim Dieu & Tuyet, 2014) 18 Bìm bịp (Yang et al., 2013) 19 Cà gai leo 20 Diệp hạ châu (Eldeen et al., 2011) 21 Hương nhu tím (Małgorzata Nabrdalik et al., 2016) 22 Xuyên tâm liên (Roy et al., 2010) 23 Chanh (Pathan et al., 2012) 24 Mướp đắng (Ozusaglam et al., 2013) 25 Sim (Saising & Voravuthikunchai, 2012) 26 Thầu dầu (Huyền et al., 2018) 27 Bạch (Le et al., 2012) 28 Cà gai leo (Nguyen & Eun, 2013) 29 Gừng (Dhanik et al., 2017) 30 Rẻ quạt (Woźniak& Matkowski, 2011) 31 Riềng (Tam et al., 2018) 32 Tỏi (Benkeblia, 2004) 110 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 4,5 4,5 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 3/2019 Đánh giá in-vitro hoạt tính kháng vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 cao chiết 2.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kiểm tra hoạt tính Doxycycline 30 ug chủng E coli ATCC25922 cho kết với Tiêu chuẩn M100S, đường kính vòng kháng khuẩn 17±1 mm (lớn 14 mm) với dãy nồng độ kháng sinh tăng dần cho kết đường kính vòng tròn kháng khuẩn tương ứng tăng dần Vậy, từ kết kiểm tra E coli ATCC 25922 thấy thí nghiệm bố trí hợp lý kết kiểm tra đáng tin cậy (CLSI M100, 2017) Hai chủng vi khuẩn V parahaemolyticus V parahaemolyticus pVPA3-1 phân lập vào 2016, định danh đánh giá độc lực hoại tử gan tụy cấp tính tơm (chủng V parahaemolyticus chủng diện nhiều mẫu thủy hải sản, thực phẩm khơng có khả gây bệnh chết sớm, V parahaemolyticus pVPA3-1 chủng gây bệnh chết sớm tôm) (Diem Phuong et al., 2019.) Bên cạnh đó, kết thu cho thấy chủng V parahaemolyticus pVPA3-1 pha loãng tới 4,5 ×107 cho kết vòng kháng khuẩn rõ, dễ quan sát ổn định liểu Doxycycline 100 µg - Φ ≥14 mm Như vậy, liểu Doxycycline 100 µg mật độ vi khuẩn pha lỗng tới 4,5 ×107 CFU/mL chọn sử dụng đánh giá hoạt tính invitro thảo dược Trong số nghiên cứu gần đây, Doxycycline 30 µg tạo vòng kháng khuẩn 23 – 24 mm kiểm tra vi khuẩn V parahaemolyticus gây AHPND tôm (Lua et al., 2015a; Lua et al., 2015b), hoàn toàn khác với kết thu chủng V parahaemolyticus pVPA3-1 (≥ 11 ± mm) lại tương đồng với chủng V parahaemolyticus (≥ 27 ± 1) mà thu Sự biến đổi phức tạp vi khuẩn gây hoại tử gan tụy cấp tính AHPND tôm đề cập nhiều nghiên cứu gần giải thích phần lý khác kết kiểm tra mà gặp phải (Han et al., 2017) Thông qua kiểm tra độ nhạy V parahaemolyticus pVPA3-1 Doxycycline, chúng tơi thu nhận kết tính nhạy vi khuẩn phân lập từ tôm bệnh chết sớm Đặc tính phần làm giảm tác dụng kháng sinh hay hợp chất khác từ thảo dược lên vi khuẩn Bảng trình bày chi tiết mẫu thảo dược cho hoạt tính kháng tốt V parahaemolyticus pVPA3-1 liều 10 mg, cho đường kính vòng kháng khuẩn ≥14 mm Vì vậy, 21 loại cao thảo dược tiếp tục kiểm tra nồng độ ức chế tối thiểu MIC nồng Bảng Bảng tổng hợp kết khảo sát in-vitro hoạt tính cao thảo dược phương pháp khuếch tán đĩa thạch Nhóm Lá Doxycycline 100 µg Cao chiết 10 mg DMSO Bàng 14,0±0,0 22,3±0,9 8,0±0,0 Cọc trắng 16,3±0,9 19,0±3,6 8,0±0,0 Dà quánh 15,7±1,1 14,7±0,9 8,0±0,0 Đưng 14,7±2,2 17,3±1,8 8,0±0,0 Đước 16,3±0,9 16,0±0,7 8,0±0,0 Mấm đen 14,0±0,7 14,7±1,6 8,0±0,0 Mấm trắng 15,3±1,6 18,0±1,3 8,0±0,0 Ơ rơ hoa tím 14,3±1,8 21,0±2,7 8,0±0,0 Ổi 14,7±0,3 14,5±0,3 8,0±0,0 10 Trầu khơng 13,7±0,4 20,0±0,7 8,0±0,0 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 111 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Nhóm Thân/cành Quả/hạt Củ/rễ Số 3/2019 Doxycycline 100 µg Cao chiết 10 mg DMSO 11 Cỏ sữa 15,0±0,0 17,7±0,4 8,0±0,0 12 Cỏ mực 15,0±0,0 16,0±0,0 8,0±0,0 13 Hẹ 14,7±1,1 17,7±0,4 8,0±0,0 14 Diệp hạ châu 13,3±0,4 16,7±0,4 8,0±0,0 15 Xuyên tâm liên 14,3±1,8 17,0±0,0 8,0±0,0 16 Chanh 15,7±2,2 18,0±1,3 8,0±0,0 17 Mướp đắng 14,7±1,1 17,7±0,4 8,0±0,0 18 Sim 13,0±0,7 15,0±0,0 8,0±0,0 19 Bạch 16,7±0,4 16,7±0,1 8,0±0,0 20 Rẻ quạt 13,7±0,4 14,3±2,4 8,0±0,0 21 Riềng 16,0±0,0 28,7±0,4 8,0±0,0 độ diệt khuẩn tối thiểu MBC III.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC Kiểm tra MIC Doxycycline E coli ATCC 25922 cho kết 1.5625 µg mL-1, nằm khoảng 0,5 – ug/mL; DMSO ức chế vi khuẩn tỷ lệ thể tích với vi khuẩn 1:4, nước vơ khuẩn khơng tác động đến khả sống vi khuẩn Các kết cho thấy bố trí thí nghiệm thao tác thực thí nghiệm xác định MIC đáng tin cậy (CLSI M100, 2017) Giá trị MIC Doxycycline V parahaemolyticus pVPA3-1 7,8125 ug mL-1, MIC nước vơ khuẩn DMSO hồn tồn giống với E coli ATCC25922 Theo CLSI M45, nhóm vi khuẩn Vibrio spp có tiêu chuẩn giá trị MIC Doxycycline sau: ≤ ug mL-1 – nhạy, ug mL-1 – trung bình, ≥16 ug mL-1 – kháng, với kết kiểm tra khuếch tán đĩa thạch cho thấy V parahaemolyticus pVPA3-1 có tính nhạy trung bình với kháng sinh Doxycycline Điều giải thích cho việc cần tăng liều Doxycycline kiểm tra khuếch tán đĩa thạch, đồng thời mật độ tế phải giảm (trong hai chủng V parahaemolyticus E coli ATCC25922 không cần phải điều chỉnh) để quan sát vòng kháng khuẩn (CLSI M45, 2016) V parahaemolyticus pVPA3-1 chủng 112 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG vi khuẩn xuất plasmid pVPA3-1 tế bào, làm cho vi khuẩn từ loài gây ngộ độc thực phẩm thơng thường trở thành vi khuẩn có độc tố gây hoại tử gan tụy cấp tôm sú tôm thẻ Có thể lý khác tính nhạy với Doxycycline chủng vi khuẩn với V parahaemolyticus thông thường Đối với kiểm tra MIC cao thảo dược, việc quan sát đổi màu thuốc thử khó thảo dược có màu đặc trưng riêng, việc kiểm tra MIC đòi hỏi lặp lại nhiều lần đối chứng với kết kiểm tra MBC – Bảng Giá trị MIC/ MBC loại thảo dược cho kết tốt dao động từ 6,25 đến 12,5 mg mL-1 Củ riềng thể khả ức chết diệt vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 mạnh khảo sát, MIC MBC cho giá trị 6,25 mg mL-1 Năm 2006, nghiên cứu nhóm Oonmettaaree phát riềng có hoạt tính ức chế vi khuẩn Staphylococcus aureus với MIC 0.325 mg mL-1 MBC 1.3 mg mL-1 Thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu khác chứng minh riềng có nhiều hoạt tính q khác kháng nấm, tăng cường hệ miễn dịch… Trong công bố gần Chaweepack cs (2015), riềng có MIC MBC V parahaemolyticus gây bệnh chết sớm 2,5 mg mL-1, kết tương đồng với kết mà chúng tơi thu Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2019 Bảng Bảng kết đánh giá nồng độ ức chế tối thiểu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu loại thảo dược V parahaemolyticus pVPA3-1 Nhóm Lá Thân/ cành Quả/ hạt Củ/ rễ MIC mg mL-1 MBC mg mL-1 Trầu không 6,25 12,5 Diệp hạ châu 6,25 12,5 Chanh 6,25 12,5 Sim 12,5 12,5 Bạch 6,25 12,5 Riềng 6,25 Doxycycline 6,25 7,8125 µg mL -1 62,5 µg mL-1 nhiên có độ xốp định; tỷ lệ 1:5.000 (1 Như thảo luận trước khác mL: 5.000 mg) – thức ăn khơng bị vón cục, đường kính vòng kháng khuẩn xốp ổn định vò nhẹ tay; liều Doxycyclin 30 ug chủng V tỷ lệ 1:10.000 (0,5 mL: 5.000 mg) – thảo dược parahaeolyticus khác (cùng gây bệnh khơng thấm vào thức ăn (thể tích thảo dược hoại tử gan tụy cấp tính tơm), biến đổi khơng đủ) Nhìn chung, tỷ lệ 1:5.000 chọn đa dạng vi khuẩn gây bệnh có để tiếp tục thực thử nghiệm đánh giá dộ an thể nguyên nhân dẫn đến khác giá toàn thức ăn thảo dược tôm trị MIC/MBC riềng mà ghi nhận Theo dõi tỷ lệ sống tôm thử nghiệm (Oonmetta-aree et al., 2006; Chaweepack, đánh giá độ an tồn thức ăn thảo dược có kết Muenthaisong, Chaweepack, & Kamei, 2015) sau – Bảng 4: đối chứng âm – tỷ lệ sống Đánh giá độ an toàn thức ăn chứa thảo 96,67 %; nghiệm thức thức ăn trộn với cao hạt dược sim - tỷ lệ sống 93,33 %; nghiệm thức thức ăn Kết đánh giá độ kết dính độ bền trộn cao củ bạch - tỷ lệ sống 93,33 % Do đó, khảo sát tỷ lệ trộn thảo dược với thức ăn kết bước đầu đánh giá độ an toàn cho sau: tỷ lệ 1:2.000 (2,5 mL:5.000 mg) – dịch thảo thấy thức ăn thảo dược có khả cao đem dược bị đọng lại khay sau trộn với thức lại hiệu sử dụng xây dựng phương ăn, thức ăn sau áo dầu mực bị vón cục dễ thay pháp đánh giá in-vivo tơm ni đổi hình dáng; tỷ lệ 1:4.000 (1,25 mL: 5.000 mg) - thức ăn tượng vón cục, Bảng Kết đánh giá độ an toàn thức ăn thảo dược tôm thẻ chân trắng Tỷ lệ sống (%) Cao hạt sim Cao củ bạch Đối chứng âm 93.335.77 93.3311.54 96.675.77a a a Ghi chú: P = 0.8503; Giá trị ± độ lệch chuẩn; N = 30 tôm/nghiệm thức IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thu 32 mẫu cao chiết thảo dược đánh giá hoạt tính in-vitro vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm (V parahaemolyticus pVPA3-1), kết thu phương pháp khuếch tán đĩa thạch (21 mẫu có hoạt tính mạnh) xác định nồng độ ức chế/diệt khuẩn tối thiểu MIC/MBC (kết từ 6,25-12,5 mg mL-1) cho thấy thu nhận lồi thảo dược có hoạt tính ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus pVPA3-1 tốt Tỷ lệ trộn thảo dược vào thức ăn khảo sát thu kết tỷ lệ 1:5.000 phù hợp, độ an toàn thức ăn thảo dược đánh giá tôm thẻ cho thấy tôm thẻ tiêu thụ thức ăn phát triển bình thường thời gian 14 ngày Như vậy, kết sở quan trọng cho thử nghiệm để đánh giá hoạt tính in-vivo thảo dược phòng điều trị bệnh chết sớm cho tơm ni TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 113 Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản Số 3/2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cục Thú Y Tiêu chuẩn sở 02- 2014/TY-TS (2014) Tiêu chuẩn sở xét nghiệm phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm kỹ thuật PCR Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà, Nguyễn Thanh Hải (2015) Tác dụng diệt khuẩn dịch chiết sim hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tơm ni nước lợ Tạp Chí Khoa Học Phát Triển 2015, 13(7), 1101–1108 Đặng Thị Lụa, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Hải Hà, Trương Thị Mỹ Hạnh, Phan Thị Vân (2015) Tác dụng diệt khuẩn in-vitro dịch chiết trầu không (Piper betle L.) dịch chiết ổi (Psidium guajava) vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm nuôi nước lợ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn, kỳ 1, 92–97 Hồng Mộng Huyền, Võ Tấn Huy, Trần Thị Tuyết Hoa (2018) Hoạt tính kháng khuẩn số cao chiết thảo dược kháng vi khuẩn gây bệnh tơm ni Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, tập 54, số chuyên đề Thủy sản (2018)2, 143-150 Lương Thị Mỹ Ngân, Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Ngọc Quý, Phạm Thị Ngọc Huyền, Trương Thị Huỳnh Hoa, Trần Trung hiếu, Phạm Thành Hồ (2016) Nghiên cứu hoạt tính kháng Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae cao chiết dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis L.) Tạp chí Phát Triền Khoa học Cơng nghệ, tập 19(15), 84 – 94 6.Nguyễn Thị Diễm Phương, Võ Nguyễn Thanh Thảo, Trần Thị Thanh Hương, Ngô Huỳnh Phương Thảo, Nguyễn Quốc Bình (2019) Nghiên cứu tạo KIT LAMP phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy AHPND/ hay bệnh chết sớm EMS tôm Đề tài nghiên cứu cấp sở, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Văn Thanh (2016) Nghiên cứu tác dụng ức chế in vitro cao khô dịch chiết dược liệu vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus app E coli phân lập từ dịch viêm tử cung chó thử nghiệm điều trị Khoa Học Kỹ Thuật Thú Y, XXIII(4), 26–36 Nguyễn Tài Năng, Nguyễn Thị Quyên (2015) Nghiên cứu sử dụng thảo dược thay kháng sinh bổ sung thức ăn chăn nuôi Khoa Học Công Nghệ Đổi Mới, 10, 23–24 Nguyễn Khoa (2018) Đối tượng Thủy sản nuôi chủ lực Trang thông tin điện tử Tổng cục Thủy sản trang web https://www.fistenet.gov.vn/nuôi-trồng-thủy-sản/-nuôi-thủy-sản/doc-tin/011938/2018-12-18/doi-tuong-thuy-sannuoi-chu-luc Tiếng Anh 10 Chaweepack, T., Muenthaisong, B., Chaweepack, S., & Kamei, K (2015) The potential of galangal (Alpinia galanga Linn.) extract against the pathogens that cause white feces syndrome and acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) International Journal of Biology, 7(3), 8–17 11 Clinical Laboratory Standar Institute (2017) M100 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing 12 Clinical Laboratory Standar Institute (2016) M 45 Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria - 3rd edition 13 Han, J E., Tang, K F J., & Lightner, D V (2015) Genotyping of virulence plasmid from Vibrio parahaemolyticus isolates causing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp Diseases of Aquatic Organisms 14 Nguyen, Q V., & Eun, J.-B (2013) Antimicrobial activity of some Vietnamese medicinal plants extracts Journal of Medicinal Plants Research, 7(35), 2597–2605 15 Oonmetta-aree, J., Suzuki, T., Gasaluck, P., & Eumkeb, G (2006) Antimicrobial properties and action of galangal (Alpinia galanga Linn.) on Staphylococcus aureus LWT - Food Science and Technology, 39(10), 1214–1220 16 Vongsak, B., Sithisarn, P., Mangmool, S., Thongpraditchote, S., Wongkrajang, Y., & Gritsanapan, W (2013) Maximizing total phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method Industrial Crops and Products, 44(January 2013), 566–571 17 Zaidan, M R S., Rain, N., Badrul, A R., Adlin, A., & Zakiah, & (2005) In vitro screening of five local medicinal plants for antibacterial activity using disc diffusion method Tropical Biomedicine (Vol 22) 114 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ... Xuất phát từ cấp thiết trình bày, nhóm nghiên cứu chọn lọc sử dụng số loài thảo dược địa để đánh giá hoạt tính in-vitro vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus pVPA3-1 gây hoại tử gan tụy cấp tính tơm,... N = 30 tôm/ nghiệm thức IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thu 32 mẫu cao chiết thảo dược đánh giá hoạt tính in-vitro vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm (V parahaemolyticus pVPA3-1) ,... gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm ni nước lợ Nơng Nghiệp Phát Triển Nông Thôn, kỳ 1, 92–97 Hồng Mộng Huyền, Võ Tấn Huy, Trần Thị Tuyết Hoa (2018) Hoạt tính kháng khuẩn số cao chiết thảo dược